CN111235294A - 一种用于筛选优质西藏棕色蘑菇的dna条形码、引物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于筛选优质西藏棕色蘑菇的DNA条形码、引物及其应用。所述用于筛选优质西藏棕色蘑菇的DNA条形码，包含核苷酸序列如SEQ ID NO：1～17所示的17个DNA片段中的一个或多个；用于筛选优质西藏棕色蘑菇的DNA条形码扩增引物，包含上下游核苷酸序列分别如SEQ ID NO：18～51所示的17对引物中的一对或多对。本发明与传统育种方法及其他现有DNA条形码技术相比较，它具有省时、省力、省钱、准确、高效的优点，在优质西藏棕色蘑菇的遗传育种上发挥积极作用，同时也为种质资源的鉴定及保护提供了一种有效方法。

Description

一种用于筛选优质西藏棕色蘑菇的DNA条形码、引物及其应用

技术领域

本发明涉及食用菌种质资源筛选技术领域，更具体地，涉及一种用于筛选优质西藏棕色蘑菇的DNA条形码、引物及其应用。

背景技术

西藏棕色蘑菇，属于双孢菇的一种，色泽呈浅褐色介于褐色双孢菇(褐菇)和白色双孢菇之间。白色双孢菇容易褐变影响品质，褐色双孢菇不易褐变且蛋白含量高。引起褐变的主要因素是双孢菇中的多酚氧化酶活性，活性越高越容易褐变，西藏棕色蘑菇是一种不易褐变且兼具白色双孢菇和褐色双孢菇的优良品质。评价双孢菇等食用菌优质品种的主要指标包括：总蛋白、总可溶性蛋白、总水解氨基酸、总多糖和总多酚含量高，抗氧化活性强，多酚氧化酶活性低。按传统方法，通过采集野生样本驯化后大田栽培，挑选个体饱满无病害的子实体分离菌丝保存菌种，同时逐个子实体测定上述指标，挑选出优质个体对应菌种进行栽培才能获得优质品种，这样一来筛选周期长效率低。野生样本量少无法完成上述指标测定，必须经过菌丝分离保存菌种进行大田栽培获得足够数量个体才能测定上述指标。此外，对于不具优质指标的野生样本，后期的驯化及大田栽培等工作就会造成浪费。

为了实现西藏棕色蘑菇的开发利用，筛选优质西藏棕色蘑菇品种显得尤为重要和迫切。以往对西藏棕色蘑菇的选育主要利用形态学方法结合上述有益指标测定进行，但是受到特殊的青藏高气候原环境的影响不同地区所产的西藏棕色蘑菇常常出现同名异物和同物异名的现象，因此形态学鉴别法难以有效区分。更为困难的是，不能通过形态学方法筛选出总蛋白、总可溶性蛋白、总水解氨基酸、总多糖和总多酚含量高，抗氧化活性强，多酚氧化酶活性低的优质品种。DNA条形码分子鉴定技术是基于DNA条形码(基因组中保守且稳定遗传DNA序列)来进行物种和优良品质识别鉴定的分子生物学技术。它是传统育种方法的有效补充和拓展，能够在样品形态不完整或缺乏形态结构(加工制品如粉末等)时对样品进行精准和有效地鉴定。现有的DNA条形码技术中以核糖体中的ITS(核糖体RNA内转录间隔区)和线粒体体中的非编码区或保守基因序列已经用作DNA条形码序列。主要是针对少数基因或片段进行物鉴定导致信息量小鉴别效果差，而且不能用于优良品质特征鉴别筛选。现有的DNA条形码技术中限制性片段长度多态性(restriction fragment lengthpolymorphism，RFLP)操作步骤繁琐复杂，同时要用到放射性同位素标记物或致癌性显影标记物，基因组模版用量大，带型少信息量小，同时容易受到基因突变影响而导致结果不稳定。现有的DNA条形码技术中随机扩增多态性DNA(random amplified polymorphic DNA，RAPD)易受干扰，对操作人员技术水平及稳定性重复性要求较高，此外，样品基因组模板的质量和浓度，引物长度及序列，PCR循环次数，基因组DNA的复杂性，技术设备等都可能导致RAPD技术重复性差。现有的DNA条形码技术中单核苷酸多态性(single nucleotidepolymorphism，SNP)技术依赖于SNP芯片或质谱及测序技术，对设备要求高，价格昂贵，成本高。因此针对传统育种方法选育西藏棕色蘑菇品种不够准确费时费力的缺点，有必要提供一种可以准确、快捷鉴别西藏棕色蘑菇的所属品种，同时实现优质品质选育的DNA条形码技术，同时针对现有DNA条形码技术的缺陷，提供成本低，效率高，操作简便，结果稳定可靠性重复性好的检测方法。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种用于筛选优质西藏棕色蘑菇的DNA条形码。

本发明的另一目的在于提供一种用于筛选优质西藏棕色蘑菇的DNA条形码扩增引物。

本发明的再一目的在于提供所述DNA条形码和扩增引物的应用。

本发明的再一目的在于提供一种筛选优质西藏棕色蘑菇品种的方法。

本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：

用于筛选优质西藏棕色蘑菇的DNA条形码，包含核苷酸序列如SEQ ID NO：1～17所示的17个DNA片段中的一个或多个。

本发明基于西藏棕色蘑菇全基因组中所有简单重复序列(simple sequencerepeat，SSR)筛选出既能鉴定物种，又能与总蛋白、总可溶性蛋白、总水解氨基酸、总多糖和总多酚含量高，抗氧化活性强，多酚氧化酶活性低优良品质相关的上述17个DNA条形码，可用于辅助选育具有总蛋白、总可溶性蛋白、总水解氨基酸、总多糖和总多酚含量高，抗氧化活性强，多酚氧化酶活性低优良品质的西藏棕色蘑菇品种。其中，用于筛选总蛋白和总可溶性蛋白含量指标的DNA条形码，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1～3所示；用于筛选总水解氨基酸含量指标的DNA条形码，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO：4～5所示；用于筛选总多糖含量指标的DNA条形码，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO：6～8所示；用于筛选总多酚含量指标的DNA条形码，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO：9～11所示；用于筛选抗氧化活性指标的DNA条形码，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO：12～14所示；用于筛选多酚氧化酶活性指标的DNA条形码，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO：15～17所示。本发明针对西藏棕色蘑菇品种的每一种筛选性状都分别提供了2～3个DNA条形码，当只选择其中一个DNA条形码作为靶序列进行检测时，即可挑选出性状优良的西藏棕色蘑菇品种，而当同时选择所有DNA条形码作为靶序列时，则可大大提高该优良性状品种的筛选准确率和效率。

本发明的上述性状指标对应的DNA条形码可以根据实际的筛选需求，相互之间组合使用。例如当只需要筛选某一性状优良的西藏棕色蘑菇品种，如当需要筛选总蛋白和总可溶性蛋白含量高、总水解氨基酸含量高、总多糖含量高、总多酚含量高、抗氧化活性强或多酚氧化酶活性低的西藏棕色蘑菇品种时，分别选择上述筛选指标对应的DNA条形码作为靶序列进行检测。而当需要同时筛选两种或两种性状优良的西藏棕色蘑菇品种时，则根据实际的需求将性状指标对应的DNA条形码相互之间组合使用即可。当上述17个DNA条形码共同作为筛选的靶序列时，可获得筛选准确率最高的总蛋白、总可溶性蛋白、总水解氨基酸、总多糖和总多酚含量高，抗氧化活性强，多酚氧化酶活性低的西藏棕色蘑菇品种。

优选地，一组用于筛选总蛋白、总可溶性蛋白、总水解氨基酸、总多糖和总多酚含量高，抗氧化活性强，多酚氧化酶活性低的西藏棕色蘑菇品种的DNA条形码，共包含17个DNA片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1～17所示。

用于筛选优质西藏棕色蘑菇的DNA条形码扩增引物，包含上下游核苷酸序列分别如SEQ ID NO：18～51所示的17对引物中的一对或多对。其中，用于筛选总蛋白和总可溶性蛋白含量指标的DNA条形码扩增引物，包含3对引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO：18～23所示；用于筛选总水解氨基酸含量指标的DNA条形码扩增引物，包含2对引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO：24～27所示；用于筛选总多糖含量指标的DNA条形码的DNA条形码扩增引物，包含3对引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO：28～33所示；用于筛选总多酚含量指标的DNA条形码的DNA条形码扩增引物，包含3对引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO：34～39所示；用于筛选抗氧化活性指标的DNA条形码的DNA条形码扩增引物，包含3对引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO：40～45所示；用于筛选多酚氧化酶活性指标的DNA条形码的DNA条形码扩增引物，包含3对引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO：46～51所示。

本发明以上述17个DNA条形码为靶序列，依据西藏棕色蘑菇全基因组中所有简单重复序列(simple sequence repeat，SSR)位点分析筛选并设计了17对引物，利用这17对引物对样品基因组进行扩增所得片段多态性可辅助选育具有总蛋白、总可溶性蛋白、总水解氨基酸、总多糖和总多酚含量高，抗氧化活性强，多酚氧化酶活性低优良品质的棕色蘑菇。通过PCR扩增后电泳检测即可达到辅助育种的效果。所述17对DNA条形码扩增引物如上DNA条形码所述，可根据实际的性状筛选需求，在需要筛选的性状指标中包含的2～3对引物中选择一对进行使用，或者共同使用以提高该优良性状品种的筛选准确率和效率。当上述17对DNA条形码扩增引物共同作为检测引物时，可获得筛选准确率最高的总蛋白、总可溶性蛋白、总水解氨基酸、总多糖和总多酚含量高，抗氧化活性强，多酚氧化酶活性低的西藏棕色蘑菇品种。

优选地，一组用于筛选总蛋白、总可溶性蛋白、总水解氨基酸、总多糖和总多酚含量高，抗氧化活性强，多酚氧化酶活性低的西藏棕色蘑菇品种的DNA条形码扩增引物，共包含17对扩增引物，其引物的上下游核苷酸序列分别依次如SEQ ID NO：18～51所示。优质双孢蘑菇As2796总蛋白平均含量260毫克每克，可溶性总蛋白平均含量80毫克每克，总水解氨基酸平均含量160毫克每克，总多糖平均含量70毫克每克，总多酚平均含量10毫克每克，ABTS自由基平均清除率70％，多酚氧化酶活性4420单位每克。利用本发明上述引物可以筛选得到性各项指标均优于上述双孢蘑菇As2796的西藏棕色蘑菇样品。

本发明还提供上述DNA条形码或DNA条形码扩增引物在筛选或辅助选育优质西藏棕色蘑菇品种中的应用。

一种筛选优质西藏棕色蘑菇品种的方法，包括如下步骤：

S1.提取待测样品基因组DNA；

S2.以S1基因组DNA为模板，根据性状筛选需求，选择上述DNA条形码的扩增引物中的一对或多对分别进行PCR扩增反应；

S3.将S2的PCR扩增产物经毛细管荧光电泳检测，通过扩增产物的片段数、SSR位点数、SSR重复元件及其重复次数进行判定。

例如，当需要筛选出总蛋白和总可溶性蛋白含量高的西藏棕色蘑菇品种，通在步骤S2使用SEQ ID NO：18～23所示3对引物中的至少一对进行PCR扩增反应检测；当需要筛选出总蛋白和总可溶性蛋白含量高、总水解氨基酸含量高的西藏棕色蘑菇品种，则在步骤S2使用SEQ ID NO：18～23所示3对引物中的至少一对，SEQ ID NO：24～27所示2对引物中的至少一对分别进行PCR扩增反应检测。

优选地，步骤S2所述PCR扩增反应的体系为2×Taq PCR Master Mix 5μL，模板1μL，上游引物0.1μL，下游引物0.4μL，浓度10μM带荧光的M13引物0.4μL，用无菌的去离子水定容至10μL。

优选地，步骤S2所述PCR扩增反应的程序为95℃预变性3min；95℃变性30s，62至55℃降落PCR退火30s，72℃延伸30s，共10个循环；95℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，共25个循环；72℃终延伸20min；4℃保温6h。

具体地，当步骤S2中需要筛选总蛋白和总可溶性蛋白含量高的西藏棕色蘑菇品种时，可分别使用SEQ ID NO：18～23所示3对引物分别进行PCR扩增反应，将PCR扩增产物经毛细管电泳检测。检测判断：通过引物扩增片段中的SSR位点和SSR重复元件进行判断。当使用引物1.1进行片段扩增时，若扩增得到两个片段(两个峰)，含有2个SSR位点，SSR重复元件为AG，且一个扩增片段有5次重复AG，另一片段有6次重复AG，则判断待测样品为总蛋白和总可溶性蛋白含量高的西藏棕色蘑菇；当使用引物1.2进行片段扩增时，若扩增得到两个片段(两个峰)，含有2个SSR位点，SSR重复元件为CA，且一个扩增片段有6次重复CA，另一片段有7次重复CA，则判断待测样品为总蛋白和总可溶性蛋白含量高的西藏棕色蘑菇；当使用引物1.3进行片段扩增时，若扩增得到一个片段(一个峰)，含有1个SSR位点，SSR重复元件为AC，且扩增片段有5次重复AC，则判断待测样品为总蛋白和总可溶性蛋白含量高的西藏棕色蘑菇。当同时分别使用上述引物1.1、1.2、1.3进行综合检测判断时，准确性最好。

具体地，当步骤S2中需要筛选总水解氨基酸含量高的西藏棕色蘑菇品种时，可分别使用SEQ ID NO：24～27所示2对引物分别进行PCR扩增反应，将PCR扩增产物经毛细管电泳检测。当检测判断：通过引物扩增片段中的SSR位点和SSR重复元件进行判断。当使用引物2.1进行片段扩增时，若扩增得到一个片段(一个峰)，含有1个SSR位点，SSR重复元件为AT，且扩增片段有11次重复AT，则判断待测样品为总水解氨基酸含量高的西藏棕色蘑菇；当使用引物2.2进行片段扩增时，扩增得到1个片段(1个峰)，含有1个SSR位点，SSR重复元件为AT，且扩增片段有5次重复AT，则判断待测样品为总水解氨基酸含量高的西藏棕色蘑菇。当同时分别使用上述引物1.1、1.2进行综合检测判断时，准确性最好。

具体地，当步骤S2中需要筛选总多糖含量高的西藏棕色蘑菇品种时，使用SEQ IDNO：28～33所示3对引物分别进行PCR扩增反应，将PCR扩增产物经毛细管电泳检测。检测判断：通过引物扩增片段中的SSR位点和SSR重复元件进行判断。当使用引物3.1进行片段扩增时，若扩增得到两个片段(两个峰)，含有2个SSR位点，SSR重复元件为TG，且一个扩增片段有7次重复TG，另一片段有9次重复TG，则判断待测样品为总多糖含量高的西藏棕色蘑菇；当使用引物3.2进行片段扩增时，若扩增得到1个片段(1个峰)，含有1个SSR位点，SSR重复元件为TC，且扩增片段有11次重复TC，则判断待测样品为总多糖含量高的西藏棕色蘑菇；当使用引物3.3进行片段扩增时，若扩增得到一个片段(一个峰)，含有1个SSR位点，SSR重复元件为AT，且扩增片段有6次重复AT，则判断待测样品为总多糖含量高的西藏棕色蘑菇。当同时分别使用上述引物3.1、3.2、3.3进行综合检测判断时，准确性最好。

具体地，当步骤S2中需要筛选总多酚含量高的西藏棕色蘑菇品种时，使用SEQ IDNO：34～39所示3对引物分别进行PCR扩增反应，将PCR扩增产物经毛细管电泳检测。检测判断：通过引物扩增片段中的SSR位点和SSR重复元件进行判断。当使用引物4.1进行片段扩增时，若扩增得到1个片段(1个峰)，含有1个SSR位点，SSR重复元件为CT，且扩增片段有7次重复CT，则判断待测样品为总多酚含量高的西藏棕色蘑菇；当使用引物4.2进行片段扩增时，若扩增得到1个片段(1个峰)，含有1个SSR位点，SSR重复元件为AT，且扩增片段有6次重复AT，则判断待测样品为总多酚含量高的西藏棕色蘑菇；当使用引物4.3进行片段扩增时，若扩增得到2个片段(2个峰)，含有2个SSR位点，SSR重复元件为AT，且一个扩增片段有6次重复GA，另一片段有11次重复GA，则判断待测样品为总多酚含量高的西藏棕色蘑菇。当同时分别使用上述引物4.1、4.2、4.3进行综合检测判断时，准确性最好。

具体地，当步骤S2中需要筛选抗氧化活性强的西藏棕色蘑菇品种时，使用SEQ IDNO：40～45所示3对引物分别进行PCR扩增反应，将PCR扩增产物经毛细管电泳检测。检测判断：通过引物扩增片段中的SSR位点和SSR重复元件进行判断。当使用引物5.1进行片段扩增时，若扩增得到2个片段(2个峰)，含有2个SSR位点，SSR重复元件为AG，且一个扩增片段有6次重复AG，另一片段有7次重复AG，则判断待测样品为抗氧化活性强的西藏棕色蘑菇；当使用引物5.2进行片段扩增时，若扩增得到1个片段(1个峰)，含有1个SSR位点，SSR重复元件为CCA，且扩增片段有4次重复CCA，则判断待测样品为总多酚含量高的西藏棕色蘑菇；当使用引物5.3进行片段扩增时，若扩增得到2个片段(2个峰)，含有2个SSR位点，SSR重复元件为CAG，且一个扩增片段有6次重复CAG，另一片段有8次重复CAG，则判断待测样品为总多酚含量高的西藏棕色蘑菇。当同时分别使用上述引物5.1、5.2、5.3进行综合检测判断时，准确性最好。

具体地，当步骤S2中需要筛选多酚氧化酶活性低的西藏棕色蘑菇品种时，使用SEQID NO：46～51所示3对引物分别进行PCR扩增反应，将PCR扩增产物经毛细管电泳检测。检测判断：通过引物扩增片段中的SSR位点和SSR重复元件进行判断。当使用引物6.1进行片段扩增时，若扩增得到2个片段(2个峰)，含有2个SSR位点，SSR重复元件为TGA，且一个扩增片段有5次重复TGA，另一片段有8次重复TGA，则判断待测样品为多酚氧化酶活性低的西藏棕色蘑菇；当使用引物6.2进行片段扩增时，若扩增得到1个片段(1个峰)，含有1个SSR位点，SSR重复元件为TTG，且扩增片段有8次重复TTG，则判断待测样品为多酚氧化酶活性低的西藏棕色蘑菇；当使用引物6.3进行片段扩增时，若扩增得到1个片段(1个峰)，含有1个SSR位点，SSR重复元件为AAG，且扩增片段有3次重复AAG，则判断待测样品为总多酚含量高的西藏棕色蘑菇。当同时分别使用上述引物6.1、6.2、6.3进行综合检测判断时，准确性最好。

本发明还请求保护上述DNA条形码或上述DNA条形码扩增引物在制备用于筛选优质西藏棕色蘑菇品种的产品中的应用。

一种用于筛选优质西藏棕色蘑菇的产品，包含用于检测上述17个DNA条形码的扩增引物。

优选地，包含上下游核苷酸序列分别如SEQ ID NO：18～51所示的17对引物中的一对或多对。

优选地，所述产品还包含用于PCR扩增反应和用于荧光毛细管电泳检测所需的试剂。

优选地，所述产品为试剂盒。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种用于筛选优质西藏棕色蘑菇的DNA条形码、引物，可以利用西藏棕色蘑菇野生样品及少量组织或菌丝进行鉴别和优良品种选育；可以在西藏棕色蘑菇的菌丝体、原基、子实体、孢子等不同生长阶段鉴别品种和优良品种选育；筛选周期短，不收样品种类的限制，且不会造成浪费，克服了传统育种方法选育西藏棕色蘑菇品种不够准确费时费力的缺点。本发明的DNA条形码、引物可以准确地辨别形态相似性很高的品种，且与总蛋白、总可溶性蛋白、总水解氨基酸、总多糖和总多酚含量高，抗氧化活性强，多酚氧化酶活性低优良品质对应，辅助选育优良的西藏棕色蘑菇品种；不仅成本低，效率高，操作简便，结果稳定可靠性重复性好。本发明与传统育种方法及其他现有DNA条形码技术相比较，它具有省时、省力、省钱、准确、高效的优点，在优质西藏棕色蘑菇的遗传育种上发挥积极作用，同时也为种质资源的鉴定及保护提供了一种有效方法。

附图说明

图1为西藏棕色蘑菇总蛋白和总可溶性蛋白含量高的优质品种筛选特异引物1.1，1.2，1.3PCR扩增产物毛细管电泳检测结果。

图2为西藏棕色蘑菇总水解氨基酸含量高的优质品种筛选特异引物2.1，2.2PCR扩增产物毛细管电泳检测结果。

图3为西藏棕色蘑菇总多糖含量高的优质品种筛选特异引物3.1，3.2，3.3PCR扩增产物毛细管电泳检测结果。

图4为西藏棕色蘑菇总多酚含量高的优质品种筛选特异引物4.1，4.2，4.3PCR扩增产物毛细管电泳检测结果。

图5为西藏棕色蘑菇抗氧化活性强的优质品种筛选特异引物5.1，5.2，5.3PCR扩增产物毛细管电泳检测结果。

图6为西藏棕色蘑菇多酚氧化酶活性低的优质品种筛选特异引物6.1，6.2，6.3PCR扩增产物毛细管电泳检测结果。

图7为实施例1和对比例1的总蛋白含量比较结果。

图8为实施例1和对比例1的可溶性总蛋白含量比较结果。

图9为利用引物1.1扩增实施例1和对比例1的扩增结果。

图10为利用引物1.2扩增实施例1和对比例1的扩增结果。

图11为利用引物1.3扩增实施例1和对比例1的扩增结果。

图12为实施例2和对比例2的总水解氨基酸含量比较结果。

图13为利用引物2.1扩增施例2和对比例2的扩增结果。

图14为利用引物2.2扩增施例2和对比例2的扩增结果。

图15为实施例3和对比例3的总多糖含量比较结果。

图16利用引物3.1扩增实施例3和对比例3的扩增结果。

图17为利用引物3.2扩增实施例3和对比例3的扩增结果。

图18为利用引物3.3扩增实施例3和对比例3的扩增结果。

图19为实施例4和对比例4的总多酚含量比较结果。

图20为利用引物4.1扩增实施例4和对比例4的扩增结果。

图21为利用引物4.2扩增扩增实施例4和对比例4的扩增结果。

图22为利用引物4.3扩增实施例4和对比例4的扩增结果。

图23为实施例5和对比例5的抗氧化活性比较结果。

图24为利用引物5.1扩增实施例5和对比例5的扩增结果。

图25为利用引物5.2扩增实施例5和对比例5的扩增结果。

图26为利用引物5.3扩增实施例5和对比例5的扩增结果。

图27为实施例6和对比例6的多酚氧化酶活性比较结果。

图28为利用引物6.1扩增实施例6和对比例6的扩增结果。

图29为利用引物6.2扩增实施例6和对比例6的扩增结果。

图30为利用引物6.3扩增实施例6和对比例6的扩增结果。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例0西藏棕色蘑菇DNA条形码的构建及鉴定方法

依据西藏棕色蘑菇全基因组中所有简单重复序列(simple sequence repeat，SSR)位点分析筛选并设计了17对引物，利用这17对引物对样品基因组进行扩增所得片段多态性可辅助选育具有总蛋白、总可溶性蛋白、总水解氨基酸、总多糖和总多酚含量高，抗氧化活性强，多酚氧化酶活性低优良品质的棕色蘑菇。

(1)总蛋白和总可溶性蛋白含量高的品种SSR特异引物扩增

西藏棕色蘑菇子实体中总蛋白含量测定参照GB5009.5-2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》的凯氏定氮法进行测定。

可溶性总蛋白的提取，采集西藏棕色蘑菇子实体用真空冷冻干燥的方法脱水后粉碎并过50目筛，以1克干粉加20mL双蒸水，用300W超声波辅助提取30min，然后5000转每分钟离心30min后取上清液制备成可溶性总蛋白提取液。可溶性总蛋白用碧云天生物技术公司BCA蛋白浓度测定试剂盒(增强型)(货号P0010S)测定提取液中可溶性蛋白，并换算为毫克每克。选取总蛋白和可溶性总蛋白含量高于260毫克每克和80毫克每克的西藏棕色蘑菇样品(该指标为双孢蘑菇As2796的总蛋白和可溶性总蛋白含量平均值)，提取基因组DNA进行SSR特异引物扩增，方法如下：

利用生工生物工程(上海)有限公司Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒(货号B518259)提取西藏棕色蘑菇样品基因组，稀释至20ng/μL用于后续验证实验的荧光PCR扩增。

将引物稀释到10μM，根据以下条件及表1中所述特异引物分别进行PCR扩增。反应体系10μL：2×Taq PCR Master Mix 5μL，模板(基因组DNA)1μL，上游引物0.1μL，下游引物0.4μL，带荧光的M13引物(浓度10uM)0.4μL，用无菌的去离子水定容至10μL；反应条件：95℃预变性3min；95℃变性30s，62至55℃降落PCR退火30s，72℃延伸30s，共10个循环；95℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，共25个循环；72℃终延伸20min；4℃保温6h后用于荧光毛细管电泳检测。

表1西藏棕色蘑菇总蛋白和总可溶性蛋白含量高的优质品种筛选特异引物

引物1.1扩增片段(靶序列)如SEQ ID NO：1所示，124bp。

引物1.2扩增片段(靶序列)如SEQ ID NO：2所示，158bp。

引物1.3扩增片段(靶序列)如SEQ ID NO：3所示，270bp。

将PCR产物进行定量稀释后，取1μL PCR稀释产物加9μL甲酰胺(含1％内标)变性后上DNA测序仪ABI 3730xl进行毛细管荧光电泳检测。内标为LIZ-500分子量内标(又称分子量内对照，internal lane standards)由16条带有LIZ荧光素(橙色)标记的双链DNA片段组成，分子量分别是：35、50、75、100、139、150、160、200、250、300、340、350、400、450、490和500bp。扩增结果如图1所示，电泳图中片段大小等于所扩增片段实际bp数加上M13荧光引物的18bp，扩增毛细管电泳2个峰表示该基因为杂合子有2个相似片段。

检测判断：通过引物扩增片段中的SSR位点和SSR重复元件进行判断。当使用引物1.1进行片段扩增时，若扩增得到两个片段(两个峰)，含有2个SSR位点，SSR重复元件为AG，且一个扩增片段有5次重复AG，另一片段有6次重复AG，则判断待测样品为总蛋白和总可溶性蛋白含量高的西藏棕色蘑菇；当使用引物1.2进行片段扩增时，若扩增得到两个片段(两个峰)，含有2个SSR位点，SSR重复元件为CA，且一个扩增片段有6次重复CA，另一片段有7次重复CA，则判断待测样品为总蛋白和总可溶性蛋白含量高的西藏棕色蘑菇；当使用引物1.3进行片段扩增时，若扩增得到一个片段(一个峰)，含有1个SSR位点，SSR重复元件为AC，且扩增片段有5次重复AC，则判断待测样品为总蛋白和总可溶性蛋白含量高的西藏棕色蘑菇。当同时分别使用上述引物1.1、1.2、1.3进行综合检测判断时，准确性最好。

(2)总水解氨基酸含量高的品种SSR特异引物扩增

西藏棕色蘑菇子实体中总水解氨基酸含量测定参照GB 5009.124-2016《食品安全国家标准食品中氨基酸的测定》规定的方法进行测定。

选取总水解氨基酸含量高于160毫克每克的西藏棕色蘑菇样品(该指标为双孢蘑菇As2796的总水解氨基酸含量平均值)。引物序列如表2，方法如(1)所述进行SSR特异引物扩增，扩增结果如图2所示，电泳图中片段大小等于所扩增片段实际bp数加上M13荧光引物的18bp。

表2西藏棕色蘑菇总水解氨基酸含量高的优质品种筛选特异引物

引物2.1扩增片段(靶序列)如SEQ ID NO：4所示，213bp。

引物2.2扩增片段(靶序列)如SEQ ID NO：5所示，198bp。

检测判断：通过引物扩增片段中的SSR位点和SSR重复元件进行判断。当使用引物2.1进行片段扩增时，若扩增得到一个片段(一个峰)，含有1个SSR位点，SSR重复元件为AT，且扩增片段有11次重复AT，则判断待测样品为总水解氨基酸含量高的西藏棕色蘑菇；当使用引物2.2进行片段扩增时，扩增得到1个片段(1个峰)，含有1个SSR位点，SSR重复元件为AT，且扩增片段有5次重复AT，则判断待测样品为总水解氨基酸含量高的西藏棕色蘑菇。当同时分别使用上述引物1.1、1.2进行综合检测判断时，准确性最好。

(3)总多糖含量高的品种筛选

总多糖的提取，采集西藏棕色蘑菇子实体用真空冷冻干燥的方法脱水后粉碎并过50目筛，以1克干粉加20mL双蒸水，用300W超声波辅助提取30min，然后5000转每分钟离心30min后取上清液制备成总多糖提取液。西藏棕色蘑菇子实体提取物中总多糖含量测定采用硫酸苯酚法，具体参照赵启铎等(赵启铎,舒乐新,马琳,崔国红.硫酸-苯酚法测定槐甘菌质多糖的含量[J].宜春学院学报,2011,33(08):74-76.)，并换算为毫克每克。

选取总多糖含量高于70毫克每克的样品(该指标为双孢蘑菇As2796的总多糖含量平均值)，进行SSR特异引物扩增，引物序列如表3，方法如(1)所述，扩增结果如图3所示，电泳图中片段大小等于所扩增片段实际bp数加上M13荧光引物的18bp，毛细管电泳2个峰表示该基因为杂合子有2个相似片段。

表3西藏棕色蘑菇总多糖含量高的优质品种筛选特异引物

引物3.1扩增片段(靶序列)如SEQ ID NO：6所示，261bp。

引物3.2扩增片段(靶序列)如SEQ ID NO：7所示，273bp。

引物3.3扩增片段(靶序列)如SEQ ID NO：8所示，180bp。

检测判断：通过引物扩增片段中的SSR位点和SSR重复元件进行判断。当使用引物3.1进行片段扩增时，若扩增得到两个片段(两个峰)，含有2个SSR位点，SSR重复元件为TG，且一个扩增片段有7次重复TG，另一片段有9次重复TG，则判断待测样品为总多糖含量高的西藏棕色蘑菇；当使用引物3.2进行片段扩增时，若扩增得到1个片段(1个峰)，含有1个SSR位点，SSR重复元件为TC，且扩增片段有11次重复TC，则判断待测样品为总多糖含量高的西藏棕色蘑菇；当使用引物3.3进行片段扩增时，若扩增得到一个片段(一个峰)，含有1个SSR位点，SSR重复元件为AT，且扩增片段有6次重复AT，则判断待测样品为总多糖含量高的西藏棕色蘑菇。当同时分别使用上述引物3.1、3.2、3.3进行综合检测判断时，准确性最好。

(4)总多酚含量高的品种筛选

总多酚的提取，采集西藏棕色蘑菇子实体用真空冷冻干燥的方法脱水后粉碎并过50目筛，以1克干粉加20mL双蒸水，用300W超声波辅助提取30min，然后5000转每分钟离心30min后取上清液制备成总多酚提取液。西藏棕色蘑菇子实体提取物中总多酚含量测定采用福林酚法，具体参照汪佳丹等(汪佳丹,徐婷,韩伟.金针菇中总多酚含量测定方法的优选[J].南京工业大学学报(自然科学版),2017,39(02):113-120.)，并换算为毫克每克。

选取总多酚含量高于10毫克每克的样品(该指标为双孢蘑菇As2796的总多酚含量平均值)，引物序列如表4，方法如(1)所述，进行SSR特异引物扩增，扩增结果如图4所示，电泳图中片段大小等于所扩增片段实际bp数加上M13荧光引物的18bp，毛细管电泳2个峰表示该基因为杂合子2个相似片段。其中，引物4.3可以扩增出3个片段，长度分别为125，270，282个碱基对，所扩增的125bp的等位基因与基因组对应片段长度(256bp基因组位点+18bpM13引物)相差较大，通过全基因SSR位点分析，理论长度为256个碱基。因此判定长度为125个碱基对的片段为非特异扩增片段，后续分析中不再对该片段作分析。

表4西藏棕色蘑菇总多酚含量高的优质品种筛选特异引物

引物4.1扩增片段(靶序列)如SEQ ID NO：9所示，262bp。

引物4.2扩增片段(靶序列)如SEQ ID NO：10所示，147bp。

引物4.3扩增片段(靶序列)如SEQ ID NO：11所示，256bp。

检测判断：通过引物扩增片段中的SSR位点和SSR重复元件进行判断。当使用引物4.1进行片段扩增时，若扩增得到1个片段(1个峰)，含有1个SSR位点，SSR重复元件为CT，且扩增片段有7次重复CT，则判断待测样品为总多酚含量高的西藏棕色蘑菇；当使用引物4.2进行片段扩增时，若扩增得到1个片段(1个峰)，含有1个SSR位点，SSR重复元件为AT，且扩增片段有6次重复AT，则判断待测样品为总多酚含量高的西藏棕色蘑菇；当使用引物4.3进行片段扩增时，若扩增得到2个片段(2个峰)，含有2个SSR位点，SSR重复元件为AT，且一个扩增片段有6次重复GA，另一片段有11次重复GA，则判断待测样品为总多酚含量高的西藏棕色蘑菇。当同时分别使用上述引物4.1、4.2、4.3进行综合检测判断时，准确性最好。

(5)抗氧化活性强的品种筛选

采集西藏棕色蘑菇子实体用真空冷冻干燥的方法脱水后粉碎并过50目筛，以1克干粉加20mL双蒸水，用300W超声波辅助提取30min，然后5000转每分钟离心30min后取上清液制备成水提取液。西藏棕色蘑菇子实体水提取物抗氧化活性用碧云天生物技术公司总抗氧化能力检测试剂盒(ABTS快速法)(货号S0121)测定，ABTS是2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐，用于测定食品的总抗氧化活性，用清除百分比表示。

选取ABTS自由基清除率高于70％的样品进行，该指标为双孢蘑菇As2796的总抗氧化活性ABTS自由基清除百分比平均值，引物序列如表5，方法如(1)所述进行SSR特异引物扩增，扩增结果如图5所示，电泳图中片段大小等于所扩增片段实际bp数加上M13荧光引物的18bp，毛细管电泳2个峰表示该基因为杂合子有2个相似片段。

表5西藏棕色蘑菇抗氧化活性强的优质品种筛选特异引物

引物5.1扩增片段(靶序列)如SEQ ID NO：12所示，255bp。

引物5.2扩增片段(靶序列)如SEQ ID NO：13所示，214bp。

引物5.3扩增片段(靶序列)如SEQ ID NO：14所示，223bp。

检测判断：通过引物扩增片段中的SSR位点和SSR重复元件进行判断。当使用引物5.1进行片段扩增时，若扩增得到2个片段(2个峰)，含有2个SSR位点，SSR重复元件为AG，且一个扩增片段有6次重复AG，另一片段有7次重复AG，则判断待测样品为抗氧化活性强的西藏棕色蘑菇；当使用引物5.2进行片段扩增时，若扩增得到1个片段(1个峰)，含有1个SSR位点，SSR重复元件为CCA，且扩增片段有4次重复CCA，则判断待测样品为总多酚含量高的西藏棕色蘑菇；当使用引物5.3进行片段扩增时，若扩增得到2个片段(2个峰)，含有2个SSR位点，SSR重复元件为CAG，且一个扩增片段有6次重复CAG，另一片段有8次重复CAG，则判断待测样品为总多酚含量高的西藏棕色蘑菇。当同时分别使用上述引物5.1、5.2、5.3进行综合检测判断时，准确性最好。

(6)多酚氧化酶活性低品种筛选

多酚氧化酶的提取，采集西藏棕色蘑菇子实体用真空冷冻干燥的方法脱水后粉碎并过50目筛，以1克干粉加20mL双蒸水，用300W超声波辅助提取30min，然后5000转每分钟离心30min后取上清液制备成多酚氧化酶提取液。西藏棕色蘑菇子实体提取物多酚氧化酶活性用北京索莱宝科技有限公司多酚氧化酶(PPO)活性检测试剂盒(货号BC0190)测定，用酶活单位每毫克样品表示。

选取低于4420单位每克的样品(该指标为双孢蘑菇As2796的多酚氧化酶活性平均值)，引物序列如表6，方法如(1)所述，进行SSR特异引物扩增，扩增结果如图6所示，电泳图中片段大小等于所扩增片段实际bp数加上M13荧光引物的18bp，毛细管电泳2个峰表示该基因为杂合子有2个相似片段。

表6西藏棕色蘑菇多酚氧化酶活性低的优质品种筛选特异引物

引物6.1扩增片段(靶序列)如SEQ ID NO：15所示，246bp。

引物6.2扩增片段(靶序列)如SEQ ID NO：16所示，191bp。

引物6.3扩增片段(靶序列)如SEQ ID NO：17所示，257bp。

检测判断：通过引物扩增片段中的SSR位点和SSR重复元件进行判断。当使用引物6.1进行片段扩增时，若扩增得到2个片段(2个峰)，含有2个SSR位点，SSR重复元件为TGA，且一个扩增片段有5次重复TGA，另一片段有8次重复TGA，则判断待测样品为多酚氧化酶活性低的西藏棕色蘑菇；当使用引物6.2进行片段扩增时，若扩增得到1个片段(1个峰)，含有1个SSR位点，SSR重复元件为TTG，且扩增片段有8次重复TTG，则判断待测样品为多酚氧化酶活性低的西藏棕色蘑菇；当使用引物6.3进行片段扩增时，若扩增得到1个片段(1个峰)，含有1个SSR位点，SSR重复元件为AAG，且扩增片段有3次重复AAG，则判断待测样品为总多酚含量高的西藏棕色蘑菇。当同时分别使用上述引物6.1、6.2、6.3进行综合检测判断时，准确性最好。

实施例1总蛋白和总可溶性蛋白指标筛选验证

以广泛栽培的优质双孢蘑菇品种As2796为对比例1，优质西藏棕色蘑菇为实施例1。采集对比例1和实施例1子实体真空冷冻干燥的方法脱水后粉碎并过50目筛，参照GB5009.5-2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》的凯氏定氮法测定子实体中总蛋白含量。如图7所示，实施例1的总蛋白含量显著高于对比例1。

可溶性总蛋白的提取，采集对比例1和实施例1子实体用真空冷冻干燥的方法脱水后粉碎并过50目筛，以1克干粉加20mL双蒸水，用300W超声波辅助提取30min，然后5000转每分钟离心30min后取上清液制备成可溶性总蛋白提取液。可溶性总蛋白用碧云天生物技术公司BCA蛋白浓度测定试剂盒(增强型)(货号P0010S)测定提取液中可溶性蛋白，并换算为毫克每克。如图8所示，实施例1的可溶性总蛋白含量显著高于对比例1。

采集对比例1和实施例1子实体样品，分别利用引物1.1，1.2，1.3进行扩增，按照实施例0中(1)所述步骤进行。

(1)引物1.1的扩增结果如图9所示；具体地，引物1.1所扩增的片段SSR重复元件为AG，实施例西藏棕色蘑菇有2个SSR位点，一个是137bp扩增片段的5次重复AG，另一个是139bp扩增片段的6次重复；对比例双孢菇As2796有1个SSR位点，是137bp扩增片段的5次重复AG，具体序列信息如下所示；其中，前18个碱基为M13荧光引物的18bp，下划线部分为SSR重复元件。

137bp扩增片段序列：

TGTAAAACGACGGCCAGTAAGCCGGGTATCATGAAGCCGTACATGATTCGGAGGAGAGATTCACTCTGATATATAGGAACAATGCAACTAAAGAGAGAGAGGGTCATGAAACGCAAATCGGTGACAGAGAAAGACGC

139bp扩增片段序列：

TGTAAAACGACGGCCAGTAAGCCGGGTATCATGAAGCCGTACATGATTCGGAGGAGAGATTCACTCTGATATATAGGAACAATGCAACTAAAGAGAGAGAGAGGGTCATGAAACGCAAATCGGTGACAGAGAAAGACGC。

(2)引物1.2的扩增结果如图10所示；具体地，引物1.2所扩增的片段SSR重复元件为CA，实施例西藏棕色蘑菇有2个SSR位点，一个是176bp扩增片段的6次重复CA，另一个是177bp扩增片段的7次重复；对比例双孢菇As2796有1个SSR位点，是176bp扩增片段的6次重复CA，具体序列信息如下所示；其中，前18个碱基为M13荧光引物的18bp，下划线部分为SSR重复元件。

176bp扩增片段序列：

TGTAAAACGACGGCCAGTGGTCAGGGCATACGAACACAACAAATGCCTTGGTTCGTTCTTTTATCTCATTTCTGCTATGCATGCTCACATTCTACTTTAGGTTATAGTTCCTCCATGGCCGACTTTGAAGGTAGCACACACACA CACCTATACGATAACTCTAATCGCGCCTAGGC；

177bp扩增片段序列：

TGTAAAACGACGGCCAGTGGTCAGGGCATACGAACACAACAAATGCCTTGGTTCGTTCTTTATCTCATTTCTGCTATGCATGCTCACATTCTACTTTAGGTTATAGTTCCTCCATGGCCGACTTTGAAGGTAGCACACACACAC ACACCTATACGATAACTCTAATCGCGCCTAGGC。

(3)引物1.3的扩增结果如图11所示；具体地，引物1.3所扩增的片段SSR重复元件为AC，实施例西藏棕色蘑菇有1个SSR位点，是285bp扩增片段的5次重复AC；对比例双孢菇As2796有1个SSR位点，是287bp扩增片段的6次重复AC，具体序列信息如下所示；其中，前18个碱基为M13荧光引物的18bp，下划线部分为SSR重复元件。

285bp扩增片段序列：

TGTAAAACGACGGCCAGTGAGGATCATCATACCCGCGGGTAAGTCTTACACACACACTTGTTTCAACTTGACTAAAGTGCATTTACAGCATTGCGTCAATAGATTTTAAATCACCTTATATCGTTTCGGGATCTTCAGATAAACACATACGCCTTGTAGATATGAACACGTCCAGAGGATGGTCAACGTCTTCGGAGTATGATACCCTACCCCTCGGACTTGGACTTGGAGATTCATCACCTTCGTTACCCACTGCGGGACATTCAGCCGGAGGAGAGGAATCTT；

287bp扩增片段序列：

TGTAAAACGACGGCCAGTGAGGATCATCATACCCGCGGGTAAGTCTTACACACACACACTTGTTTCAACTTGACTAAAGTGCATTTACAGCATTGCGTCAATAGATTTTAAATCACCTTATATCGTTTCGGGATCTTCAGATAAACACATACGCCTTGTAGATATGAACACGTCCAGAGGATGGTCAACGTCTTCGGAGTATGATACCCTACCCCTCGGACTTGGACTTGGAGATTCATCACCTTCGTTACCCACTGCGGGACATTCAGCCGGAGGAGAGGAATCTT。

上述结果表明利用引物1.1，1.2，1.3可以将对比例1和实施例1有效区分开，引物1.1，1.2，1.3可用来筛选总蛋白和总可溶性蛋白高的西藏棕色蘑菇。

实施例2总水解氨基酸指标筛选验证

以广泛栽培的优质双孢蘑菇品种As2796为对比例2，优质西藏棕色蘑菇为实施例2。采集对比例2和实施例2子实体真空冷冻干燥的方法脱水后粉碎并过50目筛，总水解氨基酸含量测定参照GB 5009.124-2016《食品安全国家标准食品中氨基酸的测定》规定的方法进行测定。如图12所示，实施例2总水解氨基酸含量高于对比例2。

采集对比例2和实施例2子实体样品，提取基因组利用引物2.1，2.2进行扩增，方法如实施例1。

(1)引物2.1的扩增结果如图13所示；具体地，引物2.1所扩增的片段SSR重复元件为AT；实施例西藏棕色蘑菇有1个SSR位点，是260bp扩增片段的11次重复AT；对比例双孢菇As2796有1个SSR位点，是252bp扩增片段的7次重复AT，具体序列信息如下所示；其中，前18个碱基为M13荧光引物的18bp，下划线部分为SSR重复元件。

252bp扩增片段序列：

TGTAAAACGACGGCCAGTGCTTCACTCGTGGTGCTACTCCACAAAAACTCTATTCATCTAATTTAGATCAAGCACATATATATATATATCACGAAGATGCATTCAATAAAGCAGCACTTTCATCCGGTTTTGATTCAAAGCGCCTACGCATGGCGATAATCATTTTGGTAAACCTGGGGTTCCATTGGTAAGAGGCAAAAAAATATATTCCGGGACGGCAGCATACCAAAGGAGATTGAGGCCCTGGAGAGT；

260bp扩增片段序列：

TGTAAAACGACGGCCAGTGCTTCACTCGTGGTGCTACTCCACAAAAACTCTATTCATCTAATTTAGATCAAGCACATATATATATATATATATATATCACGAAGATGCATTCAATAAAGCAGCACTTTCATCCGGTTTTGATTCAAAGCGCCTACGCATGGCGATAATCATTTTGGTAAACCTGGGGTTCCATTGGTAAGAGGCAAAAAAATATATTCCGGGACGGCAGCATACCAAAGGAGATTGAGGCCCTGGAGAGT。

(2)引物2.2的扩增结果如图14所示；具体地，引物2.2所扩增的片段SSR重复元件为AT；实施例西藏棕色蘑菇有1个SSR位点，是213bp扩增片段的5次重复AT；对比例双孢菇As2796有1个SSR位点，是214bp扩增片段的6次重复AT。具体序列信息如下所示；其中，前18个碱基为M13荧光引物的18bp，下划线部分为SSR重复元件。

213bp扩增片段序列：

TGTAAAACGACGGCCAGTTACCGAATTGCCCACTGGTCAAGAGAGAGTTGATATTCCAGGCCGAAATCACTACCGACAAAAAAGCAAACATCAAGAGGAGAGCTTCAAATACTTAATATATATATGGACCTTGTCATGATAGAAACACTCACCAAAAAGAACAGTTCGCAGAAGGAGAAACGTATTAAACATAGCCATCGTGATCGTTGAAGC；

214bp扩增片段序列：

TGTAAAACGACGGCCAGTTACCGAATTGCCCACTGGTCAAGAGAGAGTTGATATTCCAGGCCGAAATCACTACCGACAAAAAAGCAAACATCAAGAGGAGAGCTTCAAATACTTAATATATATATATGGACCTTGTCATGAAGAAACACTCACCAAAAAGAACAGTTCGCAGAAGGAGAAACGTATTAAACATAGCCATCGTGATCGTTGAAGC

上述结果表明利用引物2.1，2.2可以将对比例2和实施例2有效区分开，引物2.1，2.2可用来筛选总水解氨基酸含量高的西藏棕色蘑菇。

实施例3总多糖指标筛选验证

以广泛栽培的优质双孢蘑菇品种As2796为对比例3，优质西藏棕色蘑菇为实施例3。采集实施例3和对比例3子实体用真空冷冻干燥的方法脱水后粉碎并过50目筛，以1克干粉加20mL双蒸水，用300W超声波辅助提取30min，然后5000转每分钟离心30min后取上清液制备成总多糖提取液。实施例3和对比例3提取物中总多糖含量测定采用硫酸苯酚法，具体参照赵启铎等宜春学院学报,2011,33(08):74-76，并换算为毫克每克。如图15所示，实施例3总多糖含量高于对比例3。

采集对比例3和实施例3子实体样品，提取基因组利用引物3.1，3.2，3.3进行扩增，方法如实施例1。

(1)引物3.1的扩增结果如图16所示；具体地，引物3.1所扩增的片段SSR重复元件为TG；实施例西藏棕色蘑菇有2个SSR位点，一个是277bp扩增片段的7次重复TG，另一个是283bp扩增片段的9次重复TG；对比例双孢菇As2796有1个SSR位点，是280bp扩增片段的8次重复TG。具体序列信息如下所示；其中，前18个碱基为M13荧光引物的18bp，下划线部分为SSR重复元件。

277bp扩增片段序列：

TGTAAAACGACGGCCAGTCCTCAAGTGATTCGGCCACAGACGGCGTTGAGTGAGCGGGAGACGATGGAAACTGAGGTTATCAGTGAGTTTATCGGTTTATGATCGATGATCAAGTTTCCATGCTGATCGTATATGATTGTGATT GTGTGTGTGTGTGCGTGCAGAGCTTTTGATACATTCGTACTTTAATATCGTGAAGCGCGAGATGATCGATATGGTTCCGAAAGCCATTTCACTGAACCTTGTTTCATTCGAAGGATAATTTGCAGCGCGAGCT；

280bp扩增片段序列：

TGTAAAACGACGGCCAGTCCTCAAGTGATTCGGCCACAGACGGCGTTGAGTGAGCGGGAGACGATGGAAACTGAGGTTATCAGTGAGTTTATCGGTTTATGATCGATGATCAAGTTTCCATGCTGATCGTATATGATTGTGATT GTGTGTGTGTGTGTGCGTGCAGAGCTTTTGATACATTCGTACTTTAATATCGTGAAGCGCGAGATGATCGATATGGTTCCGAAAGCCATTTCACTGAACCTTGTTATCATTCGAAGGATAATTTGCAGCGCGAGCT；

283bp扩增片段序列：

TGTAAAACGACGGCCAGTCCTCAAGTGATTCGGCCACAGACGGCGTTGAGTGAGCGGGAGACGATGGAAACTGAGGTTATCAGTGAGTTTATCGGTTTATGATCGATGATCAAGTTTCCATGCTGATCGTATATGATTGTGATT GTGTGTGTGTGTGTGTGCGTGCAGAGCTTTTGATACATTCGTACTTTAATATCGTGAAGCGCGAGATGATCGATATGGTTCCGAAAGCCATTTCACTGAACCTTGTTAATCATTCGAAGGATAATTTGCAGCGCGAGCT。

(2)引物3.2的扩增结果如图17所示；具体地，引物3.2所扩增的片段SSR重复元件为TC；实施例西藏棕色蘑菇有1个SSR位点，是288bp扩增片段的11次重复TC；对比例双孢菇As2796有2个SSR位点，一个是277bp扩增片段的5次重复TC，另一个是292bp扩增片段的12次重复TC。具体序列信息如下所示；其中，前18个碱基为M13荧光引物的18bp，下划线部分为SSR重复元件。

277bp扩增片段序列：

TGTAAAACGACGGCCAGTAATGCGTGGACGTGCTCTTACGCGCACTTCGGTCACTCAGTACTTACACCCGAGTGGCAGGTGAGAATAATTCGCTATCTGATTTTATTTTGTTTTCCACCTATATTATCTCTCTCTCTATCTTTTTTTCAAAATTGTTGACGTGTTAAACATTTTTTCGTAGCTGATTATCTCGAAACCTTGGAGCAAGACTACTTACCTCTCAAACAGACTGTGACATTAGTAGATAACACTGCGTTTCCGCAGTAAGGTCCATTCC；

288bp扩增片段序列：

TGTAAAACGACGGCCAGTAATGCGTGGACGTGCTCTTACGCGCACTTCGGTCACTCAGTACTTACACCCGAGTGGCAGGTGAGAATAATTCGCTATCTGATTTTATTTTGTTTTCCACCTATATTATCTCTCTCTCTCTCTCTC TCTCTATCTTTTTTTCAAATTGTTGACGTGTTAAACATTTTTTCGTAGCTGATTATCTCGAAACCTTGGAGCAAGACTACTTACCTCTCAAACAGACTGTGACATTAGTAGATAACACTGCGTTTCCGCAGTAAGGTCCATTCC；

292bp扩增片段序列：

TGTAAAACGACGGCCAGTAATGCGTGGACGTGCTCTTACGCGCACTTCGGTCACTCAGTACTTACACCCGAGTGGCAGGTGAGAATAATTCGCTATCTGATTTTATTTTGTTTTCCACCTATATTATCTCTCTCTCTCTCTCTCTC TCTCTATCTCTTTTTTCAAAATTGTTGACGTGTTAAACATTTTTTCGTAGCTGATTATCTCGAAACCTTGGAGCAAGACTACTTACCTCTCAAACAGACTGTGACATTAGTAGATAACACTGCGTTTCCGCAGTAAGGTCCATTCC

(3)引物3.3的扩增结果如图18所示；具体地，引物3.3所扩增的片段SSR重复元件为AT；实施例西藏棕色蘑菇有1个SSR位点，是199bp扩增片段的6次重复AT；对比例双孢菇As2796有2个SSR位点，一个是197bp扩增片段的6次重复AT，另一个是199bp扩增片段的6次重复AT。具体序列信息如下所示；其中，前18个碱基为M13荧光引物的18bp，下划线部分为SSR重复元件。

197bp扩增片段序列：

GTTGAAATCAGGCAAGATCAGGCAAGCGCAGGTGAATGCCATCAGCACAGGGCCGAGAAGAAAAAAATTTTTTGTCCCAGGTCCCAGCCCCTTTTGATATATATATATTAGACAGCGGTCAACCTGCTTCACCCCCACGTCCTACCTTCCTTTTTTGGTATCATACCTCTGTGCGTGCTCGATGGCCTCCATTCCTC；

199bp扩增片段序列：

GTTGAAATCAGGCAAGATCAGGCAAGCGCAGGTGAATGCCATCAGCACAGGGCCGATAGAAGAAAAAAATTTTTTGTCCCAGGTCCCAGCCCCTTTTGATATATATATATTAGACAGCGGTCAACCTGCTTCACCCCCACGTCCTACCTTCCTTTTTTGGTATCATACCTCTGTGCGTGCTCGATGGCCTCCATTCCTC。

以上结果利用引物3.1，3.2，3.3可以将对比例3和实施例3有效区分开，引物3.1，3.2，3.3可用来筛选总多糖含量高的西藏棕色蘑菇。

实施例4总多酚指标筛选验证

以广泛栽培的优质双孢蘑菇品种As2796为对比例4，优质西藏棕色蘑菇为实施例4。采集实施例4和对比例4子实体用真空冷冻干燥的方法脱水后粉碎并过50目筛，以1克干粉加20mL双蒸水，用300W超声波辅助提取30min，然后5000转每分钟离心30min后取上清液制备成总多酚提取液。实施例4和对比例4提取物中总多酚含量测定采用福林酚法，具体参照汪佳丹等南京工业大学学报(自然科学版),2017,39(02):113-120，并换算为毫克每克。如图19所示，实施例4总多酚含量高于对比例4。

采集对比例4和实施例4子实体样品，提取基因组利用引物4.1，4.2，4.3进行扩增，方法如实施例1。

(1)引物4.1的扩增结果如图20所示；具体地，引物4.1所扩增的片段SSR重复元件为CT；实施例西藏棕色蘑菇有1个SSR位点，是280bp扩增片段的7次重复CT；对比例双孢菇As2796有2个SSR位点，一个是278bp扩增片段的6次重复CT，另一个是280bp扩增片段的7次重复CT。具体序列信息如下所示；其中，前18个碱基为M13荧光引物的18bp，下划线部分为SSR重复元件。

278bp扩增片段序列：

TGTAAAACGACGGCCAGTTCCGGCAATTGAAATGCGTGGGAGACACCGGAGTAATCAATCAGAGGTCGTGTCACTCTCTCAGTGACCTTGTTACCAATTGCCAGCATTCGTTCAAATCCTTCAACACAAGGCTACTCTCTCTCT CTCCACATTCAAGAACCAGGGACAAGAAAATCAATATCCTCATATCCTCACACGCAAGGGCGAATCGGATACCACCTTTTCAGTCATAACAAAATAACAACGTCGATTTCTTTTTTCGCTCTCAACGCAACTCT；

280bp扩增片段序列：

TGTAAAACGACGGCCAGTTCCGGCAATTGAAATGCGTGGGAGACACCGGAGTAATCAATCAGAGGTCGTGTCACTCTCTCAGTGACCTTGTTACCAATTGCCAGCATTCGTTCAAATCCTTCAACACAAGGCTACTCTCTCTCT CTCTCCACATTCAAGAACCAGGGACAAGAAAATCAATATCCTCATATCCTCACACGCAAGGGCGAATCGGATACCACCTTTTCAGTCATAACAAAATAACAACGTCGATTTCTTTTTTCGCTCTCAACGCAACTCT。

(2)引物4.2的扩增结果如图21所示；具体地，引物4.2所扩增的片段SSR重复元件为AT；实施例西藏棕色蘑菇有1个SSR位点，是165bp扩增片段的6次重复AT；对比例双孢菇As2796有2个SSR位点，一个是165bp扩增片段的6次重复AT，另一个是167bp扩增片段的7次重复AT。具体序列信息如下所示；其中，前18个碱基为M13荧光引物的18bp，下划线部分为SSR重复元件。

165bp扩增片段序列：

TGTAAAACGACGGCCAGTGGGTCGAAGTGTCAGGTCAGTGAATATATATATATCAGGCCTCCTACTTAGCTGATGATATGACTCGAGCTCATGGGATTGCTGATGTTGATGGAATCCAGAAAATCTGGTGATCTGAATTTAACTTAAGACACGTGCTCGCTTACA；

167bp扩增片段序列：

TGTAAAACGACGGCCAGTGGGTCGAAGTGTCAGGTCAGTGAATATATATATATATCAGGCCTCCTACTTAGCTGATGATATGACTCGAGCTCATGGGATTGCTGATGTTGATGGAATCCAGAAAATCTGGTGATCTGAATTTAACTTAAGACACGTGCTCGCTTACA。

(3)引物4.3的扩增结果如图22所示；具体地，引物4.3所扩增的片段SSR重复元件为GA；实施例西藏棕色蘑菇有2个SSR位点，一个是271bp扩增片段的6次重复GA，另一个是282bp扩增片段的11次重复GA；对比例双孢菇As2796有1个SSR位点，是282bp扩增片段的11次重复GA。具体序列信息如下所示；其中，前18个碱基为M13荧光引物的18bp，下划线部分为SSR重复元件。

271bp扩增片段序列：

TGTAAAACGACGGCCAGTATCCTGAACGTGCGGAACATACTAGAGCGACTTTATGTTGATCAATGTAGTTCCTTGAAAAGAAGACGCGTGTCAGTTGAGGAACTCTCCATACACGAAAAAAAGGGAGAGAGAGAGAAAACGAAACGAAACGAAACGCAACGAAGTGTAATAAAACGAAAAGAAACGAAGGAAGAGGAAATGAAACGCACGAAACGATATCCTCTGCAATATTCACAGCAAATTTCCAACACTCGTCCCTCCAAACTTCTGC；

282bp扩增片段序列：

TGTAAAACGACGGCCAGTATCCTGAACGTGCGGAACATACTAGAGCGACTTTATGTTGATCAATGTAGTTCCTTGAAAAGAAGACGCGTGTCAGTTGAGGAACTCTCCATACACGAAAAAAAGGGAGAGAGAGAGAGAGAGAGA GAAAACGAAACGAAACGAAACGCAACGAAGTGTAATAAAACGAAAAGAAACGAAGGAAGAGGAAATGAAACGCACGAAACGATATCCTCTGCAATATTCACAGCAAATTTTCCAACACTCGTCCCTCCAAACTTCTGC。

以上结果利用引物4.1，4.2，4.3可以将对比例4和实施例4有效区分开，引物4.1，4.2，4.3可用来筛选总多酚含量高的西藏棕色蘑菇。

实施例5抗氧化活性指标筛选验证

采以广泛栽培的优质双孢蘑菇品种As2796为对比例5，优质西藏棕色蘑菇为实施例5。采集实施例5和对比例5子实体用真空冷冻干燥的方法脱水后粉碎并过50目筛，以1克干粉加20mL双蒸水，用300W超声波辅助提取30min，然后5000转每分钟离心30min后取上清液制备成水提取液。实施例5和对比例5提取物抗氧化活性测定用碧云天生物技术公司总抗氧化能力检测试剂盒(ABTS快速法)(货号S0121)测定。ABTS是2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐，常用于测定食品的总抗氧化活性，用清除百分比表示。如图23所示，实施例5总抗氧化活性强于对比例5。

采集对比例5和实施例5子实体样品，提取基因组利用引物5.1，5.2，5.3进行扩增，方法如实施例1。

(1)引物5.1的扩增结果如图24所示；具体地，引物5.1所扩增的片段SSR重复元件为AG；实施例西藏棕色蘑菇有2个SSR位点，一个是272bp扩增片段的6次重复AG，另一个是274bp扩增片段的7次重复AG；对比例双孢菇As2796有1个SSR位点，是272bp扩增片段的6次重复AG。具体序列信息如下所示；其中，前18个碱基为M13荧光引物的18bp，下划线部分为SSR重复元件。

272bp扩增片段序列：

TGTAAAACGACGGCCAGTCGCCACTGAACAGGTAGAGGCACAATAAGAGAGAGAGAGATAAAAGCAGTGTTCGTATGAGGAACAAGATGAACAAAAAGGGCGAGCGCTAAGGTGATCAACACTTTCGCTGTCCAAGTTTGGGAGACCTTTGTAAGTAAGAGTTTGGAAAATCGCTTATGAGGGCACCCCGTCCAACTCGTTACGATTGCGGTCCAAAGGGTAATTAAATTGGGATCTCGCATTAAGCTCAAAATGGGTTCCTTTCCGTCACC；

274bp扩增片段序列：

TGTAAAACGACGGCCAGTCGCCACTGAACAGGTAGAGGCACAATAAGAGAGAGAGAGAGATAAAAGCAGTGTTCGTATGAGGAACAAGATGAACAAAAAGGGCGAGCGCTAAGGTGATCAACACTTTCGCTGTCCAAGTTTGGGAGACCTTTGTAAGTAAGAGTTTGGAAAATCGCTTATGAGGGCACCCCGTCCAACTCGTTACGATTGCGGTCCAAAGGGTAATTAAATTGGGATCTCGCATTAAGCTCAAAATGGGTTCCTTTCCGTCACC。

(2)引物5.2的扩增结果如图25所示；具体地，引物5.2所扩增的片段SSR重复元件为CCA；实施例西藏棕色蘑菇有1个SSR位点，是228bp扩增片段的4次重复CCA；对比例双孢菇As2796有1个SSR位点，是231bp扩增片段的5次重复CCA。具体序列信息如下所示；其中，前18个碱基为M13荧光引物的18bp，下划线部分为SSR重复元件。

228bp扩增片段序列：

TGTAAAACGACGGCCAGTGCACGAGCGATATGTCCTGTCTGCCACAACGGTAACACTCCTGGCCACCGCCGCCACCACCACCACCGCCACTGGAGAATCCACCAGAGGCGGGAGCCTGTTGAGTGCATTCGCGGGACTGACGCGCACAAAGATATAAGAATTCTGGGCAATGTTGGAACATATAATATACACCTACAATATGACCCTCTACACCGCACTTGTAGCAGG；

231bp扩增片段序列：

TGTAAAACGACGGCCAGTGCACGAGCGATATGTCCTGTCTGCCACAACGGTAACACTCCTGGCCACCGCCGCCACCACCACCACCACCGCCACTGGAGAATCCACCAGAGGCGGGAGCCTGTTGAGTGCATTCGCGGGACTGACGCGCACAAAGATATAAGAATTCTGGGCAATGTTGGAACATATAATATACACCTACAATATGACCCTCTACACCGCACTTGTAGCAGG。

(3)引物5.3的扩增结果如图26所示；具体地，引物5.3所扩增的片段SSR重复元件为CAG；实施例西藏棕色蘑菇有2个SSR位点，一个是239bp扩增片段的6次重复CAG，另一个是244bp扩增片段的8次重复CAG；对比例双孢菇As2796有1个SSR位点，是239bp扩增片段的6次重复CAG。具体序列信息如下所示；其中，前18个碱基为M13荧光引物的18bp，下划线部分为SSR重复元件。

239bp扩增片段序列：

TGTAAAACGACGGCCAGTACGCCGCTTATCAAGACCAGAAACAGGCTATGGCAGCAGCAGGCTCAGTTCAGACCTCGTAGTGGCATGGACATCAACCAGCAGCCCCAGCAGCAGCAGCAGCAGCCTCAACAAGTGAGCCTTTCCCAACCCCACTTGCCCTCCCCACCCCTCTCTCTCCCACATACCTCTCTCCTTCCCTACCCCGCGGCCACTAACCCTTTCCTTGTCGTGGGAGCTTC；

244bp扩增片段序列：

TGTAAAACGACGGCCAGTACGCCGCTTATCAAGACCAAAACAGGCTATGGCAGCAGCAGGCTCAGTTCAGACCTCGTAGTGGCATGGACATCAACCAGCAGCCCCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCCTCAACAAGTGAGCCTTTCCCAACCCCACTTGCCCTCCCCACCCCTCTCTCTCCCACATACCTCTCTCCTTCCCTACCCCGCGGCCACTAACCCTTTCCTTGTCGTGGGAGCTTC

以上结果利用引物5.1，5.2，5.3可以将对比例5和实施例5有效区分开，引物5.1，5.2，5.3可用来筛选抗氧化活性强的西藏棕色蘑菇。

实施例6多酚氧化酶指标筛选验证

采以广泛栽培的优质双孢蘑菇品种As2796为对比例6，优质西藏棕色蘑菇为实施例6。采集实施例6和对比例6子实体用真空冷冻干燥的方法脱水后粉碎并过50目筛，以1克干粉加20mL双蒸水，用300W超声波辅助提取30min，然后5000转每分钟离心30min后取上清液制备成总多糖提取液。实施例6和对比例6提取物酚氧化酶活性用北京索莱宝科技有限公司多酚氧化酶(PPO)活性检测试剂盒(货号BC0190)测定，用酶活单位每克蘑菇子实体干粉表示。如图27所示，实施例6的多酚氧化酶活性显著低于对比例6。

采集对比例6和实施例6子实体样品，提取基因组利用引物6.1，6.2，6.3进行扩增，方法如实施例1。

(1)引物6.1的扩增结果如图28所示；具体地，引物6.1所扩增的片段SSR重复元件为TGA；实施例西藏棕色蘑菇有2个SSR位点，一个是265bp扩增片段的5次重复TGA，另一个是271bp扩增片段的8次重复TGA；对比例双孢菇As2796有2个SSR位点，一个是265bp扩增片段的5次重复TGA，另一个是268bp扩增片段的6次重复TGA。具体序列信息如下所示；其中，前18个碱基为M13荧光引物的18bp，下划线部分为SSR重复元件。

265bp扩增片段序列：

TGTAAAACGACGGCCAGTCAGACAGAGACGGCCTTGAGGATGGATGATGTTTCAGAAGTCACGGTCCCCAAGTCGCAATATGACGACGACACTCTACCAAAACATAGCGATATTCGTATACCTTGATTTTAGAAATTTGATATTCATGATATTTTGTGCATTAGCCACCTTCAGGTTGTACAGTACTTTGAGTGATGATGATGATGATGTTGAGCGTCGAAGTTGCTGACTCAGCGAATCTCGCGGTTTGAATGGACGCGACCTG；

268bp扩增片段序列：

TGTAAAACGACGGCCAGTCAGACAGAGACGGCCTTGAGGATGGATGATGTTTCAGAAGTCACGGTCCCCAAGTCGCAATATGACGACGACACTCTACCAAAACATAGCGATATTCGTATACCTTGATTTTAGAAATTTGTATTCATGATATTTTGTGCATTAGCCACCTTCAGGTTGTACAGTACTTTGATGAGTGATGATGATGATGATGATTGAGCGTCGAAGTTGCTGACTCAGCGAATCTCGCGGTTTGAATGGACGCGACCTG；

271bp扩增片段序列：

TGTAAAACGACGGCCAGTCAGACAGAGACGGCCTTGAGGATGGATGATGTTTCAGAAGTCACGGTCCCCAAGTCGCAATATGACGACGACACTCTACCAAAACATAGCGATATTCGTATACCTTGATTTTAGAAATTTGTATTCATGATATTTTGTGCATTAGCCACCTTCAGGTTGTACAGTACTTTGAGTGATGATGATGATGATGATGATGATTGAGCGTCGAAGTTGCTGACTCAGCGAATCTCGCGGTTTGAATGGACGCGACCTG。

(2)引物6.2的扩增结果如图29所示；具体地，引物6.2所扩增的片段SSR重复元件为TTG；实施例西藏棕色蘑菇有1个SSR位点，是213bp扩增片段的8次重复TTG；对比例双孢菇As2796有2个SSR位点，一个是209bp扩增片段的7次重复TTG，另一个是213bp扩增片段的8次重复TTG。具体序列信息如下所示；其中，前18个碱基为M13荧光引物的18bp，下划线部分为SSR重复元件。

209bp扩增片段序列：

TGTAAAACGACGGCCAGTCACGGATGCCAACTCAAACGGAAAATCTATTACTACTTTTTCCTCTAAACAAAGCGCCATCCCACAAACCACTAAATATATTACTGGTATTCTGTCGATGCCGCATAAGAAAGTTATGAGTTCTTCCTCCATTATTGTTGTTGTTGTTGTTGTTGTGATAGGTATCTGAAGAATCTGTGGCTCGATCGTCG；

213bp扩增片段序列：

TGTAAAACGACGGCCAGTCACGGATGCCAACTCAAACGGAAAATCTATTACTACTTTTTCCTCTAAACAAAGCGCCATCCCACAAACCACTAAATATATTACTGGTATTCTGTCGATGCCGCATAAGAAAGTTATGAGTTCTTGCCTCCATTATTGTTGTTGTTGTTGTTGTTGTTGTGATAGGTATCTGAAGAATCTGTGGCTCGATCGTCG。

(3)引物6.3的扩增结果如图30所示；具体地，引物6.3所扩增的片段SSR重复元件为AAG；实施例西藏棕色蘑菇有1个SSR位点，是265bp扩增片段的3次重复AAG；对比例双孢菇As2796有2个SSR位点，一个是264bp扩增片段的2次重复AAG，另一个是274bp扩增片段的6次重复AAG。

264bp扩增片段序列：

TGTAAAACGACGGCCAGTGCCAACGATTACGGTACCCAATATACAAACGTCAACCTTCTTTGTTATTGGTATATATACGAATTTGTAGATGACGAAGTTCATTTAGACAATTTGGTTCGCATAGCCAAATTGCGGGGTCTAGTACAAGTAATCAAGTAAGTAAGAAGGTTTGCACAAATATAAAGAAATGAAGTCACTTTGGATGATTTTGATAAACTGGCAAGATCGTCTCAGGCGCCGGTACGCGGGTGCAATCCAAAGAAG；

265bp扩增片段序列：

TGTAAAACGACGGCCAGTGCCAACGATTACGGTACCCAATATACAAACGTCAACCTTCTTGTTATTGGTATATATACGAATTTGTAGATGACGAAGTTCATTTAGACAATTTGGTTCGCATAGCCAAATTGCGGGGTCTAGTACAGTAATCAAGTAAGTAAGAAGAAGGTTTGCACAAATATAAAGAAATGAAGTCACTTTGGATGATTTTGATAAACTGGCAAGATCGTCTCAGGCGCCGGTACGCGGGTGCAATCCAAAGAAG；

274bp扩增片段序列：

TGTAAAACGACGGCCAGTGCCAACGATTACGGTACCCAATATACAAACGTCAACCTTCTTGTTATTGGTATATATACGAATTTGTAGATGACGAAGTTCATTTAGACAATTTGGTTCGCATAGCCAAATTGCGGGGTCTAGTACAGTAATCAAGTAAGTAAGAAGAAGAAGAAGAAGGTTTGCACAAATATAAAGAAATGAAGTCACTTTGGATGATTTTGATAAACTGGCAAGATCGTCTCAGGCGCCGGTACGCGGGTGCAATCCAAAGAAG。

以上结果利用引物6.1，6.2，6.3可以将对比例6和实施例6有效区分开，引物6.1，6.2，6.3可用来筛选多酚氧化酶活性低的西藏棕色蘑菇。

序列表

<110> 拉萨市高原生物研究所

<120> 一种用于筛选优质西藏棕色蘑菇的DNA条形码、引物及其应用

<160> 51

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 124

<212> DNA

<213> 西藏棕色蘑菇(Agaricus bisporus)

<400> 1

aagccgggta tcatgaagcc gtacatgatt cggaggagag atttcactct gatatatagg 60

aacaatgcaa ctaaagagag agagagaggg tcatgaaacg caaatcggtg acagagaaag 120

acgc 124

<210> 2

<211> 158

<212> DNA

<213> 西藏棕色蘑菇(Agaricus bisporus)

<400> 2

ggtcagggca tacgaacaca acaaatgcct tggttcgttc ttttatctca tttctgctat 60

gcatgctcac attctacttt aggttatagt tcctccatgg ccgactttga aggtagcaca 120

cacacacacc tatacgataa ctctaatcgc gcctaggc 158

<210> 3

<211> 270

<212> DNA

<213> 西藏棕色蘑菇(Agaricus bisporus)

<400> 3

gaggatcatc atacccgcgg gtaagtctta cacacacact tgtttcaact tgactaaaag 60

tgcatttaca gcattgcgtc aatagatttt aaatcacctt atatcgtttc gggatcttca 120

gataaacaca tacgccttgt agatatgaac acgtccagag gatggtcaac gtcttcggag 180

tatgataccc tacccctcgg acttggactt ggagattcat cacctatcgt tacccactgc 240

gggacatatc agccggagga gaggaatctt 270

<210> 4

<211> 213

<212> DNA

<213> 西藏棕色蘑菇(Agaricus bisporus)

<400> 4

gcttcactcg tggtgctact caaggatttg agtttttttt gctttttgtt gagttttttg 60

tatgtactgc tgtggaattg tacttatatg ttgattgtta tgattacgtc tataaatata 120

tatatataaa ttgtggatgt acaacgtttt tctcgatggc attttgaagg caattatagt 180

cgatgaagaa ccaagaggga ggccctggag agt 213

<210> 5

<211> 198

<212> DNA

<213> 西藏棕色蘑菇(Agaricus bisporus)

<400> 5

taccgaattg cccactggtc aagagagagt tgatattcca ggccgaaatc actaccgaca 60

aaaaagcaaa catcaagagg agagcttcaa atacttaata tatatatata tggaccttgt 120

catgaagaaa cactcaccaa aaagaacagt tcgcagaagg agaaacgtat taaacatagc 180

catcgtgatc gttgaagc 198

<210> 6

<211> 261

<212> DNA

<213> 西藏棕色蘑菇(Agaricus bisporus)

<400> 6

cctcaagtga ttcggccaca gacggcgttg agtgagcggg agacgatgga aactgaggtt 60

atcagtgagt ttatcggttt atgatcgatg atcaagtttc catgctgatc gtatatgatt 120

gtgattgtgt gtgtgtgtgc gtgcagagct tttgatacat tcgtacttta atatcgtgaa 180

gcgcgagatg atcgatatgg ttccgaaagc catttcactg aaccttgtta atcattcgaa 240

ggataatttg cagcgcgagc t 261

<210> 7

<211> 273

<212> DNA

<213> 西藏棕色蘑菇(Agaricus bisporus)

<400> 7

aatgcgtgga cgtgctctta cgcgcacttc ggtcactcag tacttacacc cgagtggcag 60

gtgagaataa ttcgctatct gattttattt tgttttccac ctatattatc tctctctctc 120

tctctctctc tctatctttt tttcaaaatt gttgacgtgt taaacatttt ttcgtagctg 180

attatctcga aaccttggag caagactact tacctctcaa acagactgtg acattagtag 240

ataacactgc gtttccgcag taaggtccat tcc 273

<210> 8

<211> 180

<212> DNA

<213> 西藏棕色蘑菇(Agaricus bisporus)

<400> 8

gttgaaatca ggcaagcgca ggtgaatgcc atcagcacag ggccgagaag aaaaaaattt 60

tttgtcccag ccccttttga tatatatata ttagacagcg gtcaacctgc ttcaccccca 120

cgtcctacct tccttttttg gtatcatacc tctgtgcgtg ctcgatggcc tccattcctc 180

<210> 9

<211> 262

<212> DNA

<213> 西藏棕色蘑菇(Agaricus bisporus)

<400> 9

tccggcaatt gaaatgcgtg ggagacaccg gagtaatcaa tcagaggtcg tgtcactctc 60

tcagtgacct tgttaccaat tgccagcatt cgttcaaatc cttcaacaca aggctactct 120

ctctctctct ccacattcaa gaaccaggga caagaaaatc aatatcctca tatcctcaca 180

cgcaagggcg aatcggatac caccttttca gtcataacaa aataacaacg tcgatttctt 240

ttttcgctct caacgcaact ct 262

<210> 10

<211> 147

<212> DNA

<213> 西藏棕色蘑菇(Agaricus bisporus)

<400> 10

gggtcgaagt gtcaggtcag tgaatatata tatatcaggc ctcctactta gctgatgata 60

tgactcgagc tcatgggatt gctgatgttg atggaatcca gaaaatctgg tgatctgaat 120

ttaacttaag acacgtgctc gcttaca 147

<210> 11

<211> 256

<212> DNA

<213> 西藏棕色蘑菇(Agaricus bisporus)

<400> 11

atcctgaacg tgcggaacat actagagcga ctttatgttg atcaatgtag ttccttgaaa 60

agaagacgcg tgtcagttga ggaactctcc atacacgaaa aaaagggaga gagagagaga 120

aaacgaaacg aaacgaaacg caacgaagtg taataaaacg aaaagaaacg aaggaagagg 180

aaatgaaacg cacgaaacga tatcctctgc aatattcaca gcaaattttc caacactcgt 240

ccctccaaac ttctgc 256

<210> 12

<211> 255

<212> DNA

<213> 西藏棕色蘑菇(Agaricus bisporus)

<400> 12

cgccactgaa caggtagagg cacaataaga gagagagaga taaaagcagt gttcgtatga 60

ggaacaagat gaacaaaaag ggcgagcgct aaggtgatca acactttcgc tgtccaagtt 120

tgggagacct tttgtaagta agagtttgga aaatcgctta tgagggcacc ccgtccaact 180

cgttacgatt gcggtccaaa gggtaattaa attgggatct cgcattaagc tcaaaatggg 240

ttcctttccg tcacc 255

<210> 13

<211> 214

<212> DNA

<213> 西藏棕色蘑菇(Agaricus bisporus)

<400> 13

gcacgagcga tatgtcctgt cttgccacaa cggtaacact cctggccacc gccgccacca 60

ccaccaccac cgccactgga gaatccacca gaggcgggag cctgttgagt gcattcgcgg 120

gactgacgcg cacaaagata taagaattct gggcaatgtt ggaacatata atatacacct 180

acaatatgac cctctacacc gcacttgtag cagg 214

<210> 14

<211> 223

<212> DNA

<213> 西藏棕色蘑菇(Agaricus bisporus)

<400> 14

acgccgctta tcaagaccaa aacaggctat ggcagcagca ggctcagttc agacctcgta 60

gtggcatgga catcaaccag cagccccagc agcagcagca gcagcagcct caacaagtga 120

gcctttccca accccacttg ccctccccac ccctctctct cccacatacc tctctccttc 180

cctaccccgc ggccactaac cctttccttg tcgtgggagc ttc 223

<210> 15

<211> 246

<212> DNA

<213> 西藏棕色蘑菇(Agaricus bisporus)

<400> 15

cagacagaga cggccttgag gatggatgat gtttcagaag tcacggtccc caagtcgcaa 60

tatgacgacg acactctacc aaaacatagc gatattcgta taccttgatt ttagaaattt 120

gtattcatga tattttgtgc attagccacc ttcaggttgt acagtacttt gagtgatgat 180

gatgatgatg ttgagcgtcg aagttgctga ctcagcgaat ctcgcggttt gaatggacgc 240

gacctg 246

<210> 16

<211> 191

<212> DNA

<213> 西藏棕色蘑菇(Agaricus bisporus)

<400> 16

cacggatgcc aactcaaacg gaaaatctat tactactttt tcctctaaac aaagcgccat 60

cccacaaacc actaaatata ttactggtat tctgtcgatg ccgcataaga aagttatgag 120

ttcttcctcc attattgttg ttgttgttgt tgttgtgata ggtatctgaa gaatctgtgg 180

ctcgatcgtc g 191

<210> 17

<211> 257

<212> DNA

<213> 西藏棕色蘑菇(Agaricus bisporus)

<400> 17

gccaacgatt acggtaccca atatacaaac gtcaaccttc tttgttattg gtatatatac 60

gaatttgtag atgacgaagt tcatttagac aatttggttc gcatagccaa attgcggggt 120

ctagtacagt aatcaagtaa gtaagaagaa gaagaagaag gtttgcacaa atataaagaa 180

atgaagtcac tttggatgat tttgataaac tggcaagatc gtctcaggcg ccggtacgcg 240

ggtgcaatcc aaagaag 257

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 西藏棕色蘑菇(Agaricus bisporus)

<400> 18

aagccgggta tcatgaagcc 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 西藏棕色蘑菇(Agaricus bisporus)

<400> 19

gcgtctttct ctgtcaccga 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 西藏棕色蘑菇(Agaricus bisporus)

<400> 20

ggtcagggca tacgaacaca 20

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 西藏棕色蘑菇(Agaricus bisporus)

<400> 21

gcctaggcgc gattagagtt 20

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 西藏棕色蘑菇(Agaricus bisporus)

<400> 22

gaggatcatc atacccgcgg 20

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 西藏棕色蘑菇(Agaricus bisporus)

<400> 23

aagattcctc tcctccggct 20

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 西藏棕色蘑菇(Agaricus bisporus)

<400> 24

gcttcactcg tggtgctact 20

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 西藏棕色蘑菇(Agaricus bisporus)

<400> 25

actctccagg gcctcaatct 20

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 西藏棕色蘑菇(Agaricus bisporus)

<400> 26

taccgaattg cccactggtc 20

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 西藏棕色蘑菇(Agaricus bisporus)

<400> 27

gcttcaacga tcacgatggc 20

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> 西藏棕色蘑菇(Agaricus bisporus)

<400> 28

cctcaagtga ttcggccaca 20

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> 西藏棕色蘑菇(Agaricus bisporus)

<400> 29

agctcgcgct gcaaattatc 20

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> 西藏棕色蘑菇(Agaricus bisporus)

<400> 30

aatgcgtgga cgtgctctta 20

<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> 西藏棕色蘑菇(Agaricus bisporus)

<400> 31

ggaatggacc ttactgcgga 20

<210> 32

<211> 20

<212> DNA

<213> 西藏棕色蘑菇(Agaricus bisporus)

<400> 32

gttgaaatca ggcaagcgca 20

<210> 33

<211> 20

<212> DNA

<213> 西藏棕色蘑菇(Agaricus bisporus)

<400> 33

gaggaatgga ggccatcgag 20

<210> 34

<211> 20

<212> DNA

<213> 西藏棕色蘑菇(Agaricus bisporus)

<400> 34

tccggcaatt gaaatgcgtg 20

<210> 35

<211> 20

<212> DNA

<213> 西藏棕色蘑菇(Agaricus bisporus)

<400> 35

agagttgcgt tgagagcgaa 20

<210> 36

<211> 20

<212> DNA

<213> 西藏棕色蘑菇(Agaricus bisporus)

<400> 36

gggtcgaagt gtcaggtcag 20

<210> 37

<211> 20

<212> DNA

<213> 西藏棕色蘑菇(Agaricus bisporus)

<400> 37

tgtaagcgag cacgtgtctt 20

<210> 38

<211> 20

<212> DNA

<213> 西藏棕色蘑菇(Agaricus bisporus)

<400> 38

atcctgaacg tgcggaacat 20

<210> 39

<211> 20

<212> DNA

<213> 西藏棕色蘑菇(Agaricus bisporus)

<400> 39

gcagaagttt ggagggacga 20

<210> 40

<211> 20

<212> DNA

<213> 西藏棕色蘑菇(Agaricus bisporus)

<400> 40

cgccactgaa caggtagagg 20

<210> 41

<211> 20

<212> DNA

<213> 西藏棕色蘑菇(Agaricus bisporus)

<400> 41

ggtgacggaa aggaacccat 20

<210> 42

<211> 20

<212> DNA

<213> 西藏棕色蘑菇(Agaricus bisporus)

<400> 42

gcacgagcga tatgtcctgt 20

<210> 43

<211> 20

<212> DNA

<213> 西藏棕色蘑菇(Agaricus bisporus)

<400> 43

cctgctacaa gtgcggtgta 20

<210> 44

<211> 20

<212> DNA

<213> 西藏棕色蘑菇(Agaricus bisporus)

<400> 44

acgccgctta tcaagaccaa 20

<210> 45

<211> 20

<212> DNA

<213> 西藏棕色蘑菇(Agaricus bisporus)

<400> 45

gaagctccca cgacaaggaa 20

<210> 46

<211> 20

<212> DNA

<213> 西藏棕色蘑菇(Agaricus bisporus)

<400> 46

cagacagaga cggccttgag 20

<210> 47

<211> 20

<212> DNA

<213> 西藏棕色蘑菇(Agaricus bisporus)

<400> 47

caggtcgcgt ccattcaaac 20

<210> 48

<211> 20

<212> DNA

<213> 西藏棕色蘑菇(Agaricus bisporus)

<400> 48

cacggatgcc aactcaaacg 20

<210> 49

<211> 20

<212> DNA

<213> 西藏棕色蘑菇(Agaricus bisporus)

<400> 49

cgacgatcga gccacagatt 20

<210> 50

<211> 20

<212> DNA

<213> 西藏棕色蘑菇(Agaricus bisporus)

<400> 50

gccaacgatt acggtaccca 20

<210> 51

<211> 20

<212> DNA

<213> 西藏棕色蘑菇(Agaricus bisporus)

<400> 51

cttctttgga ttgcacccgc 20

Claims (10)

1.用于筛选优质西藏棕色蘑菇的DNA条形码，其特征在于，包含核苷酸序列如SEQ IDNO：1～17所示的17个DNA片段中的一个或多个。

2.用于筛选优质西藏棕色蘑菇的DNA条形码扩增引物，其特征在于，包含上下游核苷酸序列分别如SEQ ID NO：18～51所示的17对引物中的一对或多对。

3.权利要求1所述的DNA条形码或权利要求2所述DNA条形码扩增引物在筛选或辅助选育优质西藏棕色蘑菇品种中的应用。

4.一种筛选优质西藏棕色蘑菇品种的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1.提取待测样品基因组DNA；

S2.以S1基因组DNA为模板，根据性状筛选需求，选择权利要求2所述的扩增引物中的一对或多对分别进行PCR扩增反应；

S3.将S2的PCR扩增产物经毛细管荧光电泳检测，通过扩增产物的片段数、SSR位点数、SSR重复元件及其重复次数进行判定。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤S2所述PCR扩增反应的体系为2×TaqPCR Master Mix 5μL，模板1μL，上游引物0.1μL，下游引物0.4μL，浓度10μM带荧光的M13引物0.4μL，用无菌的去离子水定容至10μL。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤S2所述PCR扩增反应的程序为95℃预变性3min；95℃变性30s，62至55℃降落PCR退火30s，72℃延伸30s，共10个循环；95℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，共25个循环；72℃终延伸20min；4℃保温6h。

7.权利要求1所述的DNA条形码或权利要求2所述DNA条形码扩增引物在制备用于筛选优质西藏棕色蘑菇品种的产品中的应用。

8.一种用于筛选优质西藏棕色蘑菇的产品，其特征在于，包含用于检测权利要求1所述的DNA条形码的扩增引物。

9.根据权利要求8所述的产品，其特征在于，包含上下游核苷酸序列分别如SEQ ID NO：18～51所示的17对引物中的一对或多对。

10.根据权利要求8所述的产品，其特征在于，还包含用于PCR扩增反应和用于荧光毛细管电泳检测所需的试剂。

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