CN105255882A

CN105255882A - 双孢蘑菇ssr分子标记特异引物体系及其应用

Info

Publication number: CN105255882A
Application number: CN201510807179.6A
Authority: CN
Inventors: 付永平; 王新新; 李玉; 王�琦; 李丹; 宋冰; 张春兰; 苏文英; 戴月婷; 郭毓秀; 段明正; 刘源
Original assignee: Jilin Agricultural University
Current assignee: Jilin Agricultural University
Priority date: 2015-11-22
Filing date: 2015-11-22
Publication date: 2016-01-20
Anticipated expiration: 2035-11-22
Also published as: CN105255882B

Abstract

本发明公开了8个新SSR分子标记和2个已有SSR分子标记的有效组合，并将它们应用于菌种鉴定。以22个特异菌株的DNA为模板，分别利用10对SSR引物进行PCR扩增，每对引物扩增后进行丙烯酰胺凝胶电泳，根据22个样品扩增出的所有电泳条带进行带型统计分析，从而确定每对引物的标准带型。然后将每个样品的10对引物的标准带型进行组合，构建双孢蘑菇22个不同菌株的分子身份证。本发明提高了双孢蘑菇菌种鉴定的效果，对于双孢蘑菇的资源鉴定、保护和开发利用具有重要意义。

Description

双孢蘑菇SSR分子标记特异引物体系及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及双孢蘑菇SSR分子标记特异引物体系及其应用。

技术背景

双孢蘑菇(Agaricusbisporus)的人工栽培迄今已有300多年的历史,是当今世界上第一大宗食用菌。因其味道鲜美、营养丰富,深受人们的喜爱,在世界各地广为栽培,尤其是近几年来,双孢蘑菇的商业化、规模化栽培模式发展更是迅速。双孢蘑菇在我国福建等省已有大规模的规范化栽培,国内出口量已占世界第一位。

随着人们对食用菌营养价值和药用价值认识的提高，食用菌的遗传研究已成为关注的热点之一。近年来，分子生物学和生物技术的迅速发展，遗传标记技术也得到了迅猛的发展。而食用菌最早是采用形态学特征为分类依据，虽然形态特征能在一定程度上进行很好的类群的划分，但子实体的形态特征易受外界环境条件的影响，因而很不稳定。形态鉴别不能准确反映被鉴定物种的分类地位，还需要辅助其他试验才能将菌株鉴别清楚。同时，食用菌中同物异名的现象非常严重，严重的影响双孢蘑菇的生产和知识产权的保护，极大地损害了育种者和生产者的利益。因此，利用分子标记技术对双孢蘑菇的菌种进行分子水平的鉴定，结合农艺性状进行综合分析，对双孢蘑菇的菌种利用和保护，以及功能基因的开发具有重要的意义。目前，国外针对双孢蘑菇的SSR分子标记只有33对，国内还没有针对双孢蘑菇遗传多样性和菌种鉴定的专用SSR分子标记。

发明内容

本发明的目的是为了解决双孢蘑菇同物异名、异物同名的问题，而提供一种双孢蘑菇SSR分子标记特异引物体系及其应用。

双孢蘑菇SSR分子标记特异引物体系，序列如下所示：

1）AbSSR034：F-TCAACGCTCTCTTCCAACCT；R-GCGGGCAGAGATCTTGTTAC；

2）AbSSR035：F-GGCGTTCTGAATGATGATGA；R-AGCGTGTTTGGATGTGTTTG；

3）AbSSR005：F-CTCTGGGATATGGACGAGGA；R-CCTCTTCACCTTGACCCTCA；

4）AbSSR013：F-GACTGCCTGATTGACGGATT；R-TCCGACTCCGACATCCTATC；

5）AbSSR015：F-CTCGAGTCGACGAAGGAAAC；R-TCCTCGGTTTCGACTGTACC；

6）AbSSR016：F-TGTCTGGTTTTGCTCACGTC；R-TCAGCACACTTAATCGCACA；

7）AbSSR018：F-TGGCTCTTTACAGCCTTGGT；R-TGCAGATGTGGTAGGAGTTTTG；

8）AbSSR084：F-CGACCCATCATCAACTTCCT；R-AACGAGGGAAAGGTCGATTT；

9）AbSSR6：F-ACCACATTCTGGAAAACGAA；R-TTAATGCTCTTGGCTTCGAC；

10）AbSSR36：F-CGTTGATGGAGTTGACTGAG；R-ACAACAAAATCGTCGTGAGG。

本发明的又一个目的是提供一种双孢蘑菇SSR分子标记特异引物体系在菌种鉴定方面的应用。

本发明提供了8个新SSR分子标记和2个已有SSR分子标记的有效组合，并将它们应用于菌种鉴定。以22个特异菌株的DNA为模板，分别利用10对SSR引物进行PCR扩增，每对引物扩增后进行丙烯酰胺凝胶电泳，根据22个样品扩增出的所有电泳条带进行带型统计分析，从而确定每对引物的标准带型。然后将每个样品的10对引物的标准带型进行组合，构建双孢蘑菇22个不同菌株的分子身份证。本发明对于双孢蘑菇的资源鉴定、保护和开发利用具有重要意义。

附图说明

图1AbSSR034和AbSSR035产生的带型(AbSSR034泳道为菌株CCMJA3；AbSSR035泳道为菌株CCMJA3)；

图2AbSSR005产生的带型（泳道依次为菌株CCMJA7、CCMJA6、CCMJA41、CCMJA27、CCMJA43、CCMJA44、CCMJA47、CCMJA54、CCMJA57、CCMJA58）；

图3AbSSR013产生的带型（泳道依次为菌株CCMJA17、CCMJA3、CCMJA14、CCMJA56、CCMJA21、CCMJA44、CCMJA39、CCMJA47、CCMJA58）；

图4AbSSR015产生的带型（泳道依次为菌株CCMJA4、CCMJA2、CCMJA15、CCMJA51、CCMJA44、CCMJA9、CCMJA47、CCMJA57）；

图5AbSSR016产生的带型（泳道依次为菌株CCMJA5、CCMJA48、CCMJA13、CCMJA29、CCMJA33、CCMJA43、CCMJA47、CCMJA57、CCMJA58、CCMJA59）；

图6AbSSR018产生的带型（泳道依次为菌株CCMJA7、CCMJA3、CCMJA47、CCMJA29、CCMJA54、CCMJA58）；

图7AbSSR084产生的带型（泳道依次为菌株CCMJA3、CCMJA22、CCMJA29、CCMJA57、CCMJA58）；

图8AbSSR6产生的带型（泳道依次为菌株CCMJA3、CCMJA7、CCMJA54、CCMJA29、CCMJA44、CCMJA47）；

图9AbSSR36产生的带型（泳道依次为菌株CCMJA7、CCMJA18、CCMJA3、CCMJA32、CCMJA27、CCMJA47、CCMJA57）。

具体实施方式

实施例1双孢蘑菇EST-SSR标记引物的开发

一、SSR引物设计和合成：

从JGI数据库中双孢蘑菇H97基因组数据(version2.0)(http://genome.jgi-psf.org/.)搜索并下载，利用MISA(http://pgrc.ipk-gatersleben.de/tools.php)搜索SSR，搜索标准为：二、三、四、五、六核苷酸的最少重复次数大于等于5次。

利用引物设计软件Primer3.0在含有SSR位点的序列中设计引物。SSR引物设定参数为：(1)GC含量为45%-60%；(2)退火温度为60℃；(3)预期片段长度在150-300bp之间；(4)引物长度在18-27bp之间。

二、SSR引物的筛选

(1)利用康为世纪的基因组提取试剂盒提取待鉴定样品总DNA；

(2)利用随机的10个双孢蘑菇菌株对设计的SSR分子标记引物进行初筛：以步骤(1)提取的总DNA为模板，利用上述设计的100对引物进行PCR扩增。PCR反应用BioRadPCR仪。PCR扩增条件如下:95℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共计30个循环；72℃延伸l0min。PCR采用20μL反应体系：DNA20-50ng，10×缓冲液2.0uL，2.5mM的dNTPs2.0uL，Taq酶0.25μL，浓度为10uM的上游引物溶液0.3μL，浓度为10uM的下游引物0.3μL，添加ddH2O至体系体积为20uL；

(3)将步骤(2)PCR扩增后的产物进行8%聚丙烯酰胺凝胶，电泳后利用硝酸银进行银染显影。具体步骤如下：将步骤(2)中PCR扩增后的产物与上样缓冲液混匀后，取0.5μL点样，进行电泳分离，电极缓冲液为1×TBE(TriS-硼酸)，在25℃、240V恒压下电泳1-1.5h。电泳完毕后，用ddH2O先清洗胶板两次，然后用硝酸银溶液缓慢摇动并固定5-8分钟，然后用ddH₂O漂洗2次；将漂洗后的胶板用含有1.5%氢氧化钠和0.5%甲醛的溶液染色5-8分钟；缓慢摇动，直到条带清晰，然后用ddH₂O漂洗，晾干，照相记录。上述电泳在核酸电泳系统(Bio-Rad，USA)中进行；

（4）然后观察记录成像结果，选取条带清晰稳定、多态性好的SSR引物进行复筛。复筛利用全世界收集到的59个双孢蘑菇菌株（表3）为基本群体，选取10对SSR分子标记引物鉴定收集到的59个菌株中有多少个菌株是不同的，按照初筛的PCR条件和体系进行PCR和电泳实验，根据电泳条带的观察记录成像结果，判定菌株的异同。最终从53个SSR分子标记（表1）选取10对引物（表2）进行菌种身份证的构建。

表1有多态性的53个SSR分子标记

表210个SSR分子标记特征

表3双孢蘑菇菌种信息

实施例2双孢蘑菇SSR标记引物在品种鉴定中的应用

选出多态性的和特异性好的10对SSR分子标记对上述筛选出的不同的菌株进行电子分子身份证的构建。具体步骤如下：

1）每个引物59个菌株的PCR产物同样进行步骤（3）中的8%聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后统计不同电泳带型，确定59个菌株是否为同一个菌株。结果表明59个菌株中有22个特异菌株，其余分不开的37个菌株分成7类：

第一类：与CCMJA29相同的菌株为CCMJA9、CCMJA21；

第二类：与CCMJA33相同的菌株为CCMJA6；

第三类：与CCMJA22相同的菌株为CCMJA1、CCMJA2、CCMJA11、CCMJA13、CCMJA14、CCMJA36；

第四类：与CCMJA16相同的菌株为CCMJA4、CCMJA5、CCMJA8、CCMJA10、CCMJA12、CCMJA17、CCMJA19、CCMJA20、CCMJA24、CCMJA26、CCMJA34；

第五类：与CCMJA15相同的菌株为CCMJA25、CCMJA28、CCMJA48；

第六类：与CCMJA27相同的菌株为CCMJA37、CCMJA40、CCMJA51、CCMJA52、CCMJA56；

第七类：与CCMJA3相同的菌株为CCMJA30、CCMJA38、CCMJA41、CCMJA45、CCMJA46、CCMJA49、CCMJA50、CCMJA53、CCMJA55。

2）以22个特异菌株的DNA为模板，分别利用10对SSR引物进行PCR扩增，每对引物扩增后进行丙烯酰胺凝胶电泳，根据22个样品扩增出的所有电泳条带进行带型统计分析，从而确定每对引物的标准带型。然后将每个样品的10对引物的标准带型进行组合，构建双孢蘑菇22个不同菌株的分子身份证，因此每个菌株的分子身份证由10位数字组成，分别对应本发明所提供的10对SSR分子标记引物组合产生的条带类型，引物先后顺序依次分别是AbSSR034、AbSSR035、AbSSR005、AbSSR013、AbSSR015、AbSSR016、AbSSR018、AbSSR084、AbSSR6和AbSSR36，10对引物对22个菌株进行扩增后共产生62种不同带型。不同菌株的分子身份证标示方法具体如下：

每个菌株的第一位和第二位是AbSSR034和AbSSR035产生的带型：22个菌株利用AbSSR034和AbSSR035扩增后均产生1种带型，则所有菌株的分子身份证的第一位和第二位数字均为1（见图1），例如菌株CCMJA3的分子身份证的前两位数字为1和1；

每个菌株的第三位是AbSSR005产生的带型：22个菌株扩增后产生10种带型，我们将每种带型分别编号1、2、3、4、5、6、7、8、9、0（见图2），因此菌株分子身份证的第三位数字是该菌株利用此引物扩增出现的带型所对应的编号，例如菌株CCMJA3用AbSSR005扩增出第三种带型，因此其电子身份证的第三位数字为3；

每个菌株的第四位是AbSSR013产生的带型：22个菌株扩增后产生8种带型，每种带型分别编号1-8（见图3），因此菌株分子身份证第四位数字是该菌株利用此引物扩增出现的带型所对应的编号，例如菌株CCMJA3用AbSSR013扩增出第二种带型，因此其分子身份证的第四位数字为2；

每个菌株的第五位是AbSSR015产生的带型：22个菌株扩增后产生8种带型，每种带型分别编号1-8（见图4），因此菌株分子身份证第五位数字是该菌株利用此引物扩增出现的带型所对应的编号，例如菌株CCMJA3用AbSSR015扩增出第三种带型，因此其分子身份证的第五位数字为3；

每个菌株的第六位是AbSSR016产生的带型：22个菌株扩增后产生10种带型，每种带型分别编号1-0（见图5），因此菌株分子身份证第六位数字是该菌株利用此引物扩增出现的带型所对应的编号，例如菌株CCMJA3用AbSSR016扩增出第二种带型，因此其分子身份证的第六位数字为2；

每个菌株的第七位是AbSSR018产生的带型：22个菌株扩增后产生6种带型，每种带型分别编号1-6（见图6），因此菌株分子身份证第七位数字是该菌株利用此引物扩增出现的带型所对应的编号，例如菌株CCMJA3用AbSSR018扩增出第二种带型，因此其分子身份证的第七位数字为2；

每个菌株的第八位是AbSSR084产生的带型：22个菌株扩增后产生5种带型，每种带型分别编号1-5（见图7），因此菌株分子身份证第八位数字是该菌株利用此引物扩增出现的带型所对应的编号，例如菌株CCMJA3用AbSSR084扩增出第一种带型，因此其分子身份证的第八位数字为1；

每个菌株的第九位是AbSSR6产生的带型：22个菌株扩增后产生6种带型，每种带型分别编号1-6（见图8），因此菌株分子身份证的第九位数字是该菌株利用此引物扩增出现的带型所对应的编号，例如菌株CCMJA3用AbSSR06扩增出第一种带型，因此其分子身份证的第九位数字为1；

每个菌株的第十位是AbSSR36产生的带型：22个菌株扩增后产生7种带型，每种带型分别编号1-7（见图9），因此菌株分子身份证第十位数字是该菌株利用此引物扩增出现的带型所对应的编号，例如菌株CCMJA3用AbSSR036扩增出第三种带型，因此其分子身份证的第十位数字为3。

因此菌株CCMJA3的分子身份证为1132322113，其他菌株的分子身份证亦按照此方法标示，表4是根据10对SSR标记引物对22个双孢蘑菇不同菌株编制的分子电子身份证。

表422个双孢蘑菇菌株的电子分子身份证

上述所用PCR和电泳试剂均购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司。其他操作如无特别说明均为本领域常用技术。

<110>吉林农业大学

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Claims

1.双孢蘑菇SSR分子标记特异引物体系，序列如下所示：

1）AbSSR034：F-TCAACGCTCTCTTCCAACCT；R-GCGGGCAGAGATCTTGTTAC；

2）AbSSR035：F-GGCGTTCTGAATGATGATGA；R-AGCGTGTTTGGATGTGTTTG；

3）AbSSR005：F-CTCTGGGATATGGACGAGGA；R-CCTCTTCACCTTGACCCTCA；

4）AbSSR013：F-GACTGCCTGATTGACGGATT；R-TCCGACTCCGACATCCTATC；

5）AbSSR015：F-CTCGAGTCGACGAAGGAAAC；R-TCCTCGGTTTCGACTGTACC；

6）AbSSR016：F-TGTCTGGTTTTGCTCACGTC；R-TCAGCACACTTAATCGCACA；

7）AbSSR018：F-TGGCTCTTTACAGCCTTGGT；R-TGCAGATGTGGTAGGAGTTTTG；

8）AbSSR084：F-CGACCCATCATCAACTTCCT；R-AACGAGGGAAAGGTCGATTT；

9）AbSSR6：F-ACCACATTCTGGAAAACGAA；R-TTAATGCTCTTGGCTTCGAC；

10）AbSSR36：F-CGTTGATGGAGTTGACTGAG；R-ACAACAAAATCGTCGTGAGG。

2.根据权利要求1所述的双孢蘑菇SSR分子标记特异引物体系，其特征在于：在菌种鉴定方面的应用。