CN104560973A - 一种获得辣椒疫病抗性候选基因及分子标记的方法及应用 - Google Patents

Abstract

一种获得辣椒疫病抗性候选基因及分子标记的方法及应用，该方法是一种利用辣椒疫病转录组和全基因组测序数据信息、差异表达基因鉴定、生物信息学分析、分子标记开发以及疫霉菌接种鉴定来获得辣椒疫病抗病候选基因，属于辣椒生物技术领域。该方法包括辣椒高抗、高感疫病材料构建的F₂群体接种疫霉菌后获得的疫病抗、感基因池转录组测序、差异基因表达分析和功能注释、辣椒疫病高抗、高感材料基因组DNA提取、引物设计和PCR扩增、序列差异分析和SNP位点鉴定、SNP特异引物设计及有效性验证等步骤，高效的获得辣椒疫病抗性候选基因及分子标记。该发明可以精准地鉴定出辣椒疫病抗性候选基因及开发有效的分子标记。

Description

一种获得辣椒疫病抗性候选基因及分子标记的方法及应用

技术领域

本发明属于辣椒生物技术领域，具体涉及一种获得辣椒疫病抗性候选基因及分子标记的方法及应用，主要通过辣椒疫病转录组测序、差异基因表达分析和功能注释、基因组DNA提取、PCR扩增、扩增序列差异分析和SNP位点鉴定、SNP引物设计及有效性验证，进而获得辣椒疫病抗性候选基因及分子标记，该方法适用于辣椒疫病抗性基因鉴定及分子标记辅助选择育种。

背景技术

辣椒(Capsicum spp.)是世界上最重要的蔬菜作物之一，品种多，产量高，营养丰富，用途广泛，在人们的日常生活中具有重要的作用。在中国，辣椒种植业经过几十年的发展，已经成为我国第二大蔬菜作物，据联合国粮农组织的统计数据显示，2012年我国辣椒年播种面积为75万公顷，年产鲜椒和干椒1631万吨，播种面积和产量均居世界首位。目前，辣椒已成为我国设施栽培中重要的经济作物之一，在重点产区已经成为当地种植业中农民增收的支柱产业。

但生产中诸多不利因素(如生物胁迫和非生物胁迫)，制约了辣椒种植业的发展。目前，疫病(Phytophthora capsici Leon)已成为我国辣椒生产上的最重要病害，分布极为广泛，危害十分严重。辣椒疫病是由疫霉菌引起的真菌性病害，自1918年在美国新墨西哥首次报道之后，我国也于20世纪50年代在江苏发现，至今疫病几乎蔓延至全国各辣椒主产区，且有逐年加重的趋势，每年引起的产量损失高达30％～80％。由于辣椒疫病发生的普遍性和所引起病害的严重性，而且传播途径多样，病害发生常呈现暴发性，导致生产上还没有出现有效防治疫病的方法。因此，加强疫病的防治对于保证辣椒稳产、高产有着重要的作用。

为了有效的防治辣椒疫病的发生，选择抗病品种是一种最经济、安全、可靠的方法。但采用传统育种手段进行优良辣椒抗病品种的选育，存在工作量大、育种周期长、选择效率较低等缺点，而随着农业生物技术的快速发展，借助分子标记辅助选择技术可以大大提高育种效率。目前，国内外研究者已经定位了多个辣椒疫病抗性性状QTL位点和鉴定出一个抗病相关基因CaRGA2，并在此基础上开发了相关分子标记，如D₀₄SCAR、SSR-9、P5-SNAP和RGA-STS₁₂₀₀等。但由于不同研究者所利用的抗、感材料和疫霉菌菌株不完全相同，使得获得的这些QTL并不能得到相互佐证，而基于QTL和抗病相关基因开发的相关分子标记由于连锁性不够紧密以及标记自身的特征使其有效性和通用性并不高，一定程度上制约着辣椒疫病抗性品种的选育进程。

如何快速、有效的鉴定获得辣椒疫病抗性候选基因，开发基于基因本身序列特征的分子标记，是开展辣椒疫病抗性基因克隆及分子标记辅助选择育种的前提，对于开展辣椒疫病抗性基因工程育种具有重要的作用。转录组测序(RNA-Seq)是指利用高通量测序技术对组织或细胞中所有的mRNA反转录的cDNA进行测序，全面快速地获得某一物种特定组织在某一状态下的所有转录本。RNA-Seq技术最重要的一个应用就是它能对所有检测到的基因进行表达量的分析，可以分析不同样品转录组基因的表达差异，所以能更加准确和高效的大量发现低丰度表达的新基因，目前已在多种作物中被应用于新基因挖掘研究。

随着测序技术的不断发展，目前辣椒全基因组测序工作已完成，相应的测序数据也已公布。而通过辣椒接种疫霉菌后的转录组数据分析，结合辣椒全基因组数据信息，为辣椒疫病抗性候选基因鉴定奠定了良好的科研基础。因此，通过转录组和基因组数据信息，利用生物信息学技术开展辣椒疫病抗性候选基因的挖掘及鉴定研究，开发基于抗性基因自身序列特点的特异性分子标记，进而用于辣椒疫病分子标记辅助选择育种，可以改变目前辣椒疫病相关分子标记有效性和通用性不高以及抗性相关基因鉴定严重不足的现状，将大大提高辣椒疫病抗性品种的选育效率。

发明内容

解决的技术问题：本发明的目的是通过利用辣椒转录组和基因组数据信息，结合生物信息学和分子生物学技术获得辣椒疫病抗性候选基因及分子标记的方法及应用。该方法可以精准地挖掘到辣椒疫病抗性候选基因，可进一步用于辣椒疫病抗性候选基因功能验证以及分子标记辅助选择育种，加快辣椒育种进程，同时也可以为其他作物的抗病候选基因鉴定及分子标记开发研究提供参考。

技术方案：本发明提供了一种通过利用辣椒转录组和基因组数据信息，结合生物信息学和分子生物学技术获得辣椒疫病抗性候选基因及分子标记的方法。其过程是对辣椒疫病高抗、高感材料杂交、自交获得的F₂群体进行疫霉菌接种，取接种后不同时间段的抗、感基因池材料进行转录组测序，获得辣椒疫病抗性差异表达基因序列，经差异基因功能注释和序列比对辣椒基因组数据库，获得差异表达基因及辣椒疫病抗性相关基因完整的开发阅读框(ORF)，针对ORF序列特点设计引物，对高抗和高感辣椒疫病材料进行扩增，扩增产物进行回收、测序，进一步分析疫病抗性相关基因序列在高抗和高感辣椒材料中的差异，找出差异的SNP位点，然后根据SNP位点特征再设计特异的SNP引物对具有不同疫病抗性能力的辣椒材料以及高抗、感材料构建的F₂群体进行扩增，结合疫霉菌接种结果分析所设计的SNP引物的有效性，最终获得辣椒疫病抗性候选基因及分子标记。具体步骤如：

1)辣椒转录组测序：利用辣椒高抗和高感疫病材料杂交获得F₁，F₁自交获得F₂，对F₂群体进行辣椒疫霉菌接种，分别采集F₂群体接种0天和5天后的样品备用。接种辣椒疫霉菌10天后，调查F₂群体发病情况，分别选取15株辣椒高抗和高感疫病单株构建辣椒疫病抗、感基因池，命名为KC0(抗池对照)、KC5(接种5天后的抗池)、GC0(感池对照)和GC5(接种5天后的感池)，利用Illumina HiSeq^TM2000对抗、感池基因池分别进行转录组测序。

2)差异基因表达分析：利用生物学软件对4个基因池的测序数据进行合并组装，首先将各样品数据进行低质量过滤，使Q20达到99％以上，再将过滤后各样品数据合并在一起根据相似度进行聚类，在聚类单元中选取最长的序列作为Unigene序列，完成Unigene库的构建，利用RPKM值反映对应Unigenes的表达丰度，再利用生物学软件EBSeq筛选出在辣椒疫病抗、感池之间差异表达的基因。

3)差异基因功能注释：使用BLAST软件对筛选到的差异表达基因进行数据库比对，获得差异表达基因的注释信息，并进一步筛选出与辣椒疫霉病抗性相关的基因片段。然后利用上述基因片段，在辣椒全基因组数据库中进行BLAST比对，获得差异表达基因完整的开放阅读框(ORF)。

4)SNP位点的鉴定：针对所获得的差异表达基因ORF的序列特征，利用生物学软件设计特异引物，对具有不同疫病抗性能力的辣椒材料进行扩增，扩增产物经琼脂糖电泳后，回收、克隆并测序。利用生物学软件对具有不同疫病抗性能力的辣椒材料的扩增产物进行序列比对，找出在高抗和高感疫病辣椒材料中的SNP位点。

5)辣椒疫病抗病分子标记的开发及应用：针对在具有不同疫病抗性能力的辣椒材料中所鉴定到的SNP位点，利用生物学软件设计特异SNP标记，对高抗和高感疫病材料以及杂交自交获得的F₂群体和具有不同疫病抗性能力的辣椒材料进行扩增，SNP标记扩增结果结合上述材料的疫霉菌接种鉴定结果，筛选出只在高抗材料中扩增出条带，而在感病材料中无扩增条带的引物，此类引物对应的基因即为辣椒疫病抗性候选基因。

有益效果

1)首次利用辣椒疫病抗、感基因池接种疫霉菌后的转录组和全基因组数据库信息进行辣椒疫病抗性候选基因的鉴定。该发明利用生物信息学软件根据辣椒抗、感疫病基因池的转录组数据，筛选出抗、感基因池接种辣椒疫霉菌前后差异显著表达的基因，此方法提供的数据信息量大，较以往的差异基因鉴定方法如DDRT、cDNA-AFLP等技术具有明显的优势，可以更加准确地鉴定出抗病相关基因。同时，该发明的技术路线也可以为其他作物抗病基因的挖掘及分子标记的开发提供参考。

2)辣椒(Capsicum annuum L.)属茄科辣椒属，是一种被广泛种植的重要蔬菜作物。但生产中诸多不利因素(如生物胁迫和非生物胁迫)，制约了辣椒种植业的发展。目前，疫病(Phytophthora capsici Leon)已成为我国辣椒生产上的最重要病害，分布极为广泛，危害十分严重。仅采用常规育种手段选育新品种不仅耗时耗力、效率低，且难以使新品种在抗性和品质等方面有显著提高。利用本发明方法可快速鉴定出辣椒疫病抗性候选基因及分子标记，用于辣椒疫病的分子标记辅助选择育种，可以大大缩短辣椒疫病抗性品种的选育进程，满足辣椒产业化对品种更新换代加速的要求。

3)本发明是建立在辣椒疫病抗、感基因池转录组测序、差异基因鉴定、辣椒全基因组数据库搜索、生物信息学软件利用、SNP分子标记开发及验证等系统研究工作基础上的。通过辣椒转录组和全基因组数据信息的利用，可以高效的鉴定出辣椒疫病抗性差异表达基因。通过生物信息学软件进行序列比对、SNP引物开发及验证能准确地获得辣椒疫病抗性候选基因及分子标记，可以直接应用于候选的基因表达特征和功能分析研究以及辣椒疫病抗性材料的筛选及抗病品种的选育，创制新的抗病种质资源。总之，本方法具有坚实的理论依据，科学性强、方法简便，易于操作和实际应用。

附图说明

图1辣椒疫病抗性候选基因及分子标记获得的技术流程图；

图2辣椒疫病高抗、感材料构建的F₂群体接种疫霉菌后的发病情况图；

图3差异表达基因的蛋白质功能预测结果示意图；

图4辣椒疫病高抗、感材料的SNP位点鉴定图；

图5分子标记的有效性验证图。

具体实施方式

实施例1

辣椒(Capsicum spp.)是世界上最重要的蔬菜作物之一，在中国已成为第二大蔬菜作物。目前，辣椒是我国设施栽培中重要的经济作物之一，在重点产区已经成为当地种植业中农民增收的支柱产业。但生产中诸多不利因素，制约了辣椒种植业的发展。目前，疫病(Phytophthoracapsici Leon)已成为我国辣椒生产上的最重要病害，分布极为广泛，危害十分严重。

由于辣椒疫病发生的普遍性和所引起病害的严重性，而且传播途径多样，病害发生常呈现暴发性，导致生产上还没有出现有效防治疫病的方法。为了有效的防治辣椒疫病的发生，选择抗病品种是一种最经济、安全、可靠的方法。但采用传统育种手段进行优良辣椒抗病品种的选育，存在工作量大、育种周期长、选择效率较低等缺点，而随着农业生物技术的快速发展，借助分子标记辅助选择技术可以大大提高育种效率。我们应用本发明的方法，结合辣椒转录组和全基因组测序数据库可以高效的获得辣椒疫病抗性候选基因，利用生物信息学软件开发SNP分子标记，获得的辣椒疫病抗性候选基因分子标记能有效地用于辣椒疫病抗性育种。

本实例以辣椒高抗疫病材料CM334、K01、K43和K44以及高感疫病材料G29、G34和G35作为研究试材，采用本发明方法可以高效的获得辣椒疫病抗性候选基因及分子标记。实施过程如下：

1)辣椒转录组测序：利用辣椒高抗疫病材料(K43)和高感疫病材料(G29)杂交获得F₁，F₁自交获得F₂，对F₂群体进行辣椒疫霉菌接种，分别采集F₂群体接种0天和5天后的样品备用。接种辣椒疫霉菌10天后，调查F₂群体发病情况(图1)，分别选取15株辣椒高抗和高感疫病单株构建辣椒疫病抗、感基因池，命名为KC0(抗池对照)、KC5(接种5天后的抗池)、GC0(感池对照)和GC5(接种5天后的感池)，利用Illumina HiSeq^TM2000对抗、感池分别进行转录组测序。

2)差异基因表达分析：利用生物信息学软件对4个基因池的测序数据进行合并组装，首先将各样品数据进行低质量过滤，使Q20达到99％以上，再将过滤后各样品数据合并在一起根据相似度进行聚类，在聚类单元中选取最长的序列作为Unigene序列，完成Unigene库的构建，利用RPKM值反映对应Unigenes的表达丰度，再利用生物信息学软件EBSeq筛选出在辣椒疫病抗、感基因池之间差异表达的基因，共获得了476个差异表达基因。

3)差异基因功能注释：在NCBI网站上使用Blastn、Blastp和InterProscan软件对筛选到的差异表达基因进行数据库比对，获得差异表达基因的注释信息和蛋白质功能预测结果(图2)，根据注释信息和蛋白质功能预测结果进一步筛选出与辣椒疫病抗性相关的差异表达基因及辣椒疫病抗性相关基因46个。然后利用上述46基因片段，在辣椒全基因组数据库(http://peppergenome.snu.ac.kr和http://peppersequence.genomics.cn)中进行Blastn比对，获得辣椒疫病抗性相关基因完整的开放阅读框(ORF)，表1为部分辣椒疫病抗性相关基因的序列分析结果。

4)SNP位点的鉴定：针对所获得的抗性相关基因ORF的序列特征，利用生物信息学软件设计特异引物。对具有不同疫病抗性能力的辣椒材料(CM334、K01、K43、K44、G29、G34和G35)进行扩增，扩增产物经琼脂糖电泳后，回收、克隆并测序。利用生物信息学软件DNAman对具有不同疫病抗性能力的辣椒材料的扩增产物进行序列比对，找出在高抗和高感疫病辣椒材料中的SNP位点。最后，在5个疫病抗性相关基因中找出了理想的SNP位点(图3)，5个抗性相关基因分别命名为CARpi-1，CARpi-2，CARpi-3，CARpi-1，CARpi-4和CARpi-5。5个抗性相关基因在2个辣椒全基因组数据库中对应的ID号分别为CA05g05500、CA11g04330、CA11g04340、CA11g14390、CA04g17640(http://peppergenom e.snu.ac.kr)和Capana03g001869、Capana11g001783、Capana11g001784、Capana03g003521和Capana04g000689(http://peppersequence.genomics.cn)。

5)辣椒疫病抗病分子标记的开发及应用：针对上述5个基因在具有不同疫病抗性能力的辣椒材料中所鉴定到的SNP位点特征，利用生物信息学软件设计特异SNP引物对高抗和高感辣椒疫病材料以及高抗疫病材料K43和高感疫病材料G29杂交自交获得的F₂群体进行扩增，同时对高抗、高感以及F₂群体进行辣椒疫霉菌接种，10天后调查发病情况。最后，SNP标记扩增结果结合上述材料的疫霉菌接种鉴定结果，筛选到只在高抗材料中扩增出条带，而在感病材料中无扩增条带的引物(图4)，此类引物对应的基因即为辣椒疫病抗性候选基因。

表1 20个辣椒疫病抗性相关基因的序列分析

Claims (2)

1.一种获得辣椒疫病抗性候选基因及分子标记的方法，该方法包括：

1）辣椒转录组测序：利用辣椒高抗和高感疫病材料杂交获得F₁，F₁自交获得F₂，对F₂群体进行辣椒疫霉菌接种，分别采集F₂群体接种0天和5天后的样品备用；接种辣椒疫霉菌10天后，调查F₂群体发病情况，分别选取15株辣椒高抗和高感疫病单株构建辣椒疫病抗、感基因池，命名为KC0（抗池对照）、KC5（接种5天后的抗池）、GC0（感池对照）和GC5（接种5天后的感池），利用测序仪器对抗、感池分别进行转录组测序；

2）差异基因表达分析：利用生物信息学软件对4个辣椒疫病抗、感基因池的测序数据进行合并组装，首先将各样品数据进行低质量过滤，使Q20达到99%以上，再将过滤后各样品数据合并在一起根据相似度进行聚类，在聚类单元中选取最长的序列作为Unigene序列，完成Unigene库的构建，利用RPKM值反映对应Unigenes的表达丰度，再利用生物信息学软件EBSeq筛选出在辣椒疫病抗、感基因池之间差异表达的基因；

3）差异基因功能注释：在NCBI网站上使用Blastn、Blastp和InterProscan软件对筛选到的差异表达基因进行数据库比对，获得差异表达基因的注释信息和蛋白质功能预测结果，根据注释信息和蛋白质功能预测结果进一步筛选出与辣椒疫霉病抗性相关的差异表达基因；然后利用上述差异表达基因片段，在辣椒全基因组数据库（http://peppergenome.snu.ac.kr和http:// peppersequence.genomics.cn）中进行Blastn比对，获得差异表达基因即辣椒疫病抗性相关基因完整的开放阅读框（ORF）；

4）SNP位点的鉴定：针对所获得的辣椒疫病抗性相关基因ORF的序列特征，利用生物信息学软件设计特异引物；对辣椒高抗疫病和高感疫病材料进行扩增，扩增产物经琼脂糖电泳后，回收、克隆并测序；利用生物信息学软件DNAman对高抗和高感疫病辣椒材料的扩增产物进行序列比对，找出辣椒疫病抗性相关基因序列在高抗和高感疫病辣椒材料中存在的SNP位点；

5）辣椒疫病抗性候选基因的获得：针对辣椒疫病抗性相关基因序列在辣椒高抗和高感疫病材料中所鉴定到的SNP位点特征，利用生物信息学软件设计特异SNP引物对高抗和高感辣椒疫病材料以及高抗和高感疫病材料杂交、自交获得的F₂群体进行扩增，同时对高抗、高感以及F₂群体进行辣椒疫霉菌接种，10天后调查发病情况；最后，SNP标记扩增结果结合上述材料的疫霉菌接种鉴定结果，筛选到只在高抗材料中扩增出条带，而在感病材料中无扩增条带的引物，此类引物对应的基因即为辣椒疫病抗性候选基因。

2.权利要求1所述的一种获得辣椒疫病抗性候选基因及分子标记的方法的应用，其特征在于包括：

1）辣椒疫病抗性候选基因及分子标记的方法为先进行辣椒疫病转录组测序找到差异表达

基因，再进行差异表达基因的功能注释以及蛋白质功能预测，找到与其他作物疫病抗性基因

同源性较高的辣椒疫病抗性相关基因，再根据抗性相关基因设计引物，在不同辣椒抗、感疫

病材料中扩增，比对序列差异，发现存在与抗、感辣椒疫病材料中的SNP位点，再根据SNP

位点特征设计特异进行引物的有效性验证，最后获得辣椒疫病抗性候选基因及分子标记；

2）用于辣椒转录组测序样品为高抗和高感辣椒疫病材料杂交、自交获得的F₂群体经接

种辣椒疫霉菌0-5天抗之内的抗、感基因池；

3）获得的5个辣椒疫病抗性候选基因分别为CARpi-1，CARpi-2，CARpi-3，CARpi-1，CARpi-4和CARpi-5，5个基因对应的在2个辣椒全基因组数据库中对应的ID号分别为CA00g85670、CA11g14390、CA03g00800、CA10g12800和CA11g04330（http://peppergenom e.snu.ac.kr）和Capana02g001506、Capana11g000418、Capana03g004163、Capana10g001567和Capana11g001783（http://peppersequence.genomics.cn）；

4）利用辣椒疫病抗性候选基因开发的SNP分子标记用于辣椒疫病抗性育种材料的选育。