CN109913532A - 一种获得丝瓜抗黄瓜花叶病毒病候选基因的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种获得丝瓜抗黄瓜花叶病毒病候选基因的方法，属于农业技术领域，包括：从无参考基因组序列物种筛选候选基因；采用SLAF‑seq方法构建丝瓜高密度遗传图谱以及定位丝瓜抗黄瓜花叶病毒基因；以定位标记为锚，从转录组文库中，筛选到候选基因序列，并进行候选基因的功能分析。本发明采用SLAF‑seq方法构建丝瓜高密度遗传图谱以及定位丝瓜抗黄瓜花叶病毒基因，以定位标记为锚，从转录组文库中，筛选到候选基因序列，并进行候选基因的功能分析。
Description
技术领域
本发明涉及一种获得候选基因的方法，特别是涉及一种获得丝瓜抗黄瓜花叶病毒病候选基因的方法，属于农业技术领域。
背景技术
丝瓜是一种重要的渡秋淡季蔬菜，具有重要的经济价值，丝瓜病毒病是丝瓜的主要病害之一，常常造成丝瓜植株生长畸形，果实营养品质下降，食用价值降低，极大地影响到丝瓜的商品价值，黄瓜花叶病毒是引起丝瓜病毒病的主要病原，黄瓜花叶病毒，寄主范围广泛，可浸染100多个科的1000多种植物，危害严重，目前，因为没有丝瓜的全基因组序列，一直以来对于该物种的研究还处于传统生物学阶段，而分子生物学层面的研究相对较少，在挖掘与性状相关的基因方面，一直远远落后于其他瓜类作物，如黄瓜、西瓜、甜瓜、冬瓜等，采用传统的基因挖掘的方法，一般需要构建BAC文库，或者进行基因组测序，这些方法一般均存在成本高，工作量大，制约了对特定性状的基因挖掘，进而影响到研究的进展水平。
简化基因组测序SLAF-seq和转录组测序RNA-seq是基于新一代测序技术获得大量SLAF分子标记和基因转录本序列，SLAF-seq是一套简化基因组测序技术，一次可开发高达10万个标签，获取全基因组范围内的序列标签，标记密度大，标记多态性高，可以实现重要农艺性状的基因定位，RNA-seq通过mRNA测序得到75bp的序列，通过组装拼接得到基因的全长序列，通过SLAF-seq构建高密度的遗传图谱，结合群体的表型性状，定位目的基因，利用定位基因的SLAF标记序列作为锚定引物，在转录组库里筛选到匹配的候选基因序列，并进行基因的功能预测，具有简便、高效、成本低的优点，为无参考基因组筛选候选基因的方法提供参考。
发明内容
本发明的主要目的是为了提供一种获得丝瓜抗黄瓜花叶病毒病候选基因的方法，采用SLAF-seq方法构建丝瓜高密度遗传图谱以及定位丝瓜抗黄瓜花叶病毒基因，以定位标记为锚，从转录组文库中，筛选到候选基因序列，并进行候选基因的功能分析。
本发明的目的可以通过采用如下技术方案达到：
一种获得丝瓜抗黄瓜花叶病毒病候选基因的方法，包括如下步骤：
步骤1：从无参考基因组序列物种筛选候选基因；
步骤2：采用SLAF-seq方法构建丝瓜高密度遗传图谱以及定位丝瓜抗黄瓜花叶病毒基因；
步骤3：以定位标记为锚，从转录组文库中，筛选到候选基因序列，并进行候选基因的功能分析。
进一步的，步骤1中，从无参考基因组序列物种筛选候选基因的方法，包括如下步骤：
步骤1.1：对目的性状构建的F2分离群体，进行目的性状的表型统计，同时对分离F2群体，进行SLAF-seq测序；
步骤1.2：根据步骤1.1测序形成的序列标签，构建高密度遗传图谱，结合表型数据，进行基因定位，获得紧密连锁的标记及序列信息；
步骤1.3：获得待测物种亲本的全基因组转录本的集合RNA-seq，形成序列数据库；
步骤1.4：将步骤1.2中获得标记的序列信息在步骤1.3中的数据库中获得的序列进行比较，获得Unigene的注释信息，根据注释信息，获得对应的基因的潜在功能。
进一步的，步骤1.4中，将步骤1.2中获得标记的序列信息在步骤1.3中的数据库中获得的序列进行比较，找到与该锚定标记匹配的转录本序列，匹配到转录本序列所拼装的Unigene序列，与NR、Swiss-Prot、GO、COG/KOG、KEGG数据库比对，得到Unigene在KEGG中的KEGG Orthology结果，预测完成Unigene的氨基酸序列之后，与Pfam数据库比对，获得Unigene的注释信息，根据注释信息，获得对应的基因的潜在功能。
进一步的，步骤2中，采用SLAF-seq方法构建丝瓜高密度遗传图谱以及定位丝瓜抗黄瓜花叶病毒基因，包括如下步骤：
步骤2.1：定位分离群体的构建；
步骤2.2：丝瓜群体的黄瓜花叶病毒抗性表型鉴定；
步骤2.3：丝瓜抗黄瓜花叶病毒基因的遗传分析；
步骤2.4：DNA提取及高通量测序；
步骤2.5：根据F2的抗黄瓜花叶病毒的表型数据，获得与病毒病抗性基因相关联区域，在连锁群上定位丝瓜抗黄瓜花叶病毒的数量性状。
进一步的，步骤2.1中，定位分离群体的构建，包括：以感CMV的丝瓜高代自交系“P1-21”为母本，以抗CMV的丝瓜高代自交系“P2-16”为父本，杂交获得F1代，F1单株自交获得F2代遗传分离群体进行测序。
进一步的，步骤2.3中，丝瓜抗黄瓜花叶病毒基因的遗传分析，包括：对F2群体病毒病抗性进行鉴定及分析，明确丝瓜抗CMV基因的遗传方式为数量遗传。
进一步的，步骤2.4中，DNA提取及高通量测序，包括：
采用CTAB法提取双亲及分离群体F2各单株丝瓜叶片的基因组DNA进行SLAF-Seq测序；
利用SLAF-seq技术对丝瓜物种的亲本和F2遗传分离群体进行测序；
开发高密度分子标签，筛选父母本都为杂合且亲本间具有多态性的位点，作为符合群体特征的有效标签；
经过对标记进行筛选，采用HighMap软件，最终绘制出丝瓜高密度遗传连锁图谱。
进一步的，步骤2.5中，根据F2的抗黄瓜花叶病毒的表型数据，采用R/qtl进行QTL定位分析，在连锁群1上获得与病毒病抗性基因相关联区域，根据连锁群的信息和标记与性状的连锁关系，在连锁群上定位丝瓜抗黄瓜花叶病毒的数量性状。
进一步的，步骤3中，以定位标记为锚，从转录组文库中，筛选到候选基因序列，并进行候选基因的功能分析的方法，包括如下步骤：
步骤3.1：对步骤1中，丝瓜的抗、感病双亲材料，进行CMV浸染不同时间点的样品进行取样；
步骤3.2：取待测材料的总RNA，富集出mRNA，反转录并合成双链cDNA双链，经纯化后，对cDNA进行末端修复、加A并连接测序接头，构建最终的cDNA文库，库检合格后，用IIIumina HiSeq平台进行测序。
步骤3.3：对原始测序结果进行质控后，将过滤后的高质量的数据，进行序列组装；
步骤3.4：对步骤3.3的结果进行CDS预测，表达分析，转录本分析以及基因注释；
步骤3.5：将获得的与丝瓜抗黄瓜花叶病毒的定位区段附近标记序列与在转录组的数据库中获得的序列进行比较，匹配到转录本序列所拼装的Unigene序列，获得Unigene的注释信息。
进一步的，步骤3.5中，将获得的与丝瓜抗黄瓜花叶病毒的定位区段附近标记序列与在转录组的数据库中获得的序列进行比较，找到与该锚定标记匹配的转录本序列，匹配到转录本序列所拼装的Unigene序列，与NR、Swiss-Prot、GO、COG/KOG、KEGG数据库比对，得到Unigene在KEGG中的KEGG Orthology结果，预测完成Unigene的氨基酸序列之后，与Pfam数据库比对，获得Unigene的注释信息，根据注释信息，获得对应的基因的潜在功能。
本发明的有益技术效果：
本发明提供的获得丝瓜抗黄瓜花叶病毒病候选基因的方法，采用高通量的SLAF-seq测序技术，快速高效的开发出大量的多态性标记，并用于高密度遗传图谱的构建和丝瓜抗黄瓜花叶病毒基因的定位，同时，在不同的浸染阶段，对抗、感病毒病丝瓜亲本进行了转录组测序，获得了转录组文库。
本发明提供的获得丝瓜抗黄瓜花叶病毒病候选基因的方法，将SLAF-seq与RNA-seq相结合，以定位标记为锚定引物，在转录组文库中，对定位区段附近的标记序列进行同源的比对分析，并结合转录组文库中对锚定到的Unigene进行基因功能的注释，获得丝瓜抗黄瓜花叶病毒病基因的候选基因。
本发明提供的获得丝瓜抗黄瓜花叶病毒病候选基因的方法，与传统基因定位方法相比，该方法高效、方便、快捷，且成本低廉，具有通用性，且选择目的性高，可以高效提供候选基因的序列信息，可为无参考基因组的物种筛选候选基因提供参考。
附图说明
图1为按照本发明的获得丝瓜抗黄瓜花叶病毒病候选基因的方法的一优选实施例的连锁群1上注释信息的候选基因分布。
图2为按照本发明的获得丝瓜抗黄瓜花叶病毒病候选基因的方法的一优选实施例的连锁群4上注释信息的候选基因分布。
具体实施方式
为使本领域技术人员更加清楚和明确本发明的技术方案，下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1：
本实施例提供的获得丝瓜抗黄瓜花叶病毒病候选基因的方法，包括如下步骤：
步骤1：从无参考基因组序列物种筛选候选基因；
步骤2：采用SLAF-seq方法构建丝瓜高密度遗传图谱以及定位丝瓜抗黄瓜花叶病毒基因；
步骤3：以定位标记为锚，从转录组文库中，筛选到候选基因序列，并进行候选基因的功能分析。
本实施例提供的从无参考基因组序列物种筛选候选基因的方法，包括：
(1)对目的性状构建的F2分离群体，进行目的性状的表型统计，同时对分离F2群体，进行SLAF-seq测序；
(2)根据(1)测序形成的序列标签，构建高密度遗传图谱，结合表型数据，进行基因定位，获得紧密连锁的标记及序列信息；
(3)获得待测物种亲本的全基因组转录本的集合(RNA-seq)，形成序列数据库；
(4)将(2)中获得的标记的序列信息在(3)中的数据库中获得的序列进行比较，找到与该锚定标记匹配的转录本序列，匹配到转录本序列所拼装的Unigene序列，与NR、Swiss-Prot、GO、COG/KOG、KEGG数据库比对，得到Unigene在KEGG中的KEGG Orthology结果，预测完成Unigene的氨基酸序列之后，与Pfam数据库比对，获得Unigene的注释信息。根据注释信息，获得对应的基因的潜在功能。
本实施例提供的采用SLAF-seq方法构建丝瓜高密度遗传图谱以及定位丝瓜抗黄瓜花叶病毒基因，包括：
(1)定位分离群体的构建：以感CMV的丝瓜高代自交系“P1-21”为母本，以抗CMV的丝瓜高代自交系“P2-16”为父本，杂交获得F1代,F1单株自交获得F2代遗传分离群体进行测序；
(2)丝瓜群体的黄瓜花叶病毒抗性表型鉴定；
(3)丝瓜抗黄瓜花叶病毒基因的遗传分析：对F2群体病毒病抗性进行鉴定及分析，明确丝瓜抗CMV基因的遗传方式为数量遗传；
(4)DNA提取及高通量测序：采用CTAB法提取双亲及分离群体F2各单株丝瓜叶片的基因组DNA进行SLAF-Seq测序；利用北京百迈客生物科技有限公司自主研发的SLAF-seq技术和HighMap软件对丝瓜物种的亲本和F2遗传分离群体进行测序，开发高密度分子标签，筛选父母本都为杂合且亲本间具有多态性的位点，作为符合群体特征的有效标签，经过对上图的标记进行筛选，最终绘制出丝瓜高密度遗传连锁图谱；
(5)根据F2的抗黄瓜花叶病毒的表型数据，采用R/qtl进行QTL定位分析，在连锁群1和4上获得与病毒病抗性基因相关联区域。根据连锁群的信息和标记与性状的连锁关系，在连锁群上定位丝瓜抗黄瓜花叶病毒的数量性状，在连锁群1上定位丝瓜抗黄瓜花叶病毒的数量性状，标记的定位区间0.385cM(100.072～100.457cM)；在连锁群4上定位丝瓜抗黄瓜花叶病毒的数量性状，标记的定位区间1.923cM(42.475～44.398cM)。
本实施例提供的以定位标记为锚，从转录组文库中，筛选到候选基因序列，并进行候选基因的功能分析的方法，包括：
(1)对步骤1中，丝瓜的抗、感病双亲材料，进行CMV浸染不同时间点的样品进行取样；
(2)取待测材料的总RNA，富集出mRNA，反转录并合成双链cDNA双链，经纯化后，对cDNA进行末端修复、加A并连接测序接头，构建最终的cDNA文库，库检合格后，用IIIuminaHiSeq平台进行测序；
(3)对原始测序结果进行质控后，将过滤后的高质量的数据，进行序列组装；
(4)对步骤3的结果进行CDS预测，表达分析，转录本分析以及基因注释；
(5)将获得的与丝瓜抗黄瓜花叶病毒的定位区段附近标记序列与在转录组的数据库中进行比较，在连锁群1和4中，我们分别搜索了98.534～119.304cM和42.475～53.122cM范围内的标记序列，找到与该锚定标记匹配的转录本序列，匹配到转录本序列所拼装的Unigene序列，与NR、Swiss-Prot、GO、COG/KOG、KEGG数据库比对，得到Unigene在KEGG中的KEGG Orthology结果，预测完成Unigene的氨基酸序列之后，与Pfam数据库比对，获得Unigene的注释信息，根据注释信息，获得对应的基因的潜在功能；
(6)在连锁群1中，共有17个标记序列有明确的基因功能注释信息，其中有8个属于反转录转座子gag/pol类蛋白，占注释到明确注释信息基因功能的47％；其次为逆转录酶中的锌结合，5个，占比29％；其他如抗病蛋白、核糖二磷酸羧化酶、丝氨酸/富含精氨酸的剪接因子、丝氨酸水解酶/二氢叶酸还原酶，各1个，占比均为6％，如图1所示。
(7)在连锁群4上，共有7个标记序列有明确的基因功能注释信息，其中6个属于反转录转座子gag/pol类蛋白，占注释到明确注释信息基因功能的86％；另外1个为组氨酸激酶，占比14％，如图2所示。
因此推测丝瓜抗黄瓜花叶病毒基因的候选基因，为反转录转座子gag/pol类蛋白。
综上所述，在本实施例中，本实施例提供的获得丝瓜抗黄瓜花叶病毒病候选基因的方法，采用高通量的SLAF-seq测序技术，快速高效的开发出大量的多态性标记，并用于高密度遗传图谱的构建和丝瓜抗黄瓜花叶病毒基因的定位，同时，对抗、感病毒病丝瓜亲本进行了转录组测序，获得了转录组文库；将SLAF-seq与RNA-seq相结合，以定位标记为锚定引物，在转录组文库中，对定位区段附近的标记序列进行同源的比对分析，并结合转录组文库中对锚定到的Unigene进行基因功能的注释，获得丝瓜抗黄瓜花叶病毒病基因的候选基因；与传统基因定位方法相比，该方法高效、方便、快捷，且成本低廉，具有通用性，且选择目的性高，可以高效提供候选基因的序列信息，可为无参考基因组的物种筛选候选基因提供参考。
以上所述，仅为本发明进一步的实施例，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明所公开的范围内，根据本发明的技术方案及其构思加以等同替换或改变，都属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种获得丝瓜抗黄瓜花叶病毒病候选基因的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：从无参考基因组序列物种筛选候选基因；
步骤2：采用SLAF-seq方法构建丝瓜高密度遗传图谱以及定位丝瓜抗黄瓜花叶病毒基因；
步骤3：以定位标记为锚，从转录组文库中，筛选到候选基因序列，并进行候选基因的功能分析。
2.如权利要求1所述的一种获得丝瓜抗黄瓜花叶病毒病候选基因的方法，其特征在于，步骤1中，从无参考基因组序列物种筛选候选基因的方法，包括如下步骤：
步骤1.1：对目的性状构建的F2分离群体，进行目的性状的表型统计，同时对分离F2群体，进行SLAF-seq测序；
步骤1.2：根据步骤1.1测序形成的序列标签，构建高密度遗传图谱，结合表型数据，进行基因定位，获得紧密连锁的标记及序列信息；
步骤1.3：获得待测物种亲本的全基因组转录本的集合RNA-seq，形成序列数据库；
步骤1.4：将步骤1.2中获得标记的序列信息在步骤1.3中的数据库中获得的序列进行比较，获得Unigene的注释信息，根据注释信息，获得对应的基因的潜在功能。
3.如权利要求2所述的一种获得丝瓜抗黄瓜花叶病毒病候选基因的方法，其特征在于，步骤1.4中，将步骤1.2中获得标记的序列信息在步骤1.3中的数据库中获得的序列进行比较，找到与该锚定标记匹配的转录本序列，匹配到转录本序列所拼装的Unigene序列，与NR、Swiss-Prot、GO、COG/KOG、KEGG数据库比对，得到Unigene在KEGG中的KEGG Orthology结果，预测完成Unigene的氨基酸序列之后，与Pfam数据库比对，获得Unigene的注释信息，根据注释信息，获得对应的基因的潜在功能。
4.如权利要求1所述的一种获得丝瓜抗黄瓜花叶病毒病候选基因的方法，其特征在于，步骤2中，采用SLAF-seq方法构建丝瓜高密度遗传图谱以及定位丝瓜抗黄瓜花叶病毒基因，包括如下步骤：
步骤2.1：定位分离群体的构建；
步骤2.2：丝瓜群体的黄瓜花叶病毒抗性表型鉴定；
步骤2.3：丝瓜抗黄瓜花叶病毒基因的遗传分析；
步骤2.4：DNA提取及高通量测序；
步骤2.5：根据F2的抗黄瓜花叶病毒的表型数据，获得与病毒病抗性基因相关联区域，在连锁群上定位丝瓜抗黄瓜花叶病毒的数量性状。
5.如权利要求4所述的一种获得丝瓜抗黄瓜花叶病毒病候选基因的方法，其特征在于，步骤2.1中，定位分离群体的构建，包括：以感CMV的丝瓜高代自交系“P1-21”为母本，以抗CMV的丝瓜高代自交系“P2-16”为父本，杂交获得F1代，F1单株自交获得F2代遗传分离群体进行测序。
6.如权利要求4所述的一种获得丝瓜抗黄瓜花叶病毒病候选基因的方法，其特征在于，步骤2.3中，丝瓜抗黄瓜花叶病毒基因的遗传分析，包括：对F2群体病毒病抗性进行鉴定及分析，明确丝瓜抗CMV基因的遗传方式为数量遗传。
7.如权利要求4所述的一种获得丝瓜抗黄瓜花叶病毒病候选基因的方法，其特征在于，步骤2.4中，DNA提取及高通量测序，包括：
采用CTAB法提取双亲及分离群体F2各单株丝瓜叶片的基因组DNA进行SLAF-Seq测序；
利用SLAF-seq技术对丝瓜物种的亲本和F2遗传分离群体进行测序；
开发高密度分子标签，筛选父母本都为杂合且亲本间具有多态性的位点，作为符合群体特征的有效标签；
经过对标记进行筛选，采用HighMap软件，最终绘制出丝瓜高密度遗传连锁图谱。
8.如权利要求4所述的一种获得丝瓜抗黄瓜花叶病毒病候选基因的方法，其特征在于，步骤2.5中，根据F2的抗黄瓜花叶病毒的表型数据，采用R/qtl进行QTL定位分析，在连锁群1和4上获得与病毒病抗性基因相关联区域，根据连锁群的信息和标记与性状的连锁关系，在连锁群上定位丝瓜抗黄瓜花叶病毒的数量性状。
9.如权利要求1所述的一种获得丝瓜抗黄瓜花叶病毒病候选基因的方法，其特征在于，步骤3中，以定位标记为锚，从转录组文库中，筛选到候选基因序列，并进行候选基因的功能分析的方法，包括如下步骤：
步骤3.1：对步骤1中，丝瓜的抗、感病双亲材料，进行CMV浸染不同时间点的样品进行取样；
步骤3.2：取待测材料的总RNA，富集出mRNA，反转录并合成双链cDNA双链，经纯化后，对cDNA进行末端修复、加A并连接测序接头，构建最终的cDNA文库，库检合格后，用IIIuminaHiSeq平台进行测序。
步骤3.3：对原始测序结果进行质控后，将过滤后的高质量的数据，进行序列组装；
步骤3.4：对步骤3.3的结果进行CDS预测，表达分析，转录本分析以及基因注释；
步骤3.5：将获得的与丝瓜抗黄瓜花叶病毒的定位区段附近标记序列与在转录组的数据库中获得的序列进行比较，匹配到转录本序列所拼装的Unigene序列，获得Unigene的注释信息。
10.如权利要求9所述的一种获得丝瓜抗黄瓜花叶病毒病候选基因的方法，其特征在于，步骤3.5中，将获得的与丝瓜抗黄瓜花叶病毒的定位区段附近标记序列与在转录组的数据库中获得的序列进行比较，找到与该锚定标记匹配的转录本序列，匹配到转录本序列所拼装的Unigene序列，与NR、Swiss-Prot、GO、COG/KOG、KEGG数据库比对，得到Unigene在KEGG中的KEGG Orthology结果，预测完成Unigene的氨基酸序列之后，与Pfam数据库比对，获得Unigene的注释信息，根据注释信息，获得对应的基因的潜在功能。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20190621 |
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