CN110029187A

CN110029187A - 一种基于竞争性等位pcr构建水稻分子标记图谱的方法及利用其进行育种的应用

Info

Publication number: CN110029187A
Application number: CN201910355843.6A
Authority: CN
Inventors: 郭涛; 陈志强; 王慧; 刘永柱; 王加峰; 肖武名; 黄明; 杨瑰丽; 黄翠红; 周丹华; 陈淳; 孙凯
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2019-04-29
Filing date: 2019-04-29
Publication date: 2019-07-19
Also published as: AU2019101778A4; AU2019430940A1; WO2020220615A1

Abstract

本发明提供了一种基于竞争性等位PCR构建水稻分子标记图谱的方法及利用图谱进行育种的应用，属农业技术领域。本发明通过对水稻进行全基因重组测序，并对重组测序数据SNP挖掘，寻找SNP位点；基于SNP位点结合现有SNP数据库，获得育种所需的565个SNP位点；利用挑选出的565个SNP位点进行分子标记，构建出水稻分子标记的图谱。本发明构建的水稻分子标记图谱的SNP标记物理位置清晰、检测方法简便，可直接用于部分重要农艺性状的分子鉴定和遗传背景分析，对于提升水稻分子育种效率具有重要应用价值。

Description

一种基于竞争性等位PCR构建水稻分子标记图谱的方法及利用其进行育种的应用

技术领域

本发明涉及一种基于竞争性等位PCR构建水稻分子标记图谱的方法及利用其进行育种的应用，属于农业技术领域。

背景技术

DNA分子标记是用于鉴定两个个体或品种之间差异且遵循简单的孟德尔遗传模式的多态性核苷酸序列。多态性高、共显性遗传、基因组中频繁发生、选择中性行为(即无基因多效性)、操作简单且容易快速测定、重复性好和在实验室内易数据交换是理想DNA标记的特征。在过去几十年中，使用分子标记揭示DNA水平的多态性在植物生物技术及其遗传学研究中发挥越来越重要的作用。

自1994年单核苷酸多态性SNP诞生以来，便很快被同行学者接受。1996年Lander正式指出SNP开启了新的分子标记时代，是继以SSR、ISSR为代表的第二代分子标记技术基础上发展起来的第三代分子标记技术。从1998～2002年，每年都召开一次关于“SNPs与复杂基因组”的国际会议，其主旨在于探讨SNPs在复杂基因组研究应用中的前景，其内容包括SNP标记的理论、方法与应用，在此期间每次会议都会在原有基础上增加新的内容。单核苷酸多态性是指在基因组水平上由于单个核苷酸变异所引起的DNA序列多态性，其多态性频率大于1％。但在实际研究中，也常把位于cDNA、频率低于1％的单核苷酸变异称为SNP。。SNP标记作为目前最具发展潜力的分子标记，因其在基因组中数量多、分布广且在分析过程中可实现大规模高自动化，因而更适合于数量庞大的检测分析，已被广泛应用于生物、农学、医学、生物进化等众多领域。

在水稻研究中，自国际水稻基因组测序项目(国际水稻基因组测序项目2005)完成以来，水稻功能基因组学得到了快速发展，也为育种者通过分子育种改良水稻这种重要作物提供了巨大的信息支持。目前，根据水稻的两个亚种籼稻和粳稻确定了408,898个候选DNA多态性(SNPs/Indels)。通过重测序芯片对20个不同品种和地方品种的参考基因组特定部分序列100Mb的测定鉴定了160,000个非冗余SNP。2011～2012年的几个重测序项目也提供了关于水稻基因组结构和遗传多样性的大量信息。当前报道的海量的水稻SNP可通过相关几个的数据库查询并根据其信息发掘水稻大量的SNP位点。(Gramme：http://ensembl.gramene.org/genome_browser/index.html；Rice diversity:https://ricediversity.org/；Rice Genome Annotation Project:http://rice.plantbiology.msu.edu/；Rice SNP-s eek Database：http://oryzasnp.org/iric-portal/)。上述大量的水稻SNP信息为分子育种提供了有利信息。

但是，目前已公开的SNP信息在不同数据库中没有得到整合，主要体现在：1、SNP标记具体物理位置在不同的数据库中有所差异，甚至有前后矛盾的现象；2、不同数据库中SNP的冗余情况不明，大量的SNP标记被重复报道；3、目前公开的SNP标记与具体农艺性状的关系缺乏系统总结。上述这些问题极大地限制了水稻育种工作者从中发掘有用标记。因此，利用遗传背景广泛的水稻种质资源，利用全基因组测序分析其存在的SNP信息，明确其物理位置并构建物理图谱；利用物理图谱，进一步将SNP与已克隆的农艺性状基因进行整合和关联，提供清晰可用的SNP与农艺性状的关系，将为水稻育种工作者提供具体的育种指导。

一旦构建完整的SNP物理图谱，如何进行SNP的高效检测是限制SNP应用的关键技术环节。目前，SNP的检测技术大致可以基于以下几个原理进行分类：1)基于等位基因PCR原理的检测方法；2)内切酶、连接酶技术；3)基于构象的检测方法；4)质谱法；5)以杂交原理为基础的检测方法；6)测序法；7)其他方法：高分辨率熔解曲线(HRM,High ResolutionMelting)、竞争性等位基因特异性PCR(KASP，Kompetitive Allele Specific PCR)等。其中，KASP技术则是基于荧光读取判断来检测SNP不同的基因型。相比较其他检测技术，KASP技术灵活性高，支持低、中、高通量研究以及单个重复实验，实验设计的灵活性高、成功率高，同时成本更低，具有广泛的应用前景。将SNP信息转化为可靠高效的基于竞争性等位PCR的SNP标记，将显著提升SNP标记的育种应用效率。

终上所述，本发明将整合的SNP图谱与竞争性等位PCR结合，可有效克服目前SNP信息不清晰、检测应用难度大的技术难点，具有较强的应用价值。

发明内容

针对目前水稻SNP与育种实践脱节的问题，本发明将整合的SNP图谱与竞争性等位PCR结合，可有效克服目前SNP信息不清晰、SNP标记与性状的关系不明、SNP的检测难度大等技术难点。

本发明通过以下技术方案予以实现：

一种基于竞争性等位PCR的水稻分子标记图谱及其育种应用，包含如下步骤：

S1.对530份来自国内外的水稻种质材料进行全基因组测序，分析530份材料在全基因组范围内的SNP；

S2.从上述全基因组SNP中挑选出565个与育种实践紧密相关的SNP位点，挑选所依据的规则如下：1)与亚群分组或质量控制(quality control of seeds/samples)有关的标记，主要用于种质材料的分类；2)籼稻与籼稻之间多态性有关的标记；3)高多态性标记；4)功能性诊断标记；5)克隆基因区间标记；6)关键基因靶向位点标记；7)已报道与农艺性状显著连锁的标记；8)用于填补空隙的SNP标记；

S3.根据SNP位点物理位置，绘制出565个SNP位点的基因组图谱；

S4.基于竞争性等位PCR对绘制的565个SNP位点的基因组图谱分别进行分子标记，即构建了水稻分子标记图谱。

优选的，S3中所述的基因组图谱是利用作图网站Map Gene 2Chromosome v2进行绘制的。

优选的，所述S4中每个位点的分子标记需要设计三条引物序列，针对每个标记，设计两条等位基因特异性正向引物序列和一条反向引物序列；PCR反应时分别加入DNA模板，标记对应的三条引物，并加入与正向引物尾部14-15个碱基分别互补的2个分别携带红色、蓝色荧光基团的荧光标记。

进一步优选的，所述等位基因特异性正向引物序列末端14-15个碱基是通用的，其中一条等位基因特异性正向引物序列末端互补红色荧光标记的连接序列，另外一条等位基因特异性正向引物序列末端互补蓝色荧光标记连接序列。

进一步优选的，所述其中一条等位基因特异性正向引物序列末端互补红色荧光标记的连接序列为AGTCGGATTACGAAT，另外一条等位基因特异性正向引物序列末端互补蓝色荧光标记连接序列为CTTAGGATACTAGG。

本发明的一种利用权利要求1构建的水稻分子标记图谱进行育种的应用，具体是利用该图谱可以对不同来源的水稻材料进行品质、抗病基因的鉴定。

本发明的一种利用权利要求1构建的水稻分子标记图谱进行育种的应用，具体是利用该图谱可以获得不同水稻材料间的遗传距离。

与现有技术比较，本发明具有以下有益效果：

1、本发明提供的SNP图谱为物理图谱，而传统的遗传图谱基于重组率所确定的遗传图距具有相对性，物理图谱反映了生物基因组中基因或标记间的实际距离，只要通过实验验证目标基因与遗传标记之间的连锁关系，就能确定目标基因在染色体上的位置范围；2、本发明提供的全部SNP位点整合在一张图谱上，相互间不存在重复，有效克服现有遗传图谱冗余度高的问题；3、本发明提供的SNP位点用途明确，如功能性诊断标记、克隆基因区间标记、关键基因靶向位点标记等，而传统遗传图谱无法提供其与基因的具体关系；4、本发明提供的竞争性等位PCR的SNP标记检测方法简便，准确度高，灵活性强、成本更低，易于实现自动化。因此，与已报道的遗传图谱比较，本发明可有效提升SNP标记在水稻育种中的应用效率。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明565个成功设计引物的SNP信息；

图2为对本发明部分标记进行检测的结果示例图；

图3为基于Nei`s遗传距离的系统发生树。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例进一步说明本发明。实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

1、国内外530份不同来源的水稻材料收集

共530份来源广泛的种质材料，不同材料来源见表1。其中，两类国际外引种质(实验ID为KY和KIR)来自国际水稻研究所，其余部分材料为华南农业大学提供。

表1所收集的530份水稻材料

2、530份水稻材料的基因组重测序分析

提取530份水稻材料的DNA，按照Illumina平台的标准流程构建shotgun文库，全部均为Paired-end双末端测序文库，插入片段长度介于200～500bp。文库经过质量检测符合要求后，在Illumina Hiseq 2000/2500平台进行测序，并按Illumina标准流程进行碱基识别、原始数据整理及数据质量评估。对比参考基因组，比较530份材料间存在的SNP信息。利用SAMTOOLS软件检测共获得了652457个SNP位点，经过条件为dp2、Miss0.7、Maf0.01的过滤后，最后共获得了60144个高质量的SNP位点用于后续分析。

3、用于构建图谱的SNP位点收集

为更有效的开发水稻全基因组标记，本研究结合已发表的数据及可用数据库，从第2步获得的SNP中挑选以下8类SNP数据作为开发全基因组的SNP标记(表2)：

1)第一类标记为与亚群分组或质量控制(quality control of seeds/samples)有关的标记，主要用于种质材料的分类；2)第二类和第三类标记则主要是多态性标记，可更好地用于材料的分类及基因组背景多样性评估，由于本研究所用材料以籼稻材料居多，因此将与籼稻与籼稻之间多态性有关的标记归为一类；3)已报道或本项目自行开发验证的水稻功能性诊断标记；4)第五类和第六类为已报道的关键功能基因靶向位点和克隆基因区间内相关的SNP位点；5)文献已经报道的通过全基因组关联分析找到的与目标性状显著连锁的标记；6)第八类为本研究自行开发的SNP标记，可填补空隙使标记相对均匀地分布在12条染色体上。

表2筛选的SNP位点信息

4、596个SNP位点的引物设计与标记转化

利用筛选的SNP序列信息通过Kraken软件生成SNP位点的引物序列。从表3及图1中可以看到，第一类61个与亚群分组或质量控制有关的SNP设计出的引物有59对，成功率为96.7％；第二类64个与籼/籼特异多态性的SNP设计出的引物有62对，成功率为96.8％；第三类53个高PIC多态性的SNP设计出的引物有52对，成功率为98.1％；第四类21个功能性诊断的SNP设计出的引物有18对为85.7％；第五类95个关键功能基因靶向SNP位点设计出的引物有90对，成功率为94.7％；第六类173个克隆基因区间SNP设计出的引物有156对，成功率为90.1％；第七类33个GWAS高度显著连锁SNP设计出的引物有32对，成功率为97.0％；而第八类96个SNP设计出的引物有100对，成功率100％。除第四类位点外，其余位点的引物成功率均可达到90％以上。候选的596个SNP设计出的引物总共有565对，成功率94.8％。通过以上数据，KASP标记的转化率达94.8％，引物设计及标记转化具有较高的成功率，为实验的开展提供了数量众多且极有价值的候选SNP标记。

表3各类成功设计引物SNP比例

5、565个SNP标记的分型及其验证

按照标准竞争性等位PCR扩增体系对上述设计的候选标记进行检测。以SK07.16957375标记进行检测的结果为例，不同的样本板进行检测的结果根据其样本而有所变化。图2-a中为在SK07.16957375标记无多态的样本板，样本根据其荧光信号值聚集在一起，没有分类，只有一个分型结果；图2-b中SK07.16957375标记根据其荧光信号样本分布聚集在左上角、右下角及其中间，有分类即有三个分型结果，SK07.16957375标记在该样本板中呈现多态性。

利用第4中成功转化的标记对随机挑选出的480份实验材料进行检测分型，能够成功转化的565个标记有558个标记在检测中均可显示荧光信号，其中只显示1种有效荧光信号值的标记有91个，为无多态性标记；能够显示至少2种有效荧光信号值的标记即具有多态性的标记有467个，这些标记可至少在2个实验材料进行分型。因此，本研究开发出的565个SNP分子标记是可用的。

6、565个KASP-SNP标记物理图谱的绘制

利用作图网站Map Gene 2Chromosome v2构建了565个标记的物理图谱，标记在染色体上的分布情况见表4。

表4检测有结果标记及有多态标记在水稻染色体上的分布

注：水稻染色体长度数据参考Rice Genome Annotation Project网站。

7、利用功能性SNP位点进行水稻种质目的基因鉴定

在565个KASP-SNP标记中，有18个标记为已克隆基因的功能位点，本研究挑选出5个标记用于种质资源的目的基因鉴定。其中SK06.1765761、SK06.1768006、SK06.176899、SK06.6752887与稻米的品质相关，前三个标记主要与稻米中直链淀粉合成有关，SK06.6752887则主要与稻米蒸煮时的品质糊化温度有关；标记SK12.10607554与水稻稻瘟病抗性相关，其G/G基因型对应水稻的稻瘟病抗性。根据实验验证，SK06.1765761、SK06.1768006、SK06.176899标记的T/T、A/A、C/C基因型与低直链淀粉相关联，标记SK06.6752887的TT/TT基因型则对应较低的糊化温度，利于稻米的蒸煮(表5)。

表5部分与品质及抗病有关的功能标记信息

利用上述5个标记对481个水稻种质进行筛选，得到129个同时含有4个与米质有关的有利基因型和1个稻瘟病抗性基因型的水稻种质。这129个水稻种质中，以国内材料居多，国际外引种质较少，这可能与群体的来源有关。这些携带5个有利基因的种质资源可作为优良基因供体，用于分子育种实践。

8、利用全基因组KASP-SNP标记进行种质资源的遗传多样性分析

利用565个KASP-SNP标记对481个水稻种质进行基因型分析，根据基因型数据基于Nei’s遗传距离构建NJ聚类图(图3)，可将481个种质以分为粳稻、籼稻两个亚种，其中大部分为籼稻种质，粳稻种质仅32个。属于籼稻亚种的材料可以分为2类：一类是主要包含多样性种质和育种亲本(实验ID为KBen)以及高世代育种系(实验ID为KD)；另一类则主要是实验ID为KIR、KY、KP的国外引进种质、实验ID为KC的不育系种质及部分多样性种质和育种亲本。上述遗传多样性分析结果可为亲本的选配提供指导，选择具有一定遗传差异的材料进行杂交组配，可在遗传分离世代创造更多有利基因重组。

本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处。综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。

Claims

1.一种基于竞争性等位PCR构建水稻分子标记图谱的方法，其特征在于，包含如下步骤：

S2.从上述全基因组SNP中挑选出565个与育种实践紧密相关的SNP位点；

S3.根据SNP位点物理位置，绘制出565个SNP位点的基因组图谱；

2.根据权利要求1所述基于竞争性等位PCR构建水稻分子标记图谱的方法，其特征在于，S3中所述的基因组图谱是利用作图网站Map Gene 2 Chromosome v2进行绘制的。

3.根据权利要求1所述基于竞争性等位PCR构建水稻分子标记图谱的方法，其特征在于，所述S4中每个位点的分子标记需要设计三条引物序列，针对每个标记，设计两条等位基因特异性正向引物序列和一条反向引物序列；PCR反应时分别加入DNA模板，标记对应的三条引物，并加入与正向引物尾部14-15个碱基分别互补的2个分别携带红色、蓝色荧光基团的荧光标记。

4.根据权利要求3所述的基于竞争性等位PCR构建水稻分子标记图谱的方法，其特征在于，所述等位基因特异性正向引物序列末端14-15个碱基是通用的，其中一条等位基因特异性正向引物序列末端互补红色荧光标记的连接序列，另外一条等位基因特异性正向引物序列末端互补蓝色荧光标记连接序列。

5.根据权利要求4所述的基于竞争性等位PCR构建水稻分子标记图谱的方法，其特征在于，所述其中一条等位基因特异性正向引物序列末端互补红色荧光标记的连接序列为AGTCGGATTACGAAT，另外一条等位基因特异性正向引物序列末端互补蓝色荧光标记连接序列为CTTAGGATACTAGG。

6.一种利用权利要求1构建的水稻分子标记图谱进行育种的应用，其特征在于，利用该图谱可以对不同来源的水稻材料进行品质、抗病基因的鉴定。

7.一种利用权利要求1构建的水稻分子标记图谱进行育种的应用，其特征在于，利用该图谱可以获得不同水稻材料间的遗传距离。