CN114196777A

CN114196777A - 一种与稻米直链淀粉含量相关的单倍型snp分子标记及其检测方法与应用

Info

Publication number: CN114196777A
Application number: CN202111602414.8A
Authority: CN
Inventors: 程计华; 田冰川; 林鑫; 李宙炜; 曾琴; 彭俊华
Original assignee: Huazhi Biotechnology Co ltd
Current assignee: Huazhi Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-12-24
Filing date: 2021-12-24
Publication date: 2022-03-18
Anticipated expiration: 2041-12-24
Also published as: CN114196777B

Abstract

本发明公开了一种与稻米直链淀粉含量相关的单倍型SNP分子标记及其检测方法与应用，所述单倍型SNP分子标记由SNP1和SNP2组成，其中，所述SNP1为如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，该序列的第201bp位置是G或T；所述SNP2为如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列，该序列的第201bp位置是G或A。本发明方案有助于水稻品种的选育，对提升水稻品质，培育高品质的水稻进行商业育种具有重要意义。

Description

一种与稻米直链淀粉含量相关的单倍型SNP分子标记及其检测方法与应用

技术领域

本发明属于农业分子生物学领域，具体涉及与一种与稻米直链淀粉含量相关的单倍型SNP分子标记及其检测方法与应用。

背景技术

稻米中90％的干物质都是淀粉，这其中30％是直链淀粉，直链淀粉含量(Apparentamylose content,AAC)是大米蒸煮食味品质评价的一个主要指标，它直接关系到米饭的粘度和硬度。品种中直链淀粉含量变异很大，糯稻中基本不含直链淀粉(0-2％)，有的品种直链淀粉含量超过30％。行业内通常根据直链淀粉含量的不同将水稻品种分成5级：糯(0-2％)、极低(3-9％)、低(10-19％)、中等(20-25％)和高(25％以上)。根据水稻类型不同，籼稻普遍高于粳稻因此籼稻米饭硬而散，而粳稻米饭软且粘。通过对国家种质库中14000多份籼稻品种进行普查后发现，所有这些品种直链淀粉含量差异并不大，地方品种中直链淀粉含量平均含量最高(25.3％)，育成品种稍低(24.7％)，外引品种最低(22.8％)；还发现这个指标水稻高于旱稻(张云康，1993)。不过，最近几十年我国稻米的直链淀粉含量呈普遍下降趋势，籼稻平均为21.1％，变异幅度为10.5％-28.5％，当前的主栽品种都在15％左右；粳稻平均为16.3％，在13.7％到20％之间。

稻米直链淀粉的含量主要由Wx位点控制，因此，Wx位点不同的等位基因型决定了不同水稻类型甚至同一类型不同品种直链淀粉的含量。至今，水稻育种中正在利用的Wx位点不多，主要有3个。比如籼稻和粳稻中普遍分别带有两个功能性的Wx位点Wx^a和Wx^b，致使籼稻直链淀粉含量普遍高于粳稻；而糯稻中则携带一个功能缺失的Wx位点wx，因此糯稻中几乎不合成直链淀粉。因此，在需要培育较低直链淀粉含量的籼稻品种时，普遍采用的做法是将粳稻特有的Wx^b导入籼稻以达到降低直链淀粉含量的目的，反之亦然。所以，总得来说育种上可用的Wx等位基因型太少，需要丰富该等位基因的类型，有必要从更多的原始资源、地方品种、国外种质资源中挖掘新的基因类型，进而开发实用型的分子标记，从而应用于水稻品质性状的分子育种中。

发明内容

本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种与稻米直链淀粉含量相关的单倍型SNP分子标记。

本发明还提出上述单倍型SNP分子标记的检测方法。

本发明还提出一种水稻直链淀粉含量相关的分子标记方法。

本发明还提出上述单倍型SNP分子标记的应用。

根据本发明的第一方面实施方式的一种与稻米直链淀粉含量相关的单倍型SNP分子标记，所述单倍型SNP分子标记由SNP1和SNP2组成，其中，所述SNP1为如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，该序列的第201bp位置是G或T；所述SNP2为如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列，该序列的第201bp位置是G或A。

在本发明的一些实施方式中，所述单倍型分子标记按SNP1、SNP2为GA基因型时，对应的水稻具有高直链淀粉含量性状(>25％)；当所述单倍型分子标记为GG基因型时，对应的水稻具有中等直链淀粉含量性状(20％-25％)；当所述单倍型分子标记为TG基因型时，对应的水稻具有低直链淀粉含量性状(20％以下)。

根据本发明第二方面实施方式的一种稻米直链淀粉含量相关的SNP分子标记的检测方法，所述方法包括如下步骤：将待测水稻进行序列测定，根据序列测定结果，对上述单倍型分子标记的基因型进行检测。

在本发明的一些实施方式中，所述序列测定采用全基因组重测序、靶向测序和多重PCR测序中的一种。

根据本发明的第三方面实施方式的一种水稻直链淀粉含量相关的分子标记的筛选方法，所述筛选方法包括如下步骤：对水稻进行全基因组测序，根据测序结果，采用全基因组关联分析及表型分析的方法进行水稻直链淀粉含量性状关联位点的定位后进行GWAS分析，在等位基因频率>5％的SNP中挑选与水稻直链淀粉含量性状相关的SNP标记，得到位于水稻基因组第6号染色体1765761bp处的SNP1，多态性为G或T和位于水稻基因组第6号染色体1769155bp处的SNP2，多态性为G或A。

根据本发明的第四方面实施方式的上述单倍型SNP分子标记的应用，所述应用为单倍型SNP分子标记在水稻育种中的应用。

在本发明的一些实施方式中，所述应用为单倍型SNP分子标记在预测水稻品种直链淀粉含量中的应用。

一种鉴定或辅助鉴定待测水稻直链淀粉含量的方法，检测待测水稻基因组中上述与直链淀粉含量相关的单倍型SNP分子标记的基因型，根据基因型判断所述待测水稻的直链淀粉含量：

若所述待测水稻基因组中与直链淀粉含量相关的单倍型SNP分子标记的基因型为GA，则该待测水稻为具有大于25％的直链淀粉含量性状的水稻；

若所述待测水稻基因组中与直链淀粉含量相关的单倍型SNP分子标记的基因型为GG，则该待测水稻为具有20％-25％直链淀粉含量性状的水稻；

若所述待测水稻基因组中与直链淀粉含量相关的单倍型SNP分子标记的基因型为TG，则该待测水稻为具有小于20％直链淀粉含量性状的水稻。

选育具有大于25％的直链淀粉含量性状的水稻的方法，检测待测水稻基因组中上述与直链淀粉含量相关的单倍型SNP分子标记的基因型，选择基因型为GA的待测水稻；

选育具有20％-25％等直链淀粉含量性状的水稻的方法，检测待测水稻基因组中上述与直链淀粉含量相关的单倍型SNP分子标记的基因型，选择基因型为GG的待测水稻；

选育具有小于20％直链淀粉含量性状的水稻的方法，检测待测水稻基因组中上述与直链淀粉含量相关的单倍型SNP分子标记的基因型，选择基因型为TG的待测水稻。

根据本发明实施方式的一种与稻米直链淀粉含量相关的单倍型SNP分子标记及其检测方法与应用，至少具有如下有益效果：本发明利用与稻米直链淀粉含量相关的单倍型SNP分子标记SNP1和SNP2，可以对稻米直链淀粉含量进行分级，准确挑选直链淀粉含量满足质量标准的水稻样本，可以实现快速选育高、低直链淀粉含量的品种，本发明方案有助于培育不同类型的水稻品种以满足多样性的消费需求，具有重大的商业价值。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，其中：

图1为本发明实施例中的展示通过全基因组关联分析鉴定到与水稻直链淀粉含量相关的染色体区段的Manhattan图；

图2为本发明实施例中的展示水稻Wx基因内10个SNP的连锁不平衡与单倍型分析结果图；

图3为本发明实施例中的含有3个单倍型标记的水稻材料直链淀粉含量的分析结果图；

图4为本发明实施例中不同单倍型水稻种质资源稻米直链淀粉含量的比较图，其中，***为p<0.001。

具体实施方式

以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1与水稻稻米直链淀粉含量相关的单倍型SNP分子标记的获得

1、选取材料

本发明使用的水稻材料包括331份水稻种质资源所组成的自然群体，含籼稻和粳稻，以及29份栽培稻品种，其中自然群体源于国际水稻研究所3K资源。

所有材料均种植于位于湖南长沙的华智生物试验基地，每份材料各两次重复。在5月下旬播种，6月中旬移栽，收获后的稻谷晾干后室温储藏3个月，然后用于实验。

2、样品处理与表型分析

对最终收获得到的301份样品进行直链淀粉含量性状的表型分析，具体分析方法参照国家标准(GB/T 15683-2008)进行。其中，217份样品用于后续全基因组关联分析，84份样品用于单倍型标记的验证。

3、基因型数据收集与分析

所有样本的基因型数据通过重测序获得。其中，用于全基因组关联分析的种质资源自然群体其相应的基因型来自公开的数据集(3K RG 1M GWAS SNP Dataset，https://snp-seek.irri.org/_download.zul)，该数据集为国际水稻所3K资源的SNP信息，约1M个SNP位点，均匀分布于水稻12条染色体。使用本发明中的样品名称对该公共数据集进行过滤后得到的基因型数据集直接用于后续全基因组关联分析；其它29份栽培品种通过全基因组测序(Illumina，测序深度为10)后，对所获得的reads按标准方法进行质控、回帖到日本晴参考基因组(MSU7.0)后SNP calling得到各栽培品种基因型。

4、全基因组关联分析与位点挖掘

利用GEMMA软件包混合线性模型进行全基因组关联分析挖掘直链淀粉含量性状关联位点，关联分析时仅保留等位基因频率(MAF)>5％的SNP。如图1所示，第6号染色体上发现存在一个显著的关联信号，显著关联的peakSNP为chr6:1765761(G或T)，即上述SNP1。参考水稻全基因组注释文件(Oryza_sativa.IRGSP-1.0.47.chr.gff3)，发现SNP1位于一个已知的功能基因Wx(LOC_Os06g04200)内，该基因为一个控制水稻直链淀粉含量的主效基因。在该基因区域内挑选得到10个SNP进行连锁不平衡(LD)及单倍型分析(图2)，并结合上述10个SNP的位置特征选择4个SNP(182848881、6_1766003、6_1768998和6_1769155；其中182848881即上述SNP1 chr6:1765761，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，6_1769155即为上述SNP2，核苷酸序列如SEQ ID No.2所示)进行后续单倍型与表型关系的鉴定分析。

5、单倍型分析

表1

结合表型，将上述4个SNP标记组合而成的单倍型进行分析后发现其中2个SNP(SNP1 chr6:1765761，SNP2 6_1769155)与直链淀粉含量显著相关。将上述两个SNP位点组合为上述3个类型的单倍型：G-A、G-G和T-G。通过比较171份(连锁分析群体217份排除糯米后)水稻样品中稻米直链淀粉含量与单倍型的关系后发现，可以将171份群体按照上述单倍型进行划分，结果如图3和表1所示，单倍型G-A对应的基因型水稻材料其直链淀粉含量绝大部分(86％)在25％以上；单倍型G-G对应的基因型水稻材料其直链淀粉含量绝大部分(70％)在20-25％之间；单倍型T-G对应的基因型水稻材料其直链淀粉含量绝大部分(91％)在20％以下。

将70种与上述171份水稻材料完全不同的已知直链淀粉含量的水稻材料利用上述单倍型SNP分子标记进行分型后，结果如图4所示，从图中可以看出，单倍型GA(直链淀粉含量>25％)对应的水稻材料稻米直链淀粉含量极显著高于单倍型GG和TG(直链淀粉含量为20％-25％)(P<0.001)；纯合单倍型GG水稻材料的稻米直链淀粉含量也显著高于单倍型TG(直链淀粉含量20％以下)对应的基因型水稻材料(P<0.001)。结果表明，各个单倍型与直链淀粉含量这一表型呈现显著性关联，本申请方案提供的单倍型SNP分子标记可以准确的鉴定稻米的直链淀粉含量。

综上所述，本发明利用与水稻稻米直链淀粉含量相关的单倍型SNP分子标记SNP1和SNP2，可以对多种水稻直链淀粉含量进行快速分级，准确挑选直链淀粉含量满足质量标准的水稻样本，可以实现快速不同直链淀粉含量的品种的选育。

上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

序列表

<110> 华智生物技术有限公司

<120> 一种与稻米直链淀粉含量相关的单倍型SNP分子标记及其检测方法与应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 401

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atcgcgcggg cttcacgcaa cggcgctaca aatagccacc cacaccacca ccccctctct 60

caccattcct tcagttcttt gtctatctca agacacaaat aactgcagtc tctctctctc 120

tctctctctc tctctctctc tctctgcttc acttctctgc ttgtgttgtt ctgttgttca 180

tcaggaagaa catctgcaag ttatacatat atgtttataa ttctttgttt cccctcttat 240

tcagatcgat cacatgcatc tttcattgct cgtttttcct tacaagtagt ctcatacatg 300

ctaatttctg taaggtgttg ggctggaaat taattaatta attaattgac ttgccaagat 360

ccatatatat gtcctgatat taaatcttcg ttcgttatgt t 401

<210> 2

<211> 401

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cccactgatc gcgttcatcg gcaggctgga ggaacagaag ggccctgacg tcatggccgc 60

cgccatcccg gagctcatgc aggaggacgt ccagatcgtt cttctggtat aatataatac 120

actacaagac acacttgcac gatatgccaa aaattcagaa caaattcagt ggcaaaaaaa 180

aaactcgaat attagggaag gacctaataa tatcaaataa ttagaagggg tgaggctttg 240

aacccagatc gtctagtcca ccaccttgtg gagttagccg gaagacctct gagcatttct 300

caattcagtg gcaaatgatg tgtataattt tgatccgtgt gtgtttcagg gtactggaaa 360

gaagaagttc gagaagctgc tcaagagcat ggaggagaag t 401

Claims

1.一种与稻米直链淀粉含量相关的单倍型SNP分子标记，其特征在于，所述单倍型SNP分子标记由SNP1和SNP2组成，其中，所述SNP1为如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，该序列的第201bp位置是G或T；所述SNP2为如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列，该序列的第201bp位置是G或A。

2.根据权利要求1所述的单倍型SNP分子标记在水稻育种中的应用。

3.根据权利要求1所述的单倍型SNP分子标记在预测水稻品种直链淀粉含量中的应用。

4.一种如权利要求1所述的与稻米直链淀粉含量相关的单倍型SNP分子标记的筛选方法，其特征在于，所述筛选方法包括如下步骤：对水稻进行全基因组测序，根据测序结果，采用全基因组关联分析及表型分析的方法，进行水稻直链淀粉含量性状关联位点的定位后，进行GWAS分析，在等位基因频率>5％的SNP中挑选与水稻直链淀粉含量性状相关的SNP标记，得到位于水稻基因组第6号染色体1765761bp处的SNP1，多态性为G或T和位于水稻基因组第6号染色体1769155bp处的SNP2，多态性为G或A。

5.一种与稻米直链淀粉含量相关的单倍型SNP分子标记的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括如下步骤：将待测水稻进行序列测定，根据序列测定结果，对权利要求1所述的单倍型分子标记的基因型进行检测。

6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，序列测定采用全基因组重测序、靶向测序和多重PCR测序中的一种。

7.鉴定或辅助鉴定待测水稻直链淀粉含量的方法，其特征在于，检测待测水稻基因组中权利要求1所述的与直链淀粉含量相关的单倍型SNP分子标记的基因型，根据基因型判断所述待测水稻的直链淀粉含量：

8.选育具有大于25％的直链淀粉含量性状的水稻的方法，其特征在于，检测待测水稻基因组中权利要求1所述的与直链淀粉含量相关的单倍型SNP分子标记的基因型，选择基因型为GA的待测水稻。

9.选育具有20％-25％直链淀粉含量性状的水稻的方法，其特征在于，检测待测水稻基因组中权利要求1所述的与直链淀粉含量相关的单倍型SNP分子标记的基因型，选择基因型为GG的待测水稻。

10.选育具有小于20％直链淀粉含量性状的水稻的方法，其特征在于，检测待测水稻基因组中权利要求1所述的与直链淀粉含量相关的单倍型SNP分子标记的基因型，选择基因型为TG的待测水稻。