CN111647679A - 一种基于hrm的水稻全基因组snp标记开发的方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种基于HRM的水稻全基因组SNP标记开发的方法及应用，涉及分子标记开发技术领域。本发明利用水稻SNP信息数据库HapRice以及RICE6K，挖掘基于HRM技术的全基因组SNP分子标记。利用本发明所述方法开发出599个基于HRM技术的SNP分子标记，并构建覆盖水稻12条染色体的HRM‑SNP分子标记图谱，该图谱标记密度达到1.60个SNP/Mb，任一SNP标记至少在2个实验材料之间表现有多态性，利用该套标记将一个斑点叶基因Spl32(t)定位于水稻第11号染色体的22.35Mb～24.07Mb之间。

Description

一种基于HRM的水稻全基因组SNP标记开发的方法及应用
技术领域
本发明属于分子标记开发技术领域，具体涉及一种基于HRM的水稻全基因组SNP标记开发的方法及应用。
背景技术
水稻(OryzasativaL.)是我国重要的粮食作物，近年来其种植面积和总产量约占粮食作物的27％和38％，其生产及产量在保障我国粮食安全方面占有特别重要的地位。
近20年来迅速发展起来的以DNA分子标记技术为基础的分子标记辅助选择育种(Marker-AssistedSelection,MAS)方法为传统水稻育种工作提供了崭新的工具。SNP分子标记具有数量丰富、密度高、遗传相对稳定、高精确性、效率更高、在基因组中分布范围广以及易于实行自动化、规模化的分析等优势，已成长为最具有发展潜力的新一代分子标记。
近年来，基于高通量测序技术，已经从水稻基因组中挖掘出几十万个SNP。发展低成本、高效率的水稻SNP标记体系，将有助于更加经济、高效地利用这些SNP信息。HRM(High-ResolutionMelting，高分辨率熔解曲线)是一种低成本、中高通量的SNP分型技术，该技术利用饱和荧光染料与双链DNA结合，通过监测双链DNA熔解过程中荧光强度的变化而形成不同的熔解曲线实现对SNP的准确分型。利用基于HRM的分子标记应用报道在近几年迅速增长，有望成为高通量SNP分型技术的新增长点，但是目前并没有一种可构建水稻全基因SNP标记的标准方法。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于HRM的水稻全基因组SNP标记开发的方法及应用，对于提高SNP应用效率和促进水稻分子育种具有实践意义。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种基于HRM的水稻全基因组SNP标记开发的方法，包括以下步骤：(1)从水稻SNP信息数据库HapRice和RICE6K中获取水稻的全基因组SNP分子标记信息，得候选SNP标记；
(2)基于所述候选SNP标记设计特异性引物，以水稻基因组DNA模板进行PCR扩增，得扩增产物；
(3)对所述扩增产物进行HRM检测和基因分型分析，筛选至少在2个水稻样品中表现出多态性的候选SNP构建HRM-SNP分子标记图谱。
优选的，步骤(1)中筛选所述数据库中非A/T和非G/C、前后30bp不包含重复单元和前后30bp区域GC含量介于30％～70％的SNP作为候选SNP标记。
优选的，设计步骤(2)所述特异性引物时，引物长度为19～25bp，退火温度为57～64℃，引物中GC含量为40～60％，且利用所述特异性引物得到的PCR产物长度为50～90bp。
优选的，步骤(2)所述PCR扩增的程序，包括：95℃预变性1min；95℃变性15s，57℃退火25s，72℃延伸10s，36个循环；72℃延伸2min。
优选的，步骤(3)中利用LightScanner96系统对扩增产物直接进行HRM检测。
优选的，步骤(3)中利用MapChart软件对筛选得到的SNP标记进行标记图谱的绘制。
本发明还提供了利用上述方法得到的水稻SNP分子标记。
本发明还提供了所述水稻SNP分子标记在定位水稻突变基因中的应用。
本发明利用水稻SNP信息数据库HapRice以及RICE6K，挖掘基于HRM技术的全基因组SNP分子标记。在本发明实施例中将挖掘到的全基因组SNP分子标记应用于不同水稻品种的遗传背景分析，并以斑点叶突变基因的初步定位为例，验证HRM-SNP标记体系的应用价值，本发明所述方法对于提高SNP应用效率、促进水稻分子育种具有实践意义。本发明实施例中利用6个具有不同遗传背景的水稻材料，开发出599个基于HRM技术的SNP分子标记，并构建覆盖水稻12条染色体的HRM-SNP分子标记图谱，该图谱标记密度达到1.60个SNP/Mb，任一SNP标记至少在2个实验材料之间表现有多态性，利用该套标记将一个斑点叶基因Spl32(t)定位于水稻第11号染色体的22.35Mb～24.07Mb之间。
附图说明
图1为候选SNP标记数量分布图；
图2为候选SNP标记的分型检测图；
图3为水稻1号至4号染色体基因组SNP标记图谱；
图4为水稻5号至8号染色体基因组SNP标记图谱；
图5为水稻9号至12号染色体基因组SNP标记图谱；
图6为分离群体分组分析法定位斑点叶突变基因。
具体实施方式
本发明提供了一种基于HRM的水稻全基因组SNP标记开发的方法，包括以下步骤：(1)从水稻SNP信息数据库HapRice和RICE6K中获取水稻的全基因组SNP分子标记信息，得候选SNP标记；
(2)基于所述候选SNP标记设计特异性引物，以水稻基因组DNA模板进行PCR扩增，得扩增产物；
(3)对所述扩增产物进行HRM检测和基因分型分析，筛选至少在2个水稻样品中表现出多态性的候选SNP构建HRM-SNP分子标记图谱。
本发明从水稻SNP信息数据库HapRice和RICE6K中获取水稻的全基因组SNP分子标记信息，得候选SNP标记。本发明优选从所述数据库中筛选非A/T和非G/C、前后30bp不包含重复单元和前后30bp区域GC含量介于30％～70％的SNP作为候选SNP标记。在本发明中，HapRice数据库公布出的水稻种质核心SNP标记的数量为768个，经过初步筛选共得到595个符合标准的候选SNP标记位点，其中1号染色体标记数量最多为68个；10号染色体标记数量最少为36个；平均每条染色体SNP标记数量为49个。因此初步筛选出的候选SNP标记在染色体上整体分布较为均匀，适于SNP标记图谱的开发。RICE6K数据库公布的SNP位点数量为5636个，经过初步筛选得到4784个SNP标记。作为对前期HapRice数据库中所开发的SNP标记的补充，在已开发的物理位置距离较远的相邻SNP标记之间进行补充开发，对4784个标记进行了再次筛选，共得到1276个候选SNP标记，其中2号染色体标记数量最多为167个；12号染色体标记数量最少为51个；平均每条染色体SNP标记数量为106个。其候选SNP标记数量较多，能够满足后续SNP标记补充开发的需要。
本发明基于所述候选SNP标记设计特异性引物，以水稻基因组DNA模板进行PCR扩增，得扩增产物。本发明优选利用BatchPrimer3在线网页程序对获得的候选SNP标记进行PCR引物设计，具体的参数设置优选为：PCR产物长度优选为50～90bp，更优选为65bp；引物长度优选为19～25bp，更优选为22bp；Tm值优选为57～64℃，更优选为61℃。本发明为了尽量多的获得引物，在进行引物设计时优选选择GC含量在40～60％范围以内设计引物。本发明所述引物的合成优选由上海生工生物工程(股份)有限公司完成。
本发明以水稻基因组DNA模板进行PCR扩增，所述水稻基因组DNA优选通过CTAB法提取得到。本发明所述PCR扩增的体系优选为10μL体系，更优选包括：2×PowerTaqPCRMasterMix母液4μL、引物F/R各0.3μL、0.5μL的EvaGreen荧光染料、温度内标H/L各0.8μL以及0.5μL基因组DNA，最后用双蒸水补足10μL。本发明所述PCR扩增的程序，优选包括：95℃预变性1min；95℃变性15s，57℃退火25s，72℃延伸10s，36个循环；72℃延伸2min。
本发明对所述扩增产物进行HRM检测和基因分型分析，筛选至少在2个水稻样品中表现出多态性的候选SNP构建HRM-SNP分子标记图谱。本发明在进行所述HRM检测前，优选在所述扩增产物中加入20μL的矿物油，利用通过96方孔深板改制的96孔板适配器将扩增产物离心转移至HRM检测板中。本发明优选利用LightScanner96系统对扩增产物直接进行HRM检测，之后用小片段法进行基因分型分析，根据熔解曲线的特征对实验材料进行基因分型，筛选在至少2个实验材料中具有多态性的SNP标记将被用于构建HRM-SNP分子标记图谱。本发明优选利用MapChart软件对筛选得到的SNP标记进行标记图谱的绘制。
本发明还提供了利用上述方法得到的水稻SNP分子标记。
本发明所述方法以在6个实验材料为例进行说明，从HapRice数据库中筛选的候选SNP标记，经过HRM检测筛选得到了在6个实验材料的PCR扩增产物中表现有特异峰的标记总共有426个，其中能够对至少2个实验材料进行分型即具有多态性的标记总数为394个；从RICE6K数据库筛选的候选SNP标记，经过HRM检测筛选得到了在6个实验材料的PCR扩增产物中表现有特异峰的标记总共有439个，其中能够对至少2个实验材料进行分型即具有多态性的标记总数为205个。本发明所述方法基于HRM技术的检测最终获得了599个在至少2个实验材料之间表现有多态性的SNP分子标记。
本发明还提供了所述水稻SNP分子标记在定位水稻突变基因中的应用。本发明以水稻斑点叶基因spl32为例进行说明，将斑点叶突变基因定位在第11号染色体22.35Mb～24.07Mb之间。
下面结合实施例对本发明提供的基于HRM的水稻全基因组SNP标记开发的方法及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
1.1供试材料
用于标记开发的6个水稻品种类型分别是：Francis(热带粳稻)、日本晴(温带粳稻)、Kasalath(南亚籼稻)、五丰B(WB，籼稻保持系)、航恢173(R173，籼稻恢复系)、粤丰新占(籼稻常规稻)。这6个材料具有不同的遗传背景，基因组差异较大，是验证SNP多态性较为理想的材料。上述材料由华南农业大学提供。Francis(热带粳稻)、日本晴(温带粳稻)、Kasalath(南亚籼稻)、五丰B(籼稻保持系)、航恢173(籼稻恢复系)、粤丰新占(籼稻常规稻)
1.2SNP位点的获取
从已公开发表的数据库HapRice和RICE6K中获取SNP相关的信息。以SNP为非A/T和非G/C、前后30bp不包含重复单元、前后30bp区域GC含量介于30％～70％的标准对两个数据库进行SNP筛选。
根据初步筛选标准，对已公开发表的HapRice和RICE6K两个水稻重要SNP分子标记数据库进行分析，筛选结果及其分布如图1所示：在HapRice数据库中，其公布出的水稻种质核心SNP标记的数量为768个。经过初步筛选共得到595个符合标准的候选SNP标记位点。其中1号染色体标记数量最多为68个；10号染色体标记数量最少为36个；平均每条染色体SNP标记数量为49个。可以看出所选的候选SNP标记在染色体上整体分布较为均匀，适于SNP标记图谱的开发。在RICE6K数据库中，SNP位点的数量为5636个，经过初步筛选得到4784个SNP标记。作为对前期HapRice数据库中所开发的SNP标记的补充，在已开发的物理位置距离较远的相邻SNP标记之间进行补充开发，对4784个标记进行了再次筛选，共得到1276个候选SNP标记，其中2号染色体标记数量最多为167个；12号染色体标记数量最少为51个；平均每条染色体SNP标记数量为106个。其候选SNP标记数量较多，能够满足后续SNP标记补充开发的需要。
1.3引物的设计与合成
利用BatchPrimer3在线网页程序对获得的候选SNP标记进行PCR引物设计。参数设置为：PCR产物长度在50～90bp范围内，最优为65bp；引物长度在19～25bp范围内，最优为22bp；Tm值在57～64℃范围内，最优为61℃；为了尽量多的获得引物，在进行引物设计时选择的GC含量在40～60％范围以内。引物合成是由上海生工生物工程(股份)有限公司完成。
利用在线网页程序Batchprimer3对所获得的候选SNP位点进行引物设计。基于HapRice数据库中的595个候选位点设计出的SNP标记引物总共有552对，成功率达到92.8％；基于RICE6K数据库中的1276个候选位点设计出的SNP标记引物总共有1119对，成功率达87.7％。整个标记开发过程中，针对两个数据库SNP位点总共设计合成了1069对引物，提供了数量众多且有利用价值的候选SNP标记。
1.4DNA的提取与PCR扩增
利用了CTAB法提取水稻DNA。实验所配制的PCR反应体系为2×PowerTaqPCRMasterMix母液4μL、引物F/R各0.3μL、0.5μL的EvaGreen荧光染料、温度内标H/L各0.8μL以及0.5μL基因组DNA，最后用双蒸水补足10μL。然后用PCR仪进行扩增，扩增程序为：95℃1min，36×(95℃，15s；57℃，25s；72℃，10s)；72℃，2min。
1.5 HRM检测
在PCR产物中加入20μL的矿物油，利用通过96方孔深板改制的96孔板适配器将PCR产物离心转移至HRM检测板中。利用LightScanner96系统对PCR产物直接进行HRM检测，之后用小片段法进行基因分型分析，根据熔解曲线的特征对6个实验材料进行基因分型。其中在至少2个实验材料中具有多态性的SNP标记将被用于构建HRM-SNP分子标记图谱。
利用上述合成的引物对实验材料进行PCR扩增和HRM检测，对参试材料进行基因分型。图2为利用HRM技术对实验材料PCR产物的扩增产物进行检测的结果示例图，图中分别选用了分型成功的NIAS_Os_ah06000736标记(图2中a和b)与分型失败的NIAS_Os_ah07001325标记(图2中c和d)。NIAS_Os_ah06000736标记在HRM检测中将将实验材料分型为4个不同的类型，每种类型都具有特异的峰图曲线(图2中a)，由此可判断出各实验材料在该标记上表现出了多态性(图2中b)；NIAS_Os_ah07001325标记在HRM检测中未能将各实验材料区分开来(图2中c)，因此各实验材料在该标记上没有多态性(图2中d)。该两种类型SNP标记熔解曲线都具有特异峰，其中具有能够对实验材料进行分型的特异峰的SNP标记，被认为是可利用的SNP标记，并将其归为HRM-SNP分子标记体系。
根据上述的读图与筛选方法，开展所有引物的PCR扩增和HRM检测。从HapRice数据库中筛选的候选SNP标记，经过HRM检测筛选得到了在6个实验材料的PCR扩增产物中表现有特异峰的标记总共有426个，其中能够对至少2个实验材料进行分型即具有多态性的标记总数为394个；从RICE6K数据库筛选的候选SNP标记，经过HRM检测筛选得到了在6个实验材料的PCR扩增产物中表现有特异峰的标记总共有439个，其中能够对至少2个实验材料进行分型即具有多态性的标记总数为205个。本研究基于HRM技术的检测最终获得了599个在至少2个实验材料之间表现有多态性的SNP分子标记。以上获得的SNP分子标记全部转化并组成HRM-SNP分子标记图谱。
1.6SNP分子标记物理图谱的绘制
根据RICE6K和HapRice两个数据库中SNP标记在水稻各染色体上的物理位置，本研究利用了MapChart软件对前期实验所筛选得到的SNP标记进行了标记图谱的绘制。结果如图3～5所示：在所开发的HRM-SNP标记体系中，SNP标记数量最多的为1号染色体，达到了67个标记；SNP标记数量最少的为9号染色体，达到34个标记；每条染色体的平均标记数量为50个。而在标记分布密度上，最高的为11号染色体达到2.17个SNP/Mb，最低的为2号染色体达到1.45个SNP/Mb，平均标记密度为1.60个SNP/Mb。其他各染色体上所开发的SNP标记的分布密度则较为接近，并未出现较大幅度的变化，可见利用本发明所述方法开发的HRM-SNP标记体系在各染色体上的标记分布较为合理。
1.7突变基因定位
采用分离群体分组分析法对斑点叶突变基因进行定位。
在F2分离群体中选出10株斑点叶单株并混合提取DNA，10株正常叶无斑点单株并混合提取DNA，加上两个亲本材料DNA和两亲本等量混合DNA，共5个样品进行SNP多态性分析。其中无斑点基因混合池与亲本Francis熔解曲线高度一致、而斑点叶基因混合池表现为杂合的SNP标记，与目标基因存在连锁关系。
首先对包括Francis(热带粳稻)、日本晴(温带粳稻)、Kasalath(南亚籼稻)、五丰B(籼稻保持系)、航恢173(籼稻恢复系)、粤丰新占(籼稻常规稻)等6个代表性水稻材料进行了遗传背景分析，结果如表1所示：参试材料中多态性位点数量最多的是日本晴与WB为453个，多态率达到75.63％；多态性位点数量最少的是R173与粤丰新占为204个，多态率达到34.06％。Francis与各籼稻品种之间多态性位点数量则低于日本晴与各籼稻品种之间多态性位点数量，可见相比于日本晴，Francis与各籼稻品种具有更近的遗传背景。各籼稻品种之间的SNP多态性位点的数量也有区别，如Kasalath与其余各籼稻品种之间的多态性位点数量在285-341之间，多态率在47.58％-56.93％之间；WB与R173和粤丰新占之间的多态性位点数量分别为232个和225个，多态率分别为38.73％和37.56％；而R173与粤丰新占多态性位点数量则为204个，多态率为34.06％。即在籼稻品种中，R173与粤丰新占遗传背景最为相近，WB与前两者次之，Kasalath则与前三者较远；粳稻品种与籼稻品种遗传背景相差很大，其中日本晴与各籼稻品种最远，Francis次之。
表1 599个SNP分子标记在不同亲本之间的多态性
Figure BDA0002500087980000091
水稻斑点叶基因spl32(t)已被初步定位在第11号染色体上的Ind-c和RM206两个标记19.84Mb-22.48Mb之间(钟振泉,罗文龙,刘永柱,等.一份新的水稻斑点叶突变体spl32的鉴定和基因定位.作物学报,2015,41(06):861-87)。利用HRM-SNP分子标记图谱对斑点叶突变基因进行进一步的定位。
用于连锁分析的HRM-SNP标记是在Francis和粤丰新占之间存在多态性的标记，总数为378个。利用分离群体分组分析法对水稻斑点叶突变基因进行定位，HRM检测结果如图6所示，在上述所选用的378个多态性SNP标记中，F1122351206CT标记(图6中a和b)和NIAS_Os_ad11010169标记(图6中c和d)与目标斑点叶突变基因存在连锁关系。
在图6中，F1122351206CT、NIAS_Os_ad11010169在两个亲本Francis和spl32间表现有多态性，而且由两亲本混合材料所提取的DNA的熔解曲线波形也和两个亲本的曲线波形不同，说明该标记能够有效地区分两个亲本材料。标记在有斑点和无斑点两个基因池的熔解曲线波形比较中，也表现出明显的多态性，由分离群体分组分析法定位的原理可知，该材料中斑点叶突变基因和F1122351206CT、NIAS_Os_ad11010169标记具有连锁效应。根据F1122351206CT标记和NIAS_Os_ad11010169标记在染色体上的位置，利用分离群体分组分析法定位斑点叶突变基因大致的位置在第11号染色体22.35Mb-24.07Mb之间。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种基于HRM的水稻全基因组SNP标记开发的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)从水稻SNP信息数据库HapRice和RICE6K中获取水稻的全基因组SNP分子标记信息，得候选SNP标记；
(2)基于所述候选SNP标记设计特异性引物，以水稻基因组DNA模板进行PCR扩增，得扩增产物；
(3)对所述扩增产物进行HRM检测和基因分型分析，筛选至少在2个水稻样品中表现出多态性的候选SNP构建HRM-SNP分子标记图谱。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(1)中筛选所述数据库中非A/T和非G/C、前后30bp不包含重复单元和前后30bp区域GC含量介于30％～70％的SNP作为候选SNP标记。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，设计步骤(2)所述特异性引物时，引物长度为19～25bp，退火温度为57～64℃，引物中GC含量为40～60％，且利用所述特异性引物得到的PCR产物长度为50～90bp。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(2)所述PCR扩增的程序，包括：95℃预变性1min；95℃变性15s，57℃退火25s，72℃延伸10s，36个循环；72℃延伸2min。
5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(3)中利用LightScanner96系统对扩增产物直接进行HRM检测。
6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(3)中利用MapChart软件对筛选得到的SNP标记进行标记图谱的绘制。
7.利用权利要求1～6任一项所述方法得到的水稻SNP分子标记。
8.权利要求7所述水稻SNP分子标记在定位水稻突变基因中的应用。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN110029187A (zh) * 2019-04-29 2019-07-19 华南农业大学 一种基于竞争性等位pcr构建水稻分子标记图谱的方法及利用其进行育种的应用

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Title
ANKE LEHMENSIEK: "The use of high resolution melting (HRM) to map single nucleotide polymorphism markers linked to a covered smut resistance gene in barley", 《THEOR APPL GENET》 *
郭海洋: "基于HRM技术的水稻全基因组SNP标记开发及其初步应用", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 农业科技辑》 *

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