CN104878093B - 一种与辣椒抗疫病基因紧密连锁的分子标记及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种与辣椒抗疫病基因紧密连锁的分子标记及其应用。本发明的分子标记由SEQ ID No.1所示的DNA分子和SEQ ID No.2所示的DNA分子组成。通过实验证明：本发明的分子标记ZL6726特异性强，可用于辣椒分子标记辅助育种，通过苗期筛选即可对抗病植株进行选择，可节约成本，提高选择效率，大大加速育种进程，为进一步通过染色体步移法精细定位并克隆抗病基因奠定了基础。

Description

一种与辣椒抗疫病基因紧密连锁的分子标记及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种与辣椒抗疫病基因紧密连锁的分子标记及其应用。
背景技术
辣椒疫病(Phytophthora bligh)是由疫霉菌(Phytophthora capsici Leon.)引起的一种毁灭性的土传病害。该病1918年首次在美国发现，现已在世界各地的辣椒种植区发生。我国自20世纪50年代在江苏发现辣椒疫病以来，至今已在多个省份发生过，成为影响我国辣椒生产的主要障碍。该病可在辣椒生长的任何时期，侵染植株的任何部位，雨水、土壤、气流等均可成为疫病的传播途径。目前生产上防治疫病的方法主要是化学防治，但该方法会造成环境污染，并且由于选择压力的存在，疫霉菌易发生变异而产生抗药性，从而增加了防治的难度。
国内外研究和生产实践证明，选育抗病品种是防治和减轻疫病危害的最经济、安全和有效的防治方法。为此，在抗源材料的筛选以及抗疫病基因定位方面已经有很多报道。现在被公认的抗源材料有CM334、PI 201234、Perennial等。关于抗疫病基因的定位，大部分研究都是将辣椒的该抗性作为数量性状抗性进行定位，并将抗病性位点定位在多个染色体上，但最近的研究得出的较为一致的结论为，控制抗性的主要QTL位点位于辣椒的5号染色体上，并且在该染色体的三个QTL位点(Pc5.1、Pc5.2和Pc5.3)中，Pc5.1对抗性的贡献率最高。
随着现代生物技术的迅猛发展，分子标记辅助选择育种成为育种工作的重要辅助手段。该技术是利用与决定特定性状基因紧密连锁的分子标记，通过对标记进行检测来确定基因是否存在，从而大大加速育种进程，节约大量成本，显著缩短了育种周期。另外，在聚合育种方面，分子标记辅助选择的优势更加明显。因此，开发有效的分子标记对于新品种的选育具有重要意义。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种用于鉴定待测辣椒是否抗辣椒疫病的引物对。
本发明提供的用于鉴定待测辣椒是否抗辣椒疫病的引物对由SEQ ID No.1所示的DNA分子和SEQ ID No.2所示的DNA分子组成。
本发明的另一个目的是提供一种用于鉴定待测辣椒是否抗辣椒疫病的PCR试剂。
本发明提供的用于鉴定待测辣椒是否抗辣椒疫病的PCR试剂包括上述引物对。
本发明还有一个目的是提供一种用于鉴定待测辣椒是否抗辣椒疫病的试剂盒。
本发明提供的用于鉴定待测辣椒是否抗辣椒疫病的试剂盒包括上述引物对或上述PCR试剂。
上述引物对或上述PCR试剂或上述试剂盒中，所述辣椒疫病的病原菌为辣椒疫病生理小种2。
上述引物对或上述PCR试剂或上述试剂盒在鉴定或辅助鉴定待测辣椒是否抗辣椒疫病中的应用也属于本发明的保护范围。
上述引物对或上述PCR试剂或上述试剂盒在鉴定或辅助鉴定待测辣椒是否为抗辣椒疫病品种中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明的另一个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定待测辣椒是否抗辣椒疫病的方法。
本发明提供的鉴定或辅助鉴定待测辣椒是否抗辣椒疫病的方法包括如下步骤：
(1)用上述引物对对待测辣椒进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
(2)检测所述PCR扩增产物的大小；
若PCR扩增产物含有大小为195bp的片段，则待测辣椒抗辣椒疫病或候选抗辣椒疫病；
若PCR扩增产物含有大小为152bp的片段且不含有195bp，则待测辣椒不抗椒疫病或候选不抗辣椒疫病；
上述方法中，所述PCR扩增的模板为待测辣椒的基因组DNA。
上述方法中，所述PCR扩增的退火温度为50℃。
上述引物对或上述PCR试剂或上述试剂盒或上述方法在辣椒疫病分子标记辅助育种或抗病基因定位中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明的有益效果：
(1)本发明所提供的分子标记ZL6726(引物对)可用于分子标记辅助育种，具有特异性强、稳定性高的特点；
(2)本发明的分子标记ZL6726(引物对)对检测设备和底物模板质量的要求不高，且所扩增的特异片段较小且在抗感材料间差异明显，检测周期短，适合高通量、自动化操作，适用于现代分子标记辅助育种的实践；
(3)本发明为辣椒抗疫病基因的精细定位及克隆提供了重要的遗传学信息，可进一步通过染色体步移法精细定位基因，从而克隆该基因；
(4)本发明的分子标记ZL6726(引物对)可应用于辣椒育种工作，不仅可以极大降低辣椒疫病流行对辣椒生产造成的经济损失，还可降低生产成本，降低农药的使用量。
本发明采用灌根接种法对辣椒抗疫病材料PI 201234和高度感病材料上海园椒及其构建的F1、F2、BC1P1、BC1P2群体进行抗病性鉴定，通过分析发现PI 201234对辣椒疫病生理小种2的抗性符合单基因显性遗传模式。通过引物筛选以及对F2群体的基因型进行分析，发现位于5号染色体上的分子标记ZL6726与抗病基因紧密连锁。根据连锁遗传图谱显示，分子标记ZL6726(引物对)与抗病基因的遗传距离均为1.3cM。通过实验证明：本发明的分子标记ZL6726(引物对)特异性强，可用于辣椒分子标记辅助育种，通过苗期筛选即可对抗病植株进行选择，可节约成本，提高选择效率，大大加速育种进程，为进一步通过染色体步移法精细定位并克隆抗病基因奠定了基础。
附图说明
图1为辣椒抗疫病基因的SSR标记连锁遗传图谱。其中，X代表抗病基因。
图2为分子标记ZL6726在双亲、抗感池以及F2群体中随机挑选的抗病和感病单株中的扩增结果。其中，1：感病亲本上海园椒；2：抗病亲本PI 201234；3：感病池；4：抗病池；5-14：F2群体中10株抗病单株；15-24：F2群体中10株感病单株。
图3为分子标记ZL6726在各抗感品种中的扩增结果。其中，1：农大40；2：茄门；3：Early Calwonder；4：卡佩诺；5：脆龙216；6：超级108；7：益都红；8：辛香4号；9：遵椒2号；10：PI201234；11：PBC602。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例所用的辣椒感疫病品种上海园椒作为母本(P1)，辣椒抗疫病品种PI201234作为父本(P2)，利用两个亲本配制得到F1、BC1P1、BC1P2和F2群体。
下述实施例中的辣椒感疫病品种上海园椒在文献“青椒一代杂种上海园椒×茄门及其制种技术”中公开过；辣椒抗疫病品种PI 201234在文献“Resistance To FoliarBlight And Crown Rot Of Pepper Caused by Phytophthora capsici”中公开过，公众可从中国农业大学农学与生物技术学院获得。
茄门和Early Calwonder均为高度感病的辣椒品种，茄门在文献“A Novel Pepper(Capsicum annuum L.)WRKY Gene,CaWRKY30,Is Involved in Pathogen StressResponses”中公开过；Early Calwonder在文献“Effect of soil matric potential andperiodic floodingon mortality of peppercaused by Phytophthora capsici”中公开过，公众可从中国农业大学农学与生物技术学院获得。
下述实施例中的辣椒疫病的病原菌属于生理小种2，在文献“GeneticallyDiverse Long-Lived Clonal Lineages of Phytophthora capsici from Pepper inGansu,China”中公开过，公众可从中国农业大学农学与生物技术学院获得。
下述实施例中的辣椒疫病病原菌的孢子悬浮液的制备方法：用直径为1cm的打孔器在辣椒疫病的病原菌菌落边缘选取带有菌丝的培养基，将其置于装有CA培养基(CA培养基的制备方法：称取200g胡萝卜，切成小块放入榨汁机并加少量水，将其粉碎后用四层纱布将滤液过滤到烧杯中，称取14g琼脂粉放入滤液中并混匀，加水将溶液定容至1L，将混匀后的溶液转入2L的锥形瓶中，高压蒸汽灭菌40分钟，每个培养皿中倒入约15ml培养基)的培养皿中心，密封好后将培养皿置于培养箱中，温度控制在25℃，暗培养5～6天。然后，将培养皿换至光照下培养，光周期为12h光照/12h黑暗，温度为25℃。光暗交替培养5-7天后，疫霉菌可产生大量孢子囊，在培养基表面加入10ml无菌去离子水，然后将培养皿放到4℃冰箱内，30min后移至室温放置，30～60min后游动孢子释放。用两层纱布过滤得到孢子悬浮液，借助于血球计数板计算孢子的数量，用无菌去离子水稀释至每毫升约105个孢子，得到辣椒疫病病原菌的孢子悬浮液。
实施例1、分子标记ZL6726的获得
一、苗期辣椒的抗病性分析
1、苗期辣椒的抗病性鉴定
采用灌根接种法对辣椒感疫病品种上海园椒、辣椒抗疫病品种PI 201234及利用两个亲本配制得到F1、BC1P1、BC1P2和F2群体进行抗病性鉴定，以茄门和Early Calwonder为对照。两亲本各50株，F1群体67株，BC1P1群体48株，BC1P2群体55株，F2群体795株，茄门和Early Calwonder各20株。具体步骤如下：待幼苗长至6叶期时，在距幼苗根部约3cm处，扎一3cm深的孔，将1ml浓度为105个/m1的辣椒疫病病原菌(生理小种2)的游动孢子悬浮液注入孔内，接种温度为25℃，接种后保持湿润状态，14天后分0-5级进行病情调查。
分级标准参照1999年农业部颁布的灌根法接种分级标准：0级：无病症；1级：幼苗根茎部轻微变黑，叶片不萎蔫或可恢复性萎蔫；2级：幼苗根茎部变黑1～2cm，叶片不可恢复性萎蔫，下部叶片偶有脱落；3级：幼苗根茎部变黑2cm以上，叶片不可恢复性萎蔫或叶片脱落明显；4级：幼苗根茎部变黑缢缩，除生长点外叶片全部脱落或植株萎蔫；5级：植株枯死。根据该标准，0-1级定为抗病，2-5级定为感病。对各世代群体用卡方检验进行分离比适合度测验，确定品种抗性的遗传模式。
2、苗期辣椒的抗病性鉴定结果
苗期辣椒的抗病性鉴定结果表明：辣椒抗病材料PI 201234的所有单株未发病；感病材料上海园椒的所有单株均表现为高度感病；对照材料茄门和Early Calwonder均表现为高度感病；F1和BC1P2两个群体的所有单株全部表现为抗病；F2群体中抗病植株有583株，感病植株有211株，经c2检验符合3R:1S的分离比例(c2＝{3:1}＝1.050<3.84，p＝0.05)；BC1P1群体中抗病植株有20株，感病植株有28株，经c2检验符合1R:1S的分离比例(c2＝{1:1}＝1.333<3.84，p＝0.05)，以上结果表明PI201234对辣椒疫病生理小种2的抗性是由1对显性基因控制的。
二、分子标记ZL6726的获得
采用CTAB法分别提取感病品种和抗病品种的基因组DNA，并采用混合分组分析法(Bulked Segregation Analysis，BAS法)进行分子标记的筛选。具体步骤如下：
1、抗感池的获得
在F2分离群体中随机选取10株极端抗病植株和10株极端感病植株，分别提取DNA，然后将10株抗病植株的DNA等量混合，得到抗病池，将10株感病植株的DNA等量混合，得到感病池。
2、分子标记ZL6726的获得
根据已公布的辣椒基因组5号染色体的核苷酸序列设计分子标记，利用两个亲本(辣椒感疫病品种上海园椒和辣椒抗疫病品种PI 201234)和两个混池(抗病池和感病池)对212对分子标记的多态性进行筛选。
经过筛选，发现分子标记ZL6726在双亲、抗感池间具有多态性，且该分子标记所扩增出的条带清晰，在父母本间的差异明显(图2)。分子标记ZL6726的核苷酸序列如下所示：
ZL6726F：5’-TCCAGCCATCCATTATTTCAT-3’(序列1)；
ZL6726R：5’-ATCCCGAACTGCCAATAATTA-3’(序列2)。
从图2中可以看出：分子标记ZL6726在辣椒感疫病品种的基因组DNA扩增产物含有大小为152bp的片段且不含有大小为195bp的片段；分子标记ZL6726在辣椒抗疫病品种的基因组DNA扩增产物含有大小为195bp的片段。
三、遗传连锁分析和抗病基因的定位
利用在双亲、抗感池间筛选的具有多态性的分子标记ZL6726分析F2群体的794个单株的基因型，并结合F2群体的794个单株田间的抗病性鉴定结果，利用JoinMap4.0软件绘制抗病基因的连锁遗传图谱。
结果表明：分子标记ZL6726与抗病基因的遗传距离均为1.3cM(图1)。
实施例2、分子标记ZL6726的应用
一、供试材料
本发明用5个抗病品种和6个感病品种对实施例1获得的分子标记ZL6726进行验证，辣椒疫病的病原菌为辣椒疫病生理小种2。抗病品种：益都红、辛香4号、遵椒2号、PI201234、PBC602；感病品种：农大40、茄门、Early Calwonder、卡佩诺、脆龙216、超级108。PI201234、PBC602、Early Calwonder品种均在文献“Genetically Diverse Long-LivedClonal Lineages Phytophthora capsici from Pepper in Gansu,China”中公开过，公众可从中国农业大学农学与生物技术学院获得。
二、实验方法
分别以上述供试材料的基因组DNA为模板，采用分子标记ZL6726进行PCR，得到PCR扩增产物，将PCR扩增产物用7％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，硝酸银染色后观察照相。并对PCR扩增产物进行测序。
PCR扩增反应体系(20μl)：包括2μl DNA工作液、2μl 10×Buffer缓冲液、0.8μldNTPs、0.4μl DNA聚合酶、正向引物和反向引物各0.2μl(10uM/L)，用14.4μl ddH2O将总体积补齐至20μl。
PCR扩增反应程序：94℃预变性3min；94℃变性30min，50℃退火45s，72℃延伸50s，35个循环；72℃延伸8min；
电泳结果如图3所示：其中，泳道1：农大40；泳道2：茄门；泳道3：Early Calwonder；泳道4：卡佩诺；泳道5：脆龙216；泳道6：超级108；泳道7：益都红；泳道8：辛香4号；泳道9：遵椒2号；泳道10：PI201234；泳道11：PBC602。分子标记ZL6726在抗病品种(益都红、辛香4号、遵椒2号、PI201234、PBC602)的PCR扩增产物均含有大小为195bp的片段(测序验证大小)；分子标记ZL6726在感病品种(农大40、茄门、Early Calwonder、卡佩诺、脆龙216、超级108)的PCR扩增产物均含有大小为152bp的片段且不含有大小为195bp的片段(测序验证大小)，与供试品种的抗病性鉴定结果一致，说明本发明的分子标记ZL6726特异性强，可用于辣椒疫病感抗品种的筛选。

Claims (10)

1.用于鉴定待测辣椒是否抗辣椒疫病的引物对，其由SEQ ID No.1所示的DNA分子和SEQ ID No.2所示的DNA分子组成。
2.用于鉴定待测辣椒是否抗辣椒疫病的PCR试剂，包括权利要求1所述的引物对。
3.用于鉴定待测辣椒是否抗辣椒疫病的试剂盒，包括权利要求1所述的引物对或权利要求2所述的PCR试剂。
4.根据权利要求1所述的引物对或权利要求2所述的PCR试剂或权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述辣椒疫病的病原菌为辣椒疫病生理小种2。
5.权利要求1所述的引物对或权利要求2所述的PCR试剂或权利要求3所述的试剂盒在鉴定或辅助鉴定待测辣椒是否抗辣椒疫病中的应用；所述辣椒疫病是由辣椒疫病生理小种2引起的。
6.权利要求1所述的引物对或权利要求2所述的PCR试剂或权利要求3所述的试剂盒在鉴定或辅助鉴定待测辣椒是否为抗辣椒疫病品种中的应用；所述辣椒疫病是由辣椒疫病生理小种2引起的。
7.一种鉴定或辅助鉴定待测辣椒是否抗辣椒疫病的方法，包括如下步骤：
(1)用权利要求1所述引物对对待测辣椒进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
(2)检测所述PCR扩增产物的大小；
若PCR扩增产物含有大小为195bp的片段，则待测辣椒抗辣椒疫病或候选抗辣椒疫病；
若PCR扩增产物含有大小为152bp的片段且不含有大小为195bp的片段，则待测辣椒不抗椒疫病或候选不抗辣椒疫病；
所述辣椒疫病是由辣椒疫病生理小种2引起的。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述PCR扩增的模板为待测辣椒的基因组DNA。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于：所述PCR扩增的退火温度为50℃。
10.权利要求1所述的引物对或权利要求2所述的PCR试剂或权利要求3所述的试剂盒或权利要求7-9中任一所述的方法在辣椒疫病分子标记辅助育种或抗病基因定位中的应用；所述辣椒疫病是由辣椒疫病生理小种2引起的。
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Genome sequence of the hot pepper provides insights into the evolution of pungency in Capsicum species;Seungill Kim等;《Nature Genetics》;20140119;第46卷(第3期);第270-278页 *
Whole-genome sequencing of cultivated and wild peppers provides insights into Capsicum domestication and specialization;Cheng Qin等;《PNAS》;20140408;第111卷(第14期);第5135-5140页 *
辣椒疫病抗性位点的分子定位;刘艳 等;《江苏农业学报》;20141231;第30卷(第6期);摘要、第1.2.2-1.2.3节 *
辣椒疫病抗性的SSR分子标记及雄性不育系花粉败育的细胞学观察;马俊平;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 农业科技辑》;20130815(第08期);D048-62 *

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