CN108018375A - 一种鉴定大白菜抗根肿病的分子标记kb1、引物及应用 - Google Patents

一种鉴定大白菜抗根肿病的分子标记kb1、引物及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种与大白菜根肿病抗性基因Crr1a共分离的InDel分子标记KB1、引物及其应用。本发明提供了鉴别或辅助鉴别大白菜是否含有抗根肿病基因Crr1a的方法，包括以待检测大白菜基因组为模板，以本发明提供的引物进行PCR扩增，根据扩增产物的大小，判断待检测大白菜是否含有抗根肿病基因Crr1a，是否为抗根肿病大白菜。利用本发明的分子标记对抗根肿病大白菜进行辅助选择，准确性高，成本低，省时省力。

Description

一种鉴定大白菜抗根肿病的分子标记KB1、引物及应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种鉴别大白菜根肿病抗性的分子标记KB1、引物及其应用。
背景技术
大白菜（Brassica rapa L. ssp. pekinensis）属于十字花科芸薹属，是我国种植面积和产量最大的蔬菜作物之一。根肿病是由根肿菌（Plasmodiophora brassicaeWoronin）引起的土传性疾病，可导致大白菜等十字花科植物的根部异常肿大，形成根瘤，是一种严重的世界性的十字花科植物根部病害，每年可导致全球十字花科蔬菜10%-15%的减产，在发病严重地区，甚至造成绝产，严重威胁十字花科蔬菜的生产。该病最早发现于欧洲，近年来，我国绝大多数省市自治区都有关于根肿病发生的报道，特别是在云南、湖北、辽宁、山东等地区，给我国大白菜等蔬菜的生产造成了巨大影响。
虽然可以采取物理和化学等对根肿菌进行防治，但成本较高，且效果并不明显。培育抗根肿病的新品种，是防治大白菜根肿病最经济、最有效的措施。传统的抗根肿病育种中，每一代都需要采用田间接种病原菌进行性状鉴定的方法，费时费力，且容易受到环境因素的影响。分子标记辅助选择（Marker-assisted selection, MAS）技术为育种工作提供了有利工具，该技术是利用与目标基因连锁的分子标记，通过DNA水平的检测完成都目标性状的选择，提高选择效率，减少工作量，加快育种进程。
利用Williams鉴别系统，对根肿菌的生理小种进行鉴定，发现4号生理小种是我国根肿菌的优势种，致病性强，危害最为严重。在大白菜不同染色体上，至少发现8个根肿病抗性基因或QTLs，其中，在大白菜A08染色体上，有一个抗根肿病基因Crr1a，对4号生理小种具有抗性。虽然有部分与该位点连锁的分子标记公布，但是其连锁性不够高，有一定的假阳性产生，或者检测时，抗病与感病材料差异不明显，结果容易混淆。开发合适的分子标记，用于大白菜抗根肿病品种或品系的选育，可以减少工作量，提高工作效率，降低育种成本，加快育种进程，具有很高的实际应用价值。
发明内容
对于大白菜抗根肿病品种或品系的选育，传统方法需要每代都在田间进行根肿菌接种鉴定抗病性，具有费时、费力易受环境影响等缺点，本发明提供了一种鉴定大白菜根肿病抗性的InDel分子标记、引物及其应用，利用该分子标记可以在大白菜苗期进行DNA水平的鉴定，从而大白菜克服传统育种中需要接种病原菌鉴定抗病性的缺点，简化大白菜抗根肿病品种或品系的培育过程。
本发明提供了一种鉴别或者辅助鉴别大白菜是否为抗根肿病大白菜的InDel分子标记KB1，所述的分子标记单链DNA序列从5’端到3’端为：TTCTCAAGATTAGTCATATTACTAATAGAAGAGGGGAGCTCCACAAGGCTAGAGCATCCAGAAAGATTCAAATTCTCAAGATTAGTCATGTTACCAATAGAAGAGGGGAGTTCCATAAGGCTTGAGCACAGCTTGAGATTCAATTTCTTGAGATTAGTCAAATTCCCAATAGAAGAAGGAAGCTCCATAAGACTTGAACATC
本发明还提供了一种上述鉴定大白菜是否为抗根肿病大白菜的分子标记的特异性引物，其单链DNA序列从5’端到3’端为：
上游引物F：TTCTCAAGATTAGTCATATTACTAA
下游引物R: GGATGTTCAAGTCTTATGGAGCTTC。
本发明可通过以下技术方案实现：提取待检测大白菜样品的基因组DNA作为模板，利用本发明的分子标记特异性引物进行聚合酶链式反应(PCR)扩增，再通过电泳对扩增产物进行检测。具体步骤如下：
1)利用CTAB法提取待测大白菜样品任意组织或器官的基因组DNA。
2)以步骤1所得的待测样品基因组DNA为模板，利用分子标记特异性引物对不同材料进行PCR扩增，获得扩增产物。
3)利用琼脂糖凝胶电泳技术，对步骤2所得的PCR扩增产物进行电泳分离。
4)利用凝胶成像系统，观察PCR扩增产物的位置。
5)通过判断扩增产物的大小，扩增产物较大的为202bp的DNA片段，含有202bp扩增产物的待测样品含有抗根肿病基因Crr1a，为抗根肿病大白菜材料；不含有202bp扩增产物的待测样品不含有抗根肿病基因Crr1a，为非抗根肿病大白菜材料。
上述PCR扩增所用的分子标记特异性引物为如下（1）和（2）：
（1）由序列表中序列2所示的单链DNA分子，或者将序列2删除、增加或突变一个或几个核苷酸，且与序列2具有相同功能的单链DNA分子。
（2）由序列表中序列3所示的单链DNA分子，或者将序列3删除、增加或突变一个或几个核苷酸，且与序列3具有相同功能的单链DNA分子。
本发明公开的一种与大白菜根肿病抗性基因Crr1a共分离的InDel分子标记KB1、引物与现有技术相比，本发明的有益效果是：
（1）通过对PCR扩增产物直接琼脂糖电泳检测，可以清晰地区分大白菜材料是否为抗根肿病大白菜材料，省时省力，不受环境因素影响。
（2）本发明获得的分子标记及其特异性引物，在不同的大白菜甜瓜材料中可以对抗根肿病大白菜进行很好的区分，因此，本发明获得了一个可以高效、准确区分大白菜是否为抗根肿病大白菜材料的分子标记。
（3）本发明方法特异性好，准确率可达到100%。
（4）本发明通过对PCR产物直接琼脂糖电泳检测，比聚丙烯酰胺电泳检测简便快捷；比SNP分子标记的检测降低成本，是实用性很强的分子标记。
表1 本发明与现有技术优缺点比较
附图说明
图1为根肿病抗病材料与感病材料田间根肿病感病表型： G4表示根肿病感病材料，其中G6表示根肿病抗病材料；
图2本发明分子标记的特异性引物以抗根肿病材料G6、根肿病感病材料G4及F2代群体的基因组DNA为模板进行PCR扩增的电泳结果：其中M表示DNA Marker，其余泳道表示不同样品的PCR扩增产物的电泳结果，分别为1号：根肿病感病材料G4；2号：抗根肿病材料G6；其余样品为F2代群体材料。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。以下实施例中所使用的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所用的仪器、材料和试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
以下实施例中的大白菜材料抗根肿病材料G6、根肿病感病材料G4、F1代，公众可从天津科润农业科技股份有限公司蔬菜研究所大白菜课题组获得，该材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其他用途使用。
实施例1.
大白菜含根肿病抗病基因Crr1a的F2分离群体的获得
以大白菜抗根肿病材料G6为母本，感病材料G4为父本，进行杂交获得F1代，F1代经田间抗病性检测，全部为抗病材料。F1代自交获得F2代分离群体，用于大白菜根肿病表型鉴定及分子标记检测。
实施例2.
大白菜F2代分离群体抗根肿病表型鉴定及分子标记检测
一、分离群体根肿病抗性表型鉴定
以实施例1获得的F2群体为材料，播种后接种根肿菌4号生理小种，接种和调查方法参照文献“汪维红等，湖北省长阳县十字花科蔬菜根肿病菌生理小种鉴定及抗源筛选，中国蔬菜，2013 Vol. 1(12)：55-60”中的方法进行。结果表明：66株F2代大白菜植株中，46株表现为抗病，20株表现为感病(图1)
F2群体大白菜根肿病抗性的分子标记检测
二、利用CTAB法提取根肿病抗性材料G6、感病材料G4， F2代分离群体的叶片基因组DNA，具体的步骤为：取幼嫩叶片0.2 g入1.5 mL离心管中，加50 μL 2% CTAB提取缓冲液，研磨，后补齐至400 μL，65℃水浴30 min；加入400 μL氯仿：异戊醇（24:1），轻摇5 min。12000rpm离心5 min；取上清200 μL，加入预冷的异丙醇200 μL混匀，-20℃放置20 min；12000rpm离心10 min；弃上清，加入150 μL预冷乙醇，轻轻混匀洗净，10,000 rpm离心5 min；弃上清，晾干或吹干；加蒸馏水100 μL溶解DNA，室温放置1 h；用蒸馏水将DNA稀释到50 ng/μL，作为PCR模板使用或-20℃保存备用。
以上述基因组DNA为模板，分子标记特异性引物进行PCR扩增，获得扩增产物，特异性引物由上游引物F和下游引物R两条单链DNA组成，其序列如下：
上游引物F：TTCTCAAGATTAGTCATATTACTAA
下游引物R：GGATGTTCAAGTCTTATGGAGCTTC
采用10 µL的反应体系，包括：10×PCR Buffer，1.0 µL；2.5 mM dNTP，0.2 µL；10 µmol·L-1 primers，0.4 µL；5 U·µL-1 Taq，0.2 µL；50 ng·µL-1 DNA ，1.5 µL；ddH2O，6.7µL。
PCR扩增采用的程序为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，57℃复性30 s，72℃延伸30 s，35 个循环；72℃终延伸 5 min。
对PCR扩增产物在2%的琼脂糖凝胶中，150 v恒压电泳30 min，EB染色后，用凝胶成像系统观察结果。也可以将特异性引物及PCR其他成分制成试剂盒，用于鉴定大白菜是否为抗根肿病大白菜。其中，抗病亲本G6中仅扩增出一条大小为202bp的条带，感病亲本G4中仅扩增出一条131bp的条带，F1代同时扩增出202bp和131bp的两个条带。结果表明，在F2代群体中，根肿病抗性表型鉴定为感病的株材料，全部只扩增得到131bp的条带，与感病亲本一致；表型鉴定为抗病的46株材料，均扩增得到202bp的条带，其中23株材料仅扩增到202bp的条带，23株材料扩增到含有202bp和131bp的两条带(图2)。分子标记对大白菜抗根肿病的检测结果与表型鉴定结果完全一致。
对抗根肿病的大白菜植株的PCR扩增产物中202bp的条带进行测序，结果表明：202bp的DNA片段的序列如序列表中序列1所示的单链核苷酸序列，即本申请中分子标记KB1的序列。由此可知，本申请中分子标记KB1及其引物对大白菜根肿病分子检测的结果与根肿病抗性田间表型鉴定的结果完全一致，该分子标记KB1所示的核苷酸序列与大白菜的根肿病抗性基因Crr1a是共分离标记，可以利用该序列及其引物对大白菜的根肿病抗性进行鉴定或辅助鉴定。
SEQUENCE LISTING
<110> 天津科润农业科技股份有限公司
<120> 一种鉴定大白菜抗根肿病的分子标记KB1、引物及应用
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 202
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ttctcaagat tagtcatatt actaatagaa gaggggagct ccacaaggct agagcatcca 60
gaaagattca aattctcaag attagtcatg ttaccaatag aagaggggag ttccataagg 120
cttgagcaca gcttgagatt caatttcttg agattagtca aattcccaat agaagaagga 180
agctccataa gacttgaaca tc 202
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ttctcaagat tagtcatatt actaa 25
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ggatgttcaa gtcttatgga gcttc 25

Claims (8)

1.一种用于鉴别或者辅助鉴别大白菜是否为抗根肿病大白菜的InDel分子标记KB1，其特征在于，所述的分子标记从5’端到3’端的单链DNA序列为：TTCTCAAGATTAGTCATATTACTAATAGAAGAGGGGAGCTCCACAAGGCTAGAGCATCCAGAAAGATTCAAATTCTCAAGATTAGTCATGTTACCAATAGAAGAGGGGAGTTCCATAAGGCTTGAGCACAGCTTGAGATTCAATTTCTTGAGATTAGTCAAATTCCCAATAGAAGAAGGAAGCTCCATAAGACTTGAACATC。
2.一种用于权利要求1所述的鉴定大白菜是否为抗根肿病大白菜的分子标记的特异性引物，其5’端到3’端的单链DNA序列为：
上游引物F：TTCTCAAGATTAGTCATATTACTAA
下游引物R:GGATGTTCAAGTCTTATGGAGCTTC。
3.利用权利要求1所述的InDel分子标记KB1鉴定大白菜根肿病的方法，其特征为提取待检测大白菜样品的基因组DNA作为模板，利用权利要求2中所述的分子标记特异性引物进行聚合酶链式反应扩增，再通过电泳对扩增产物进行检测。
4.权利要求3所述鉴定大白菜是否为抗根肿病大白菜的方法，包括鉴定大白菜基因组DNA中是否含有权利要求1中所示的202bp的DNA片段，如果待检测大白菜样品的基因组中含有权利要求1中所示的202bp的DNA片段，待检测大白菜含有抗根肿病基因Crr1a，该样品为抗根肿病大白菜或候选的抗根肿病大白菜；如果待检测大白菜样品的基因组中不含有权利要求1中所示的202bp的DNA片段，待检测大白菜不含有抗根肿病基因Crr1a，为非抗根肿病大白菜或非候选的抗根肿病大白菜。
5.权利要求1所述用于鉴定大白菜抗根肿病的InDel分子标记KB1在下列领域中的应用：
A、在大白菜育种中的应用；
B、在选育抗根肿病大白菜品系或品种中的应用；
C、在鉴定或辅助鉴定大白菜为抗根肿病白菜品种或品系中的应用；
D、在预测大白菜为抗根肿病材料中的应用。
6.权利要求2所述用于鉴定大白菜抗根肿病的分子标记特异性引物在下列领域中的应用：
A、在大白菜育种中的应用；
B、在选育抗根肿病大白菜品系或品种中的应用；
C、在鉴定或辅助鉴定大白菜为抗根肿病白菜品种或品系中的应用；
D、在预测大白菜为抗根肿病材料中的应用。
7.一种含有权利要求4所述的鉴定大白菜是否为抗根肿病大白菜的分子标记的特异性引物的试剂盒。
8.权利要求7所述的试剂盒在鉴定大白菜是否为抗根肿病大白菜中的应用。
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