CN108977564A - 检测辣椒中多个抗病位点基因型的方法及其专用引物组 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种检测辣椒中多个抗病位点基因型的方法及其专用引物组。本发明提供的引物组合由引物组乙和引物对组成；引物组乙由14条引物组成，依次如序列1至序列14所示；引物对由2条引物组成，一条如序列15所示，另一条如序列16所示。本发明还保护引物组合的应用，为检测辣椒多个抗病位点的基因型或检测辣椒对多种病害的抗性。多种病害为辣椒烟草花叶病、辣椒疮痂病、辣椒马铃薯Y病毒病和辣椒疫病。采用本发明提供的引物组和方法，可以实现采用一个反应体系同时获得辣椒中辣椒烟草花叶病、辣椒疮痂病、辣椒马铃薯Y病毒病和辣椒疫病多个位点基因型的的结果，对于抗病材料选择和育种具有重大应用推广价值。

Description

检测辣椒中多个抗病位点基因型的方法及其专用引物组
技术领域
本发明涉及一种检测辣椒中多个抗病位点基因型的方法及其专用引物组，具体涉及一种检测辣椒中烟草花叶病毒病、疮痂病、马铃薯Y病毒病和疫病抗病位点基因型的方法及其专用引物组。
背景技术
烟草花叶病毒(Tobamovirus，TMV)是极易在辣椒生产中造成毁灭性的病毒病。Boukema发现位于基因组同一座位上的4个复等位基因(L1、L2、L3和L4)对不同类型的病毒具有抗性：L1仅对P0致病型病毒(例如Tomato mosaic virus,ToMV)有抗性；L2抗P0和P1致病型病毒(例如Paprika mild mottle virus,PaMMV)，但其抗性被P1,2致病型病毒(例如Peppermild mottle virus,PMMoV)所克服；L3对P0、P1和P1,2致病型病毒具有抗性，但被P1,2,3致病型病毒PMMoV所克服；L4对P0、P1、P1,2和P1,2,3都具有抗性。
辣椒疮痂病病原菌即黄单胞杆菌。由黄单胞杆菌(Xanthomonas)引起的辣椒疮痂病是严重影响辣椒生产的一种细菌性病害。我国大部分地区存在疮痂病病原菌，并且在部分地区辣椒疮痂病危害十分严重，经过对我国不同地区的辣椒疮痂病病原小种鉴别，发现P0小种为我国优势小种。目前在辣椒上已定位并克隆了3个抗病基因(Bs1基因、Bs2基因和Bs3基因)，都编码NBS-LRR蛋白的过敏反应抗性基因。3个抗病基因具有小种特异性，其中Bs3基因对0号、1号、4号、7号和9号小种具有显性抗性。与疮痂病感病等位基因序列比对，Bs3抗性基因在启动子区域存在13个碱基的缺失。
辣椒疫病病原菌即疫霉菌。辣椒疫病是由疫霉菌Phytophthora capsici引起的一种真菌性土传病害。在病原菌适宜生长的环境下，疫霉菌可以对热带及亚热带地区辣椒造成高达100％的产量损失。辣椒材料CM334和PI 201234被证实对不同地区分离的许多疫霉菌表现出稳定的抗性。Rehrig等(2014)以抗疫病材料CM334为抗源，构建了三个不同的遗传定位群体，结果在5号染色体定位到两个SNP标记CA_011264和CA_004482与疫病抗性有很强的相关性(R2＝42-49.4％)，并且这两个标记的基因型在CM334和包括PI 201234在内的其他抗疫病材料中是保守的，推测SNP标记CA_011264所在的高丝氨酸激酶基因(CaDMR1基因)为疫病主效QTL的候选基因。Liu等(2014)利用一个低毒性的疫霉菌为接种病原物，发现5号染色体一个编码NBS-LRR基因上的标记Phyto5NBS1与抗性表型有90％的一致性。
在我国，马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)对辣椒的危害仅次于烟草花叶病毒(TMV)和黄瓜花叶病毒(CMV)。辣椒材料PI 159234对马铃薯Y病毒的抗性由单隐性基因pvr1控制，该基因已被克隆，其编码的eIF4E真核生物翻译起始因子能够与PVY的病毒编码的VPg蛋白相互作用，抑制病毒翻译起始、复制和移动。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测辣椒中多个抗病位点基因型的方法及其专用引物组。
本发明提供了引物组甲，由如下14条引物组成：CaQJ-1F、CaQJ-1R、CaQJ-2F、CaQJ-2R、CaQJ-4F、CaQJ-4R、CaQJ-5F、CaQJ-5R、CaQJ-10F、CaQJ-10R、CaQJ-6F、CaQJ-6R、CaQJ-7F和CaQJ-7R；
CaQJ-1F为如下(a1)或(a2)：
(a1)序列表的序列1第22至46核苷酸所示的DNA分子；
(a2)序列表的序列1所示的DNA分子；
CaQJ-1R为如下(b1)或(b2)：
(b1)序列表的序列2第22至46核苷酸所示的DNA分子；
(b2)序列表的序列2所示的DNA分子；
CaQJ-2F为如下(c1)或(c2)：
(c1)序列表的序列3第22至46核苷酸所示的DNA分子；
(c2)序列表的序列3所示的DNA分子；
CaQJ-2R为如下(d1)或(d2)：
(d1)序列表的序列4第22至46核苷酸所示的DNA分子；
(d2)序列表的序列4所示的DNA分子；
CaQJ-4F为如下(e1)或(e2)：
(e1)序列表的序列5第22至46核苷酸所示的DNA分子；
(e2)序列表的序列5所示的DNA分子；
CaQJ-4R为如下(f1)或(f2)：
(f1)序列表的序列6第22至46核苷酸所示的DNA分子；
(f2)序列表的序列6所示的DNA分子；
CaQJ-5F为如下(g1)或(g2)：
(g1)序列表的序列7第22至46核苷酸所示的DNA分子；
(g2)序列表的序列7所示的DNA分子；
CaQJ-5R为如下(h1)或(h2)：
(h1)序列表的序列8第22至46核苷酸所示的DNA分子；
(h2)序列表的序列8所示的DNA分子；
CaQJ-10F为如下(i1)或(i2)：
(i1)序列表的序列9第22至46核苷酸所示的DNA分子；
(i2)序列表的序列9所示的DNA分子；
CaQJ-10R为如下(j1)或(j2)：
(j1)序列表的序列10第22至46核苷酸所示的DNA分子；
(j2)序列表的序列10所示的DNA分子；
CaQJ-6F为如下(k1)或(k2)：
(k1)序列表的序列11第22至46核苷酸所示的DNA分子；
(k2)序列表的序列11所示的DNA分子；
CaQJ-6R为如下(l1)或(l2)：
(l1)序列表的序列12第22至46核苷酸所示的DNA分子；
(l2)序列表的序列12所示的DNA分子；
CaQJ-7F为如下(m1)或(m2)：
(m1)序列表的序列13第22至46核苷酸所示的DNA分子；
(m2)序列表的序列13所示的DNA分子；
CaQJ-7R为如下(n1)或(n2)：
(n1)序列表的序列14第22至46核苷酸所示的DNA分子；
(n2)序列表的序列14所示的DNA分子。
本发明还保护引物组合，由引物组乙和引物对组成；引物组乙由14条引物组成，14条引物依次如序列表的序列1至序列14所示；引物对由2条引物组成，一条如序列表的序列15所示，另一条如序列表的序列16所示。
本发明还保护所述引物组甲或所述引物组合的应用，为检测辣椒多个抗病位点的基因型或者检测辣椒对多种病害的抗性。
所述多个抗病位点的基因型为如下(Ⅰ)、(Ⅱ)、(Ⅲ)、(Ⅳ)、(Ⅴ)和(Ⅵ)：
(Ⅰ)抗烟草花叶病毒L4基因型；
(Ⅱ)抗烟草花叶病毒L3基因型；
(Ⅲ)抗辣椒疮痂病病原菌Bs3基因型；
(Ⅳ)抗辣椒疫病病原菌CaDMR1基因型；
(Ⅴ)抗辣椒疫病病原菌Phyto5NBS1位点基因型；
(Ⅵ)抗马铃薯Y病毒pvr1基因型。
所述多种病害为辣椒烟草花叶病、辣椒疮痂病、辣椒马铃薯Y病毒病和辣椒疫病。
本发明还保护所述引物组甲或所述引物组合在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的功能为检测辣椒多个抗病位点的基因型；
所述多个抗病位点的基因型为如下(Ⅰ)、(Ⅱ)、(Ⅲ)、(Ⅳ)、(Ⅴ)和(Ⅵ)：
(Ⅰ)抗烟草花叶病毒L4基因型；
(Ⅱ)抗烟草花叶病毒L3基因型；
(Ⅲ)抗辣椒疮痂病病原菌Bs3基因型；
(Ⅳ)抗辣椒疫病病原菌CaDMR1基因型；
(Ⅴ)抗辣椒疫病病原菌Phyto5NBS1位点基因型；
(Ⅵ)抗马铃薯Y病毒pvr1基因型。
本发明还保护所述引物组甲或所述引物组合在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的功能为检测辣椒对多种病害的抗性；所述多种病害为辣椒烟草花叶病、辣椒疮痂病、辣椒马铃薯Y病毒病和辣椒疫病。
本发明还保护一种试剂盒，包括所述引物组甲或所述引物组合；所述试剂盒的功能为检测辣椒多个抗病位点的基因型；
所述多个抗病位点的基因型为如下(Ⅰ)、(Ⅱ)、(Ⅲ)、(Ⅳ)、(Ⅴ)和(Ⅵ)：
(Ⅰ)抗烟草花叶病毒L4基因型；
(Ⅱ)抗烟草花叶病毒L3基因型；
(Ⅲ)抗辣椒疮痂病病原菌Bs3基因型；
(Ⅳ)抗辣椒疫病病原菌CaDMR1基因型；
(Ⅴ)抗辣椒疫病病原菌Phyto5NBS1位点基因型；
(Ⅵ)抗马铃薯Y病毒pvr1基因型。
本发明还保护一种试剂盒，包括所述引物组甲或所述引物组合；所述试剂盒的功能为检测辣椒对多种病害的抗性；所述多种病害为辣椒烟草花叶病、辣椒疮痂病、辣椒马铃薯Y病毒病和辣椒疫病。
本发明还保护一种检测辣椒多个抗病位点的基因型的方法，包括如下步骤：
(1)提取待测辣椒的基因组DNA；
(2)以步骤(1)得到的基因组DNA为模板，采用所述引物组乙进行第一轮PCR扩增；
(3)回收目标片段；
(4)以步骤(3)得到的目标片段为模板，采用所述引物对进行第二轮PCR扩增；
(5)回收目标片段，得到文库溶液；
(6)将步骤(1)得到的文库溶液进行测序，得到辣椒多个抗病位点的基因型；
所述多个抗病位点的基因型为如下(Ⅰ)、(Ⅱ)、(Ⅲ)、(Ⅳ)、(Ⅴ)和(Ⅵ)：
(Ⅰ)抗烟草花叶病毒L4基因型；
(Ⅱ)抗烟草花叶病毒L3基因型；
(Ⅲ)抗辣椒疮痂病病原菌Bs3基因型；
(Ⅳ)抗辣椒疫病病原菌CaDMR1基因型；
(Ⅴ)抗辣椒疫病病原菌Phyto5NBS1位点基因型；
(Ⅵ)抗马铃薯Y病毒pvr1基因型。
抗烟草花叶病毒L4基因型的判断标准如下：
如果待测辣椒对应于辣椒基因组0号染色体第473646291位、第473646303位、第473646306位、第473646308位、第473644098位和第473644117位的基因型依次为CC、CC、CC、TT、GG和GG，待测辣椒为抗烟草花叶病毒L4纯合基因型；
如果待测辣椒对应于辣椒基因组0号染色体第473646291位、第473646303位、第473646306位、第473646308位、第473644098位和第473644117位的基因型依次为CN1、CN2、CN3、TN4、GN5和GN6，待测辣椒为抗烟草花叶病毒L4杂合基因型；N1为C以外的其它核苷酸，N2为C以外的其它核苷酸，N3为C以外的其它核苷酸，N4为T以外的其它核苷酸，N5为G以外的其它核苷酸，N6为G以外的其它核苷酸。
抗烟草花叶病毒L3基因型的判断标准如下：
如果待测辣椒对应于辣椒基因组0号染色体第473646291位、第473646303位、第473646306位、第473646308位、第473644098位和第473644117位的基因型依次为GG、CC、TT、TT、GG和GG，待测辣椒为抗烟草花叶病毒L3纯合基因型；
如果待测辣椒对应于辣椒基因组0号染色体第473646291位、第473646303位、第473646306位、第473646308位、第473644098位和第473644117位的基因型依次为GN7、CN8、TN9、TN10、GN11和GN12，待测辣椒为抗烟草花叶病毒L3杂合基因型；N7为G以外的其它核苷酸，N8为C以外的其它核苷酸，N9为T以外的其它核苷酸，N10为T以外的其它核苷酸，N11为G以外的其它核苷酸，N12为G以外的其它核苷酸。
抗辣椒疮痂病病原菌Bs3基因型的判断标准如下：
如果待测辣椒对应于辣椒基因组2号染色体第119576904位至第119576916位(CTCTATTCCACTA)只有一种且未缺失(即具有CTCTATTCCACTA)，待测辣椒为非抗辣椒疮痂病病原菌Bs3纯合基因型；
如果待测辣椒对应于辣椒基因组2号染色体第119576904位至第119576916位(CTCTATTCCACTA)只有一种且缺失(即缺失CTCTATTCCACTA)，待测辣椒为抗辣椒疮痂病病原菌Bs3纯合基因型；
如果待测辣椒对应于辣椒基因组2号染色体第119576904位至第119576916位(CTCTATTCCACTA)有两种，一种未缺失(即具有CTCTATTCCACTA)，另一种缺失(即缺失CTCTATTCCACTA)，待测辣椒为抗辣椒疮痂病病原菌Bs3杂合基因型。
抗辣椒疮痂病病原菌Bs3基因型的判断标准如下：
如果引物对CaQJ-4的扩增产物只有一种且未缺失CTCTATTCCACTA，待测辣椒为非抗辣椒疮痂病病原菌Bs3纯合基因型；
如果引物对CaQJ-4的扩增产物只有一种且缺失了CTCTATTCCACTA，待测辣椒为抗辣椒疮痂病病原菌Bs3纯合基因型；
如果引物对CaQJ-4的扩增产物有两种，一种未缺失CTCTATTCCACTA，另一种缺失了CTCTATTCCACTA，待测辣椒为抗辣椒疮痂病病原菌Bs3杂合基因型。
抗辣椒疫病病原菌CaDMR1基因型的判断标准如下：
如果待测辣椒对应于辣椒基因组第5号染色体的第22548924位的基因型为AA，待测辣椒为抗辣椒疫病病原菌CaDMR1纯合基因型；
如果待测辣椒对应于辣椒基因组第5号染色体的第22548924位的基因型为GG，待测辣椒为非抗辣椒疫病病原菌CaDMR1纯合基因型；
如果待测辣椒对应于辣椒基因组第5号染色体的第22548924位的基因型为AG，待测辣椒为抗辣椒疫病病原菌CaDMR1杂合基因型。
抗辣椒疫病病原菌Phyto5NBS1位点基因型的判断标准如下：
如果待测辣椒对应于辣椒基因组第5号染色体的第25510219位为TT，待测辣椒为抗辣椒疫病病原菌Phyto5NBS1位点纯合基因型；
如果待测辣椒对应于辣椒基因组第5号染色体的第25510219位为CC，待测辣椒为非抗辣椒疫病病原菌Phyto5NBS1位点纯合基因型；
如果待测辣椒对应于辣椒基因组第5号染色体的第25510219位为TC，待测辣椒为抗辣椒疫病病原菌Phyto5NBS1位点杂合基因型。
抗马铃薯Y病毒pvr1基因型的判断标准如下：
如果待测辣椒对应于辣椒基因组4号染色体第214500576位、第214496881位和第214496887位的基因型依次为CC、CC和TT，待测辣椒为抗马铃薯Y病毒pvr1纯合基因型；
如果待测辣椒对应于辣椒基因组4号染色体第214500576位、第214496881位和第214496887位的基因型依次为TT、TT和CC，待测辣椒为非抗马铃薯Y病毒pvr1纯合基因型；
如果待测辣椒对应于辣椒基因组4号染色体第214500576位、第214496881位和第214496887位的基因型依次CN13、CN14和TN15，待测辣椒为非抗马铃薯Y病毒pvr1基因杂合基因型；N13为C以外的其它核苷酸，N14为C以外的其它核苷酸，N15为T以外的其它核苷酸。
本发明还保护一种检测辣椒对多种病害的抗性的方法，包括如下步骤：
(1)提取待测辣椒的基因组DNA；
(2)以步骤(1)得到的基因组DNA为模板，采用所述引物组乙进行第一轮PCR扩增；
(3)回收目标片段；
(4)以步骤(3)得到的目标片段为模板，采用所述引物对进行第二轮PCR扩增；
(5)回收目标片段，得到文库溶液；
(6)文库溶液进行测序，得到辣椒多个抗病位点的基因型；
(7)根据辣椒多个抗病位点的基因型判断辣椒对多种病害的抗性；所述多种病害为辣椒烟草花叶病、辣椒疮痂病、辣椒马铃薯Y病毒病和辣椒疫病。
根据辣椒多个抗病位点的基因型判断辣椒对多种病害的抗性的标准如下：
如果待测辣椒为抗烟草花叶病毒L4纯合基因型，该辣椒为辣椒烟草花叶病抗病材料(具体可为对P0小种、P1小种、P1,2小种和P1,2,3小种均具有抗性的辣椒烟草花叶病抗病材料)；
如果待测辣椒为抗烟草花叶病毒L4杂合基因型，该辣椒为辣椒烟草花叶病毒病抗病材料(具体可为对P0小种、P1小种、P1,2小种和P1,2,3小种均具有抗性的辣椒烟草花叶病抗病材料)；
如果待测辣椒为抗烟草花叶病毒L3纯合基因型，该辣椒为辣椒烟草花叶病毒病抗病材料(具体可为对P0小种、P1小种和P1,2小种均具有抗性的辣椒烟草花叶病抗病材料)；
如果待测辣椒为抗烟草花叶病毒L3杂合基因型，该辣椒为辣椒烟草花叶病毒病抗病材料(具体可为对P0小种、P1小种和P1,2小种均具有抗性的辣椒烟草花叶病抗病材料)；
如果待测辣椒为抗辣椒疮痂病病原菌Bs3纯合基因型，该辣椒为辣椒疮痂病抗病材料；
如果待测辣椒为抗辣椒疮痂病病原菌Bs3杂合基因型，该辣椒为辣椒疮痂病抗病材料；
如果待测辣椒为抗辣椒疫病病原菌CaDMR1纯合基因型，该辣椒为辣椒疫病抗病材料；
如果待测辣椒为抗辣椒疫病病原菌CaDMR1杂合基因型，该辣椒为辣椒疫病抗病材料；
如果待测辣椒为抗辣椒疫病病原菌Phyto5NBS1位点纯合基因型，该辣椒为辣椒疫病抗病材料；
如果待测辣椒为抗辣椒疫病病原菌Phyto5NBS1位点杂合基因型，该辣椒为辣椒疫病抗病材料；
如果待测辣椒为抗马铃薯Y病毒pvr1纯合基因型，该辣椒为辣椒马铃薯Y病毒病抗病材料。
以上任一所述辣椒基因组为辣椒Zunla-1基因组。
本方法通过多重PCR结合测序法，可以一次同时获得600多个样品的多个抗病位点的基因型。采用本发明提供的引物组和方法，可以实现采用一个反应体系同时获得辣椒中辣椒烟草花叶病、辣椒疮痂病、辣椒马铃薯Y病毒病和辣椒疫病多个位点基因型的的结果，对于抗病材料选择和育种具有重大应用推广价值。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。GoTaq Mix：Promega,Madison，WI USA。
实施例1、引物的设计
一、引物对CaQJ-1和引物对CaQJ-2
引物对CaQJ-1和引物对CaQJ-2用于鉴别辣椒抗烟草花叶病毒L3基因型和L4基因型。引物对CaQJ-1的靶序列中具有4个目标SNP，该4个SNP分别位于辣椒基因组0号染色体第473646291位、第473646303位、第473646306位和第473646308位。引物对CaQJ-2的靶序列中具有2个目标SNP，该2个目标SNP分别位于辣椒基因组0号染色体第473644098位和第473644117位。
如果待测辣椒对应于辣椒基因组0号染色体第473646291位、第473646303位、第473646306位、第473646308位、第473644098位和第473644117位的基因型依次为CC、CC、CC、TT、GG和GG，待测辣椒为抗烟草花叶病毒L4纯合基因型。
如果待测辣椒对应于辣椒基因组0号染色体第473646291位、第473646303位、第473646306位、第473646308位、第473644098位和第473644117位的基因型依次为CN1、CN2、CN3、TN4、GN5和GN6，待测辣椒为抗烟草花叶病毒L4杂合基因型；N1为C以外的其它核苷酸，N2为C以外的其它核苷酸，N3为C以外的其它核苷酸，N4为T以外的其它核苷酸，N5为G以外的其它核苷酸，N6为G以外的其它核苷酸。
如果待测辣椒对应于辣椒基因组0号染色体第473646291位、第473646303位、第473646306位、第473646308位、第473644098位和第473644117位的基因型依次为GG、CC、TT、TT、GG和GG，待测辣椒为抗烟草花叶病毒L3纯合基因型。
如果待测辣椒对应于辣椒基因组0号染色体第473646291位、第473646303位、第473646306位、第473646308位、第473644098位和第473644117位的基因型依次为GN7、CN8、TN9、TN10、GN11和GN12，待测辣椒为抗烟草花叶病毒L3杂合基因型；N7为G以外的其它核苷酸，N8为C以外的其它核苷酸，N9为T以外的其它核苷酸，N10为T以外的其它核苷酸，N11为G以外的其它核苷酸，N12为G以外的其它核苷酸。
抗烟草花叶病毒L4纯合基因型、抗烟草花叶病毒L4杂合基因型、抗烟草花叶病毒L3纯合基因型和抗烟草花叶病毒L3杂合基因型的辣椒均为辣椒烟草花叶病抗病辣椒。
二、引物对CaQJ-4
引物对CaQJ-4用于鉴定辣椒抗辣椒疮痂病病原菌Bs3基因。引物对CaQJ-4的靶序列中具有一个13bp缺失，该缺失位于辣椒基因组2号染色体第119576904位至第119576916位。
如果引物对CaQJ-4的扩增产物只有一种且未缺失CTCTATTCCACTA，待测辣椒为非抗辣椒疮痂病病原菌Bs3纯合基因型。如果引物对CaQJ-4的扩增产物只有一种且缺失了CTCTATTCCACTA，待测辣椒为抗辣椒疮痂病病原菌Bs3纯合基因型。如果引物对CaQJ-4的扩增产物有两种，一种未缺失CTCTATTCCACTA，另一种缺失了CTCTATTCCACTA，待测辣椒为抗辣椒疮痂病病原菌Bs3杂合基因型。
抗辣椒疮痂病病原菌Bs3纯合基因型和抗辣椒疮痂病病原菌Bs3杂合基因型的辣椒均为辣椒疮痂病抗病辣椒。
三、引物对CaQJ-5和引物对CaQJ-10
引物对CaQJ-5用于鉴定辣椒抗辣椒疫病病原菌CaDMR1基因。引物对CaQJ-5的靶序列中具有的一个SNP，该SNP位于辣椒基因组5号染色体第22548924位。
如果待测辣椒对应于辣椒基因组第5号染色体的第22548924位的基因型为AA，待测辣椒为抗辣椒疫病病原菌CaDMR1纯合基因型。如果待测辣椒对应于辣椒基因组第5号染色体的第22548924位的基因型为GG，待测辣椒为非抗辣椒疫病病原菌CaDMR1纯合基因型。如果待测辣椒对应于辣椒基因组第5号染色体的第22548924位的基因型为AG，待测辣椒为抗辣椒疫病病原菌CaDMR1杂合基因型。
引物对CaQJ-10用于鉴定辣椒抗辣椒疫病病原菌SNP标记Phyto5NBS1。引物对CaQJ-10的靶序列中具有的一个SNP，该SNP位于辣椒基因组5号染色体第25510219位。
如果待测辣椒对应于辣椒基因组第5号染色体的第25510219位的基因型为TT，待测辣椒为抗辣椒疫病病原菌Phyto5NBS1位点纯合基因型。如果待测辣椒对应于辣椒基因组第5号染色体的第25510219位的基因型为CC，待测辣椒为非抗辣椒疫病病原菌Phyto5NBS1位点纯合基因型。如果待测辣椒对应于辣椒基因组第5号染色体的第25510219位的基因型为TC，待测辣椒为抗辣椒疫病病原菌Phyto5NBS1位点杂合基因型。
抗辣椒疫病病原菌CaDMR1纯合基因型、抗辣椒疫病病原菌CaDMR1杂合基因型、抗辣椒疫病病原菌Phyto5NBS1位点纯合基因型和抗辣椒疫病病原菌Phyto5NBS1位点杂合基因型的辣椒均为辣椒疫病抗病辣椒。
四、引物对CaQJ-6和引物对CaQJ-7
引物对CaQJ-6和引物对CaQJ-7用于鉴别辣椒抗马铃薯Y病毒pvr1基因型。引物对CaQJ-6的靶序列中具有1个目标SNP，该SNP位于辣椒基因组4号染色体第214500576位。引物对CaQJ-7的靶序列中具有2个目标SNP，该2个SNP分别位于辣椒基因组4号染色体第214496881位和第214496887位。
如果待测辣椒对应于辣椒基因组4号染色体第214500576位、第214496881位和第214496887位的基因型依次为CC、CC和TT，待测辣椒为抗马铃薯Y病毒pvr1纯合基因型。
如果待测辣椒对应于辣椒基因组4号染色体第214500576位、第214496881位和第214496887位的基因型依次为TT、TT和CC，待测辣椒为非抗马铃薯Y病毒pvr1纯合基因型。
如果待测辣椒对应于辣椒基因组4号染色体第214500576位、第214496881位和第214496887位的基因型依次CN13、CN14和TN15，待测辣椒为非抗马铃薯Y病毒pvr1基因杂合基因型；N13为C以外的其它核苷酸，N14为C以外的其它核苷酸，N15为T以外的其它核苷酸。
抗马铃薯Y病毒pvr1纯合基因型的辣椒为辣椒马铃薯Y病毒病抗病辣椒。
引物对CaQJ-1由正向引物CaQJ-1F和反向引物CaQJ-1R组成。
CaQJ-1F(序列表的序列1)：TCGCTACACGACGCTCATCCGAGAGAGCGGTTTCAATTTCTCAAAG；
CaQJ-1R(序列表的序列2)：GGAGTTCCTTGGCACGCGAGAGTCTTCTGAAAGATACGGTGGGAAA。
引物对CaQJ-2由正向引物CaQJ-2F和反向引物CaQJ-2R组成。
CaQJ-2F(序列表的序列3)：TCGCTACACGACGCTCATCCGAGATAGTATAGAGAGGGAAGAGGGC；
CaQJ-2R(序列表的序列4)：GGAGTTCCTTGGCACGCGAGAAAGTCTATTGATCTGGAATTGCCCT。
引物对CaQJ-4由正向引物CaQJ-4F和反向引物CaQJ-4R组成。
CaQJ-4F(序列表的序列5)：TCGCTACACGACGCTCATCCGTATGGGTTAAACCACAATTTGCACA；
CaQJ-4R(序列表的序列6)：GGAGTTCCTTGGCACGCGAGAGGTGACAAGAACAAGAGGAGAAAAG。
引物对CaQJ-5由正向引物CaQJ-5F和CaQJ-5R组成。
CaQJ-5F(序列表的序列7)：TCGCTACACGACGCTCATCCGCAAGCTGATCAACACTCAATTTCCT；
CaQJ-5R(序列表的序列8)：GGAGTTCCTTGGCACGCGAGACAATGGAAGGTTGACTAAAGATCCG。
引物对CaQJ-10由正向引物CaQJ-10F和CaQJ-10R组成。
CaQJ-10F(序列表的序列9)：TCGCTACACGACGCTCATCCGTATAGTGGTGACAACTGTCTGGTTT；
CaQJ-10R(序列表的序列10)：GGAGTTCCTTGGCACGCGAGACATAGAGTTCTCCCATTTCTTGCAC。
引物对CaQJ-6由正向引物CaQJ-6F和CaQJ-6R组成。
CaQJ-6F(序列表的序列11)：TCGCTACACGACGCTCATCCGTTACCCCCAAAAATCTTCAACAGTG；
CaQJ-6R(序列表的序列12)：GGAGTTCCTTGGCACGCGAGAGAGGCAGATGATGAAGTTGAAGAAG。
引物对CaQJ-7由正向引物CaQJ-7F和反向引物CaQJ-7R组成。
CaQJ-7F(序列表的序列13)：TCGCTACACGACGCTCATCCGAAAAACTCATTTTCCATGTCCCTCC；
CaQJ-7R(序列表的序列14)：GGAGTTCCTTGGCACGCGAGAAGTTATCGTACAACTTGGACTGTGA。
以上各个引物的方向均为5’→3’。
实施例2、引物组的应用
以“PI”为编号的辣椒材料来自美国种质资源库。辣椒材料PI159236为本领域技术人员公知的抗烟草花叶病毒L3纯合基因型的辣椒材料。辣椒材料PI152225为本领域技术人员公知的抗烟草花叶病毒L3纯合基因型的辣椒材料。辣椒材料PI260429为本领域技术人员公知的抗烟草花叶病毒L4纯合基因型的辣椒材料。辣椒材料PI640530为本领域技术人员公知的抗辣椒疮痂病病原菌Bs3纯合基因型的辣椒材料。辣椒材料PI159234为本领域技术人员公知的抗马铃薯Y病毒pvr1纯合基因型的辣椒材料。辣椒材料PI201234为本领域技术人员公知的抗辣椒疫病病原菌CaDMR1纯合基因型且抗辣椒疫病病原菌Phyto5NBS1位点纯合基因型的辣椒材料。分别将这些辣椒材料作为待测材料。
一、用每个样本制备文库溶液
1、提取待测材料的基因组DNA。
2、以基因组DNA为模板，采用引物混合物进行第一轮PCR扩增。
反应体系(30μl)：引物混合物溶液8μl，模板DNA(含量大于10ng)，GoTaq Mix酶15μl，余量为水。
引物混合物溶液中，具有CaQJ-1F、CaQJ-1R、CaQJ-2F、CaQJ-2R、CaQJ-4F、CaQJ-4R、CaQJ-5F、CaQJ-5R、CaQJ-10F、CaQJ-10R、CaQJ-6F、CaQJ-6R、CaQJ-7F和CaQJ-7R，各条引物的浓度均为10μM。
反应程序：95℃3min；95℃30s、60℃4min，16个循环；72℃4min。
3、采用磁珠(AMPure XP beads，Beckman)回收DNA片段(100-300bp)，得到吸附有目标片段的磁珠。
4、以步骤3得到的吸附有目标片段的磁珠为模板，进行第二轮PCR扩增。
反应体系(30μl)：10μM Primer F溶液1μl，10μM PrimerR溶液1μl，GoTaq Mix酶15μl，余量为水。
PrimerF(序列15)：TATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCGCTACACGACGCTCATCCG；
PrimerR(序列16)：GATGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNNNGTGACTGGAGTTCCTTGGCACGCGAGA。以上各个引物的方向均为5’→3’。
NNNNNNNN为样本标签，每个N代表一个核苷酸、为A、T、C、G任意，每个有样本具有唯一的样本标签，不同样本之间具有至少4个核苷酸的差异。
反应程序：95℃3min；95℃15s、58℃15s、72℃30s，7个循环；72℃4min。
5、采用磁珠(AMPure XP beads，Beckman)回收DNA片段(100-350bp)，得到含有目标片段的上清液，即为文库溶液(溶剂为pH8.0-8.5、10mM的Tris-HCl溶液)。
二、测序
将每个样本步骤一得到的文库溶液等体积混合，使用Hiseq-x-ten测序(测序深度300x)，将获得的测序数据与Zunla-1参考基因组进行比对，获得每个样本的基因型结果。
结果见表1、表2和表3。
表1
表2
表3
将各个样本各个位点的基因型依次进行单独的测序验证，各个位点的基因型均同表1至表3。
实施例3、引物组的应用
辣椒品种来自北京现代种业博览会通州展示基地。
分别将这些辣椒材料作为待测材料。
检测方法同实施例2。
结果见表4、表5、表6和表7。
表4
表5
表6
表7
将各个样本各个位点的基因型依次进行单独的测序验证，各个位点的基因型均同表4至表7。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京市农林科学院
<120> 检测辣椒中多个抗病位点基因型的方法及其专用引物组
<130> GNCYX181518
<160> 16
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 1
tcgctacacg acgctcatcc gagagagcgg tttcaatttc tcaaag 46
<210> 2
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 2
ggagttcctt ggcacgcgag agtcttctga aagatacggt gggaaa 46
<210> 3
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 3
tcgctacacg acgctcatcc gagatagtat agagagggaa gagggc 46
<210> 4
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 4
ggagttcctt ggcacgcgag aaagtctatt gatctggaat tgccct 46
<210> 5
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 5
tcgctacacg acgctcatcc gtatgggtta aaccacaatt tgcaca 46
<210> 6
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 6
ggagttcctt ggcacgcgag aggtgacaag aacaagagga gaaaag 46
<210> 7
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 7
tcgctacacg acgctcatcc gcaagctgat caacactcaa tttcct 46
<210> 8
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 8
ggagttcctt ggcacgcgag acaatggaag gttgactaaa gatccg 46
<210> 9
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 9
tcgctacacg acgctcatcc gtatagtggt gacaactgtc tggttt 46
<210> 10
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 10
ggagttcctt ggcacgcgag acatagagtt ctcccatttc ttgcac 46
<210> 11
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 11
tcgctacacg acgctcatcc gttaccccca aaaatcttca acagtg 46
<210> 12
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 12
ggagttcctt ggcacgcgag agaggcagat gatgaagttg aagaag 46
<210> 13
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 13
tcgctacacg acgctcatcc gaaaaactca ttttccatgt ccctcc 46
<210> 14
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 14
ggagttcctt ggcacgcgag aagttatcgt acaacttgga ctgtga 46
<210> 15
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 15
tatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttcgctac acgacgctca tccg 54
<210> 16
<211> 59
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(32)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 16
gatgcagaag acggcatacg agatnnnnnn nngtgactgg agttccttgg cacgcgaga 59

Claims (10)

1.引物组甲，由如下14条引物组成：CaQJ-1F、CaQJ-1R、CaQJ-2F、CaQJ-2R、CaQJ-4F、CaQJ-4R、CaQJ-5F、CaQJ-5R、CaQJ-10F、CaQJ-10R、CaQJ-6F、CaQJ-6R、CaQJ-7F和CaQJ-7R；
CaQJ-1F为如下(a1)或(a2)：
(a1)序列表的序列1第22至46核苷酸所示的DNA分子；
(a2)序列表的序列1所示的DNA分子；
CaQJ-1R为如下(b1)或(b2)：
(b1)序列表的序列2第22至46核苷酸所示的DNA分子；
(b2)序列表的序列2所示的DNA分子；
CaQJ-2F为如下(c1)或(c2)：
(c1)序列表的序列3第22至46核苷酸所示的DNA分子；
(c2)序列表的序列3所示的DNA分子；
CaQJ-2R为如下(d1)或(d2)：
(d1)序列表的序列4第22至46核苷酸所示的DNA分子；
(d2)序列表的序列4所示的DNA分子；
CaQJ-4F为如下(e1)或(e2)：
(e1)序列表的序列5第22至46核苷酸所示的DNA分子；
(e2)序列表的序列5所示的DNA分子；
CaQJ-4R为如下(f1)或(f2)：
(f1)序列表的序列6第22至46核苷酸所示的DNA分子；
(f2)序列表的序列6所示的DNA分子；
CaQJ-5F为如下(g1)或(g2)：
(g1)序列表的序列7第22至46核苷酸所示的DNA分子；
(g2)序列表的序列7所示的DNA分子；
CaQJ-5R为如下(h1)或(h2)：
(h1)序列表的序列8第22至46核苷酸所示的DNA分子；
(h2)序列表的序列8所示的DNA分子；
CaQJ-10F为如下(i1)或(i2)：
(i1)序列表的序列9第22至46核苷酸所示的DNA分子；
(i2)序列表的序列9所示的DNA分子；
CaQJ-10R为如下(j1)或(j2)：
(j1)序列表的序列10第22至46核苷酸所示的DNA分子；
(j2)序列表的序列10所示的DNA分子；
CaQJ-6F为如下(k1)或(k2)：
(k1)序列表的序列11第22至46核苷酸所示的DNA分子；
(k2)序列表的序列11所示的DNA分子；
CaQJ-6R为如下(l1)或(l2)：
(l1)序列表的序列12第22至46核苷酸所示的DNA分子；
(l2)序列表的序列12所示的DNA分子；
CaQJ-7F为如下(m1)或(m2)：
(m1)序列表的序列13第22至46核苷酸所示的DNA分子；
(m2)序列表的序列13所示的DNA分子；
CaQJ-7R为如下(n1)或(n2)：
(n1)序列表的序列14第22至46核苷酸所示的DNA分子；
(n2)序列表的序列14所示的DNA分子。
2.引物组合，由引物组乙和引物对组成；引物组乙由14条引物组成，14条引物依次如序列表的序列1至序列14所示；引物对由2条引物组成，一条如序列表的序列15所示，另一条如序列表的序列16所示。
3.权利要求1所述引物组甲或权利要求2所述引物组合的应用；为检测辣椒多个抗病位点的基因型或者检测辣椒对多种病害的抗性；
所述多个抗病位点的基因型为如下(Ⅰ)、(Ⅱ)、(Ⅲ)、(Ⅳ)、(Ⅴ)和(Ⅵ)：
(Ⅰ)抗烟草花叶病毒L4基因型；
(Ⅱ)抗烟草花叶病毒L3基因型；
(Ⅲ)抗辣椒疮痂病病原菌Bs3基因型；
(Ⅳ)抗辣椒疫病病原菌CaDMR1基因型；
(Ⅴ)抗辣椒疫病病原菌Phyto5NBS1位点基因型；
(Ⅵ)抗马铃薯Y病毒pvr1基因型；
所述多种病害为辣椒烟草花叶病、辣椒疮痂病、辣椒马铃薯Y病毒病和辣椒疫病。
4.权利要求1所述引物组甲或权利要求2所述引物组合在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的功能为检测辣椒多个抗病位点的基因型；
所述多个抗病位点的基因型为如下(Ⅰ)、(Ⅱ)、(Ⅲ)、(Ⅳ)、(Ⅴ)和(Ⅵ)：
(Ⅰ)抗烟草花叶病毒L4基因型；
(Ⅱ)抗烟草花叶病毒L3基因型；
(Ⅲ)抗辣椒疮痂病病原菌Bs3基因型；
(Ⅳ)抗辣椒疫病病原菌CaDMR1基因型；
(Ⅴ)抗辣椒疫病病原菌Phyto5NBS1位点基因型；
(Ⅵ)抗马铃薯Y病毒pvr1基因型。
5.权利要求1所述引物组甲或权利要求2所述引物组合在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的功能为检测辣椒对多种病害的抗性；所述多种病害为辣椒烟草花叶病、辣椒疮痂病、辣椒马铃薯Y病毒病和辣椒疫病。
6.一种试剂盒，包括权利要求1所述引物组甲或权利要求2所述引物组合；所述试剂盒的功能为检测辣椒多个抗病位点的基因型；
所述多个抗病位点的基因型为如下(Ⅰ)、(Ⅱ)、(Ⅲ)、(Ⅳ)、(Ⅴ)和(Ⅵ)：
(Ⅰ)抗烟草花叶病毒L4基因型；
(Ⅱ)抗烟草花叶病毒L3基因型；
(Ⅲ)抗辣椒疮痂病病原菌Bs3基因型；
(Ⅳ)抗辣椒疫病病原菌CaDMR1基因型；
(Ⅴ)抗辣椒疫病病原菌Phyto5NBS1位点基因型；
(Ⅵ)抗马铃薯Y病毒pvr1基因型。
7.一种试剂盒，包括权利要求1所述引物组甲或权利要求2所述引物组合；所述试剂盒的功能为检测辣椒对多种病害的抗性；所述多种病害为辣椒烟草花叶病、辣椒疮痂病、辣椒马铃薯Y病毒病和辣椒疫病。
8.一种检测辣椒多个抗病位点的基因型的方法，包括如下步骤：
(1)提取待测辣椒的基因组DNA；
(2)以步骤(1)得到的基因组DNA为模板，采用权利要求2中所述引物组乙进行第一轮PCR扩增；
(3)回收目标片段；
(4)以步骤(3)得到的目标片段为模板，采用权利要求2中所述引物对进行第二轮PCR扩增；
(5)回收目标片段，得到文库溶液；
(6)将步骤(1)得到的文库溶液进行测序，得到辣椒多个抗病位点的基因型；
所述多个抗病位点的基因型为如下(Ⅰ)、(Ⅱ)、(Ⅲ)、(Ⅳ)、(Ⅴ)和(Ⅵ)：
(Ⅰ)抗烟草花叶病毒L4基因型；
(Ⅱ)抗烟草花叶病毒L3基因型；
(Ⅲ)抗辣椒疮痂病病原菌Bs3基因型；
(Ⅳ)抗辣椒疫病病原菌CaDMR1基因型；
(Ⅴ)抗辣椒疫病病原菌Phyto5NBS1位点基因型；
(Ⅵ)抗马铃薯Y病毒pvr1基因型。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于：
抗烟草花叶病毒L4基因型的判断标准如下：
如果待测辣椒对应于辣椒基因组0号染色体第473646291位、第473646303位、第473646306位、第473646308位、第473644098位和第473644117位的基因型依次为CC、CC、CC、TT、GG和GG，待测辣椒为抗烟草花叶病毒L4纯合基因型；
如果待测辣椒对应于辣椒基因组0号染色体第473646291位、第473646303位、第473646306位、第473646308位、第473644098位和第473644117位的基因型依次为CN1、CN2、CN3、TN4、GN5和GN6，待测辣椒为抗烟草花叶病毒L4杂合基因型；N1为C以外的其它核苷酸，N2为C以外的其它核苷酸，N3为C以外的其它核苷酸，N4为T以外的其它核苷酸，N5为G以外的其它核苷酸，N6为G以外的其它核苷酸；
抗烟草花叶病毒L3基因型的判断标准如下：
如果待测辣椒对应于辣椒基因组0号染色体第473646291位、第473646303位、第473646306位、第473646308位、第473644098位和第473644117位的基因型依次为GG、CC、TT、TT、GG和GG，待测辣椒为抗烟草花叶病毒L3纯合基因型；
如果待测辣椒对应于辣椒基因组0号染色体第473646291位、第473646303位、第473646306位、第473646308位、第473644098位和第473644117位的基因型依次为GN7、CN8、TN9、TN10、GN11和GN12，待测辣椒为抗烟草花叶病毒L3杂合基因型；N7为G以外的其它核苷酸，N8为C以外的其它核苷酸，N9为T以外的其它核苷酸，N10为T以外的其它核苷酸，N11为G以外的其它核苷酸，N12为G以外的其它核苷酸；
抗辣椒疮痂病病原菌Bs3基因型的判断标准如下：
如果待测辣椒对应于辣椒基因组2号染色体第119576904位至第119576916位只有一种且缺失CTCTATTCCACTA，待测辣椒为抗辣椒疮痂病病原菌Bs3纯合基因型；
如果待测辣椒对应于辣椒基因组2号染色体第119576904位至第119576916位有两种，一种未缺失CTCTATTCCACTA，另一种缺失CTCTATTCCACTA，待测辣椒为抗辣椒疮痂病病原菌Bs3杂合基因型；
抗辣椒疫病病原菌CaDMR1基因型的判断标准如下：
如果待测辣椒对应于辣椒基因组第5号染色体的第22548924位的基因型为AA，待测辣椒为抗辣椒疫病病原菌CaDMR1纯合基因型；
如果待测辣椒对应于辣椒基因组第5号染色体的第22548924位的基因型为AG，待测辣椒为抗辣椒疫病病原菌CaDMR1杂合基因型；
抗辣椒疫病病原菌Phyto5NBS1位点基因型的判断标准如下：
如果待测辣椒对应于辣椒基因组第5号染色体的第25510219位为TT，待测辣椒为抗辣椒疫病病原菌Phyto5NBS1位点纯合基因型；
如果待测辣椒对应于辣椒基因组第5号染色体的第25510219位为TC，待测辣椒为抗辣椒疫病病原菌Phyto5NBS1位点杂合基因型；
抗马铃薯Y病毒pvr1基因型的判断标准如下：
如果待测辣椒对应于辣椒基因组4号染色体第214500576位、第214496881位和第214496887位的基因型依次为CC、CC和TT，待测辣椒为抗马铃薯Y病毒pvr1纯合基因型。
10.一种检测辣椒对多种病害的抗性的方法，包括如下步骤：
(1)提取待测辣椒的基因组DNA；
(2)以步骤(1)得到的基因组DNA为模板，采用权利要求2中所述引物组乙进行第一轮PCR扩增；
(3)回收目标片段；
(4)以步骤(3)得到的目标片段为模板，采用权利要求2中所述引物对进行第二轮PCR扩增；
(5)回收目标片段，得到文库溶液；
(6)文库溶液进行测序，得到辣椒多个抗病位点的基因型；
(7)根据辣椒多个抗病位点的基因型判断辣椒对多种病害的抗性；所述多种病害为辣椒烟草花叶病、辣椒疮痂病、辣椒马铃薯Y病毒病和辣椒疫病。
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