CN116356072A - 一种用于筛选优质西藏棕色蘑菇的dna条形码、引物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于筛选优质西藏棕色蘑菇的DNA条形码、引物及其应用。所述用于筛选优质西藏棕色蘑菇的DNA条形码，包含核苷酸序列如SEQ ID NO：1～17所示的17个DNA片段中的一个或多个；用于筛选优质西藏棕色蘑菇的DNA条形码扩增引物，包含上下游核苷酸序列分别如SEQ ID NO：18～51所示的17对引物中的一对或多对。本发明与传统育种方法及其他现有DNA条形码技术相比较，它具有省时、省力、省钱、准确、高效的优点，在优质西藏棕色蘑菇的遗传育种上发挥积极作用，同时也为种质资源的鉴定及保护提供了一种有效方法。
Description
本申请是申请日为2020年02月21日、申请号202010108852.8，发明名称为“一种用于筛选优质西藏棕色蘑菇的DNA条形码、引物及其应用”的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及食用菌种质资源筛选技术领域，更具体地，涉及一种用于筛选优质西藏棕色蘑菇的DNA条形码、引物及其应用。
背景技术
西藏棕色蘑菇，属于双孢菇的一种，色泽呈浅褐色介于褐色双孢菇(褐菇)和白色双孢菇之间。白色双孢菇容易褐变影响品质，褐色双孢菇不易褐变且蛋白含量高。引起褐变的主要因素是双孢菇中的多酚氧化酶活性，活性越高越容易褐变，西藏棕色蘑菇是一种不易褐变且兼具白色双孢菇和褐色双孢菇的优良品质。评价双孢菇等食用菌优质品种的主要指标包括：总蛋白、总可溶性蛋白、总水解氨基酸、总多糖和总多酚含量高，抗氧化活性强，多酚氧化酶活性低。按传统方法，通过采集野生样本驯化后大田栽培，挑选个体饱满无病害的子实体分离菌丝保存菌种，同时逐个子实体测定上述指标，挑选出优质个体对应菌种进行栽培才能获得优质品种，这样一来筛选周期长效率低。野生样本量少无法完成上述指标测定，必须经过菌丝分离保存菌种进行大田栽培获得足够数量个体才能测定上述指标。此外，对于不具优质指标的野生样本，后期的驯化及大田栽培等工作就会造成浪费。
为了实现西藏棕色蘑菇的开发利用，筛选优质西藏棕色蘑菇品种显得尤为重要和迫切。以往对西藏棕色蘑菇的选育主要利用形态学方法结合上述有益指标测定进行，但是受到特殊的青藏高气候原环境的影响不同地区所产的西藏棕色蘑菇常常出现同名异物和同物异名的现象，因此形态学鉴别法难以有效区分。更为困难的是，不能通过形态学方法筛选出总蛋白、总可溶性蛋白、总水解氨基酸、总多糖和总多酚含量高，抗氧化活性强，多酚氧化酶活性低的优质品种。DNA条形码分子鉴定技术是基于DNA条形码(基因组中保守且稳定遗传DNA序列)来进行物种和优良品质识别鉴定的分子生物学技术。它是传统育种方法的有效补充和拓展，能够在样品形态不完整或缺乏形态结构(加工制品如粉末等)时对样品进行精准和有效地鉴定。现有的DNA条形码技术中以核糖体中的ITS(核糖体RNA内转录间隔区)和线粒体体中的非编码区或保守基因序列已经用作DNA条形码序列。主要是针对少数基因或片段进行物鉴定导致信息量小鉴别效果差，而且不能用于优良品质特征鉴别筛选。现有的DNA条形码技术中限制性片段长度多态性(restriction fragmentlengthpolymorphism，RFLP)操作步骤繁琐复杂，同时要用到放射性同位素标记物或致癌性显影标记物，基因组模版用量大，带型少信息量小，同时容易受到基因突变影响而导致结果不稳定。现有的DNA条形码技术中随机扩增多态性DNA(random amplified polymorphicDNA，RAPD)易受干扰，对操作人员技术水平及稳定性重复性要求较高，此外，样品基因组模板的质量和浓度，引物长度及序列，PCR循环次数，基因组DNA的复杂性，技术设备等都可能导致RAPD技术重复性差。现有的DNA条形码技术中单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism，SNP)技术依赖于SNP芯片或质谱及测序技术，对设备要求高，价格昂贵，成本高。因此针对传统育种方法选育西藏棕色蘑菇品种不够准确费时费力的缺点，有必要提供一种可以准确、快捷鉴别西藏棕色蘑菇的所属品种，同时实现优质品质选育的DNA条形码技术，同时针对现有DNA条形码技术的缺陷，提供成本低，效率高，操作简便，结果稳定可靠性重复性好的检测方法。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种用于筛选优质西藏棕色蘑菇的DNA条形码。
本发明的另一目的在于提供一种用于筛选优质西藏棕色蘑菇的DNA条形码扩增引物。
本发明的再一目的在于提供所述DNA条形码和扩增引物的应用。
本发明的再一目的在于提供一种筛选优质西藏棕色蘑菇品种的方法。
本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：
用于筛选优质西藏棕色蘑菇的DNA条形码，包含核苷酸序列如SEQ ID NO：1～17所示的17个DNA片段中的一个或多个。
本发明基于西藏棕色蘑菇全基因组中所有简单重复序列(simplesequencerepeat，SSR)筛选出既能鉴定物种，又能与总蛋白、总可溶性蛋白、总水解氨基酸、总多糖和总多酚含量高，抗氧化活性强，多酚氧化酶活性低优良品质相关的上述17个DNA条形码，可用于辅助选育具有总蛋白、总可溶性蛋白、总水解氨基酸、总多糖和总多酚含量高，抗氧化活性强，多酚氧化酶活性低优良品质的西藏棕色蘑菇品种。其中，用于筛选总蛋白和总可溶性蛋白含量指标的DNA条形码，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1～3所示；用于筛选总水解氨基酸含量指标的DNA条形码，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO：4～5所示；用于筛选总多糖含量指标的DNA条形码，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO：6～8所示；用于筛选总多酚含量指标的DNA条形码，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO：9～11所示；用于筛选抗氧化活性指标的DNA条形码，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO：12～14所示；用于筛选多酚氧化酶活性指标的DNA条形码，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO：15～17所示。本发明针对西藏棕色蘑菇品种的每一种筛选性状都分别提供了2～3个DNA条形码，当只选择其中一个DNA条形码作为靶序列进行检测时，即可挑选出性状优良的西藏棕色蘑菇品种，而当同时选择所有DNA条形码作为靶序列时，则可大大提高该优良性状品种的筛选准确率和效率。
本发明的上述性状指标对应的DNA条形码可以根据实际的筛选需求，相互之间组合使用。例如当只需要筛选某一性状优良的西藏棕色蘑菇品种，如当需要筛选总蛋白和总可溶性蛋白含量高、总水解氨基酸含量高、总多糖含量高、总多酚含量高、抗氧化活性强或多酚氧化酶活性低的西藏棕色蘑菇品种时，分别选择上述筛选指标对应的DNA条形码作为靶序列进行检测。而当需要同时筛选两种或两种性状优良的西藏棕色蘑菇品种时，则根据实际的需求将性状指标对应的DNA条形码相互之间组合使用即可。当上述17个DNA条形码共同作为筛选的靶序列时，可获得筛选准确率最高的总蛋白、总可溶性蛋白、总水解氨基酸、总多糖和总多酚含量高，抗氧化活性强，多酚氧化酶活性低的西藏棕色蘑菇品种。
优选地，一组用于筛选总蛋白、总可溶性蛋白、总水解氨基酸、总多糖和总多酚含量高，抗氧化活性强，多酚氧化酶活性低的西藏棕色蘑菇品种的DNA条形码，共包含17个DNA片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1～17所示。
用于筛选优质西藏棕色蘑菇的DNA条形码扩增引物，包含上下游核苷酸序列分别如SEQ ID NO：18～51所示的17对引物中的一对或多对。其中，用于筛选总蛋白和总可溶性蛋白含量指标的DNA条形码扩增引物，包含3对引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO：18～23所示；用于筛选总水解氨基酸含量指标的DNA条形码扩增引物，包含2对引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO：24～27所示；用于筛选总多糖含量指标的DNA条形码的DNA条形码扩增引物，包含3对引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO：28～33所示；用于筛选总多酚含量指标的DNA条形码的DNA条形码扩增引物，包含3对引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO：34～39所示；用于筛选抗氧化活性指标的DNA条形码的DNA条形码扩增引物，包含3对引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO：40～45所示；用于筛选多酚氧化酶活性指标的DNA条形码的DNA条形码扩增引物，包含3对引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO：46～51所示。
本发明以上述17个DNA条形码为靶序列，依据西藏棕色蘑菇全基因组中所有简单重复序列(simple sequence repeat，SSR)位点分析筛选并设计了17对引物，利用这17对引物对样品基因组进行扩增所得片段多态性可辅助选育具有总蛋白、总可溶性蛋白、总水解氨基酸、总多糖和总多酚含量高，抗氧化活性强，多酚氧化酶活性低优良品质的棕色蘑菇。通过PCR扩增后电泳检测即可达到辅助育种的效果。所述17对DNA条形码扩增引物如上DNA条形码所述，可根据实际的性状筛选需求，在需要筛选的性状指标中包含的2～3对引物中选择一对进行使用，或者共同使用以提高该优良性状品种的筛选准确率和效率。当上述17对DNA条形码扩增引物共同作为检测引物时，可获得筛选准确率最高的总蛋白、总可溶性蛋白、总水解氨基酸、总多糖和总多酚含量高，抗氧化活性强，多酚氧化酶活性低的西藏棕色蘑菇品种。
优选地，一组用于筛选总蛋白、总可溶性蛋白、总水解氨基酸、总多糖和总多酚含量高，抗氧化活性强，多酚氧化酶活性低的西藏棕色蘑菇品种的DNA条形码扩增引物，共包含17对扩增引物，其引物的上下游核苷酸序列分别依次如SEQ ID NO：18～51所示。优质双孢蘑菇As2796总蛋白平均含量260毫克每克，可溶性总蛋白平均含量80毫克每克，总水解氨基酸平均含量160毫克每克，总多糖平均含量70毫克每克，总多酚平均含量10毫克每克，ABTS自由基平均清除率70％，多酚氧化酶活性4420单位每克。利用本发明上述引物可以筛选得到性各项指标均优于上述双孢蘑菇As2796的西藏棕色蘑菇样品。
本发明还提供上述DNA条形码或DNA条形码扩增引物在筛选或辅助选育优质西藏棕色蘑菇品种中的应用。
一种筛选优质西藏棕色蘑菇品种的方法，包括如下步骤：
S1.提取待测样品基因组DNA；
S2.以S1基因组DNA为模板，根据性状筛选需求，选择上述DNA条形码的扩增引物中的一对或多对分别进行PCR扩增反应；
S3.将S2的PCR扩增产物经毛细管荧光电泳检测，通过扩增产物的片段数、SSR位点数、SSR重复元件及其重复次数进行判定。
例如，当需要筛选出总蛋白和总可溶性蛋白含量高的西藏棕色蘑菇品种，通在步骤S2使用SEQ ID NO：18～23所示3对引物中的至少一对进行PCR扩增反应检测；当需要筛选出总蛋白和总可溶性蛋白含量高、总水解氨基酸含量高的西藏棕色蘑菇品种，则在步骤S2使用SEQ ID NO：18～23所示3对引物中的至少一对，SEQ ID NO：24～27所示2对引物中的至少一对分别进行PCR扩增反应检测。
优选地，步骤S2所述PCR扩增反应的体系为2×Taq PCR Master Mix 5μL，模板1μL，上游引物0.1μL，下游引物0.4μL，浓度10μM带荧光的M13引物0.4μL，用无菌的去离子水定容至10μL。
优选地，步骤S2所述PCR扩增反应的程序为95℃预变性3min；95℃变性30s，62至55℃降落PCR退火30s，72℃延伸30s，共10个循环；95℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，共25个循环；72℃终延伸20min；4℃保温6h。
具体地，当步骤S2中需要筛选总蛋白和总可溶性蛋白含量高的西藏棕色蘑菇品种时，可分别使用SEQ ID NO：18～23所示3对引物分别进行PCR扩增反应，将PCR扩增产物经毛细管电泳检测。检测判断：通过引物扩增片段中的SSR位点和SSR重复元件进行判断。当使用引物1.1进行片段扩增时，若扩增得到两个片段(两个峰)，含有2个SSR位点，SSR重复元件为AG，且一个扩增片段有5次重复AG，另一片段有6次重复AG，则判断待测样品为总蛋白和总可溶性蛋白含量高的西藏棕色蘑菇；当使用引物1.2进行片段扩增时，若扩增得到两个片段(两个峰)，含有2个SSR位点，SSR重复元件为CA，且一个扩增片段有6次重复CA，另一片段有7次重复CA，则判断待测样品为总蛋白和总可溶性蛋白含量高的西藏棕色蘑菇；当使用引物1.3进行片段扩增时，若扩增得到一个片段(一个峰)，含有1个SSR位点，SSR重复元件为AC，且扩增片段有5次重复AC，则判断待测样品为总蛋白和总可溶性蛋白含量高的西藏棕色蘑菇。当同时分别使用上述引物1.1、1.2、1.3进行综合检测判断时，准确性最好。
具体地，当步骤S2中需要筛选总水解氨基酸含量高的西藏棕色蘑菇品种时，可分别使用SEQ ID NO：24～27所示2对引物分别进行PCR扩增反应，将PCR扩增产物经毛细管电泳检测。当检测判断：通过引物扩增片段中的SSR位点和SSR重复元件进行判断。当使用引物2.1进行片段扩增时，若扩增得到一个片段(一个峰)，含有1个SSR位点，SSR重复元件为AT，且扩增片段有11次重复AT，则判断待测样品为总水解氨基酸含量高的西藏棕色蘑菇；当使用引物2.2进行片段扩增时，扩增得到1个片段(1个峰)，含有1个SSR位点，SSR重复元件为AT，且扩增片段有5次重复AT，则判断待测样品为总水解氨基酸含量高的西藏棕色蘑菇。当同时分别使用上述引物1.1、1.2进行综合检测判断时，准确性最好。
具体地，当步骤S2中需要筛选总多糖含量高的西藏棕色蘑菇品种时，使用SEQ IDNO：28～33所示3对引物分别进行PCR扩增反应，将PCR扩增产物经毛细管电泳检测。检测判断：通过引物扩增片段中的SSR位点和SSR重复元件进行判断。当使用引物3.1进行片段扩增时，若扩增得到两个片段(两个峰)，含有2个SSR位点，SSR重复元件为TG，且一个扩增片段有7次重复TG，另一片段有9次重复TG，则判断待测样品为总多糖含量高的西藏棕色蘑菇；当使用引物3.2进行片段扩增时，若扩增得到1个片段(1个峰)，含有1个SSR位点，SSR重复元件为TC，且扩增片段有11次重复TC，则判断待测样品为总多糖含量高的西藏棕色蘑菇；当使用引物3.3进行片段扩增时，若扩增得到一个片段(一个峰)，含有1个SSR位点，SSR重复元件为AT，且扩增片段有6次重复AT，则判断待测样品为总多糖含量高的西藏棕色蘑菇。当同时分别使用上述引物3.1、3.2、3.3进行综合检测判断时，准确性最好。
具体地，当步骤S2中需要筛选总多酚含量高的西藏棕色蘑菇品种时，使用SEQ IDNO：34～39所示3对引物分别进行PCR扩增反应，将PCR扩增产物经毛细管电泳检测。检测判断：通过引物扩增片段中的SSR位点和SSR重复元件进行判断。当使用引物4.1进行片段扩增时，若扩增得到1个片段(1个峰)，含有1个SSR位点，SSR重复元件为CT，且扩增片段有7次重复CT，则判断待测样品为总多酚含量高的西藏棕色蘑菇；当使用引物4.2进行片段扩增时，若扩增得到1个片段(1个峰)，含有1个SSR位点，SSR重复元件为AT，且扩增片段有6次重复AT，则判断待测样品为总多酚含量高的西藏棕色蘑菇；当使用引物4.3进行片段扩增时，若扩增得到2个片段(2个峰)，含有2个SSR位点，SSR重复元件为AT，且一个扩增片段有6次重复GA，另一片段有11次重复GA，则判断待测样品为总多酚含量高的西藏棕色蘑菇。当同时分别使用上述引物4.1、4.2、4.3进行综合检测判断时，准确性最好。
具体地，当步骤S2中需要筛选抗氧化活性强的西藏棕色蘑菇品种时，使用SEQ IDNO：40～45所示3对引物分别进行PCR扩增反应，将PCR扩增产物经毛细管电泳检测。检测判断：通过引物扩增片段中的SSR位点和SSR重复元件进行判断。当使用引物5.1进行片段扩增时，若扩增得到2个片段(2个峰)，含有2个SSR位点，SSR重复元件为AG，且一个扩增片段有6次重复AG，另一片段有7次重复AG，则判断待测样品为抗氧化活性强的西藏棕色蘑菇；当使用引物5.2进行片段扩增时，若扩增得到1个片段(1个峰)，含有1个SSR位点，SSR重复元件为CCA，且扩增片段有4次重复CCA，则判断待测样品为总多酚含量高的西藏棕色蘑菇；当使用引物5.3进行片段扩增时，若扩增得到2个片段(2个峰)，含有2个SSR位点，SSR重复元件为CAG，且一个扩增片段有6次重复CAG，另一片段有8次重复CAG，则判断待测样品为总多酚含量高的西藏棕色蘑菇。当同时分别使用上述引物5.1、5.2、5.3进行综合检测判断时，准确性最好。
具体地，当步骤S2中需要筛选多酚氧化酶活性低的西藏棕色蘑菇品种时，使用SEQID NO：46～51所示3对引物分别进行PCR扩增反应，将PCR扩增产物经毛细管电泳检测。检测判断：通过引物扩增片段中的SSR位点和SSR重复元件进行判断。当使用引物6.1进行片段扩增时，若扩增得到2个片段(2个峰)，含有2个SSR位点，SSR重复元件为TGA，且一个扩增片段有5次重复TGA，另一片段有8次重复TGA，则判断待测样品为多酚氧化酶活性低的西藏棕色蘑菇；当使用引物6.2进行片段扩增时，若扩增得到1个片段(1个峰)，含有1个SSR位点，SSR重复元件为TTG，且扩增片段有8次重复TTG，则判断待测样品为多酚氧化酶活性低的西藏棕色蘑菇；当使用引物6.3进行片段扩增时，若扩增得到1个片段(1个峰)，含有1个SSR位点，SSR重复元件为AAG，且扩增片段有3次重复AAG，则判断待测样品为总多酚含量高的西藏棕色蘑菇。当同时分别使用上述引物6.1、6.2、6.3进行综合检测判断时，准确性最好。
本发明还请求保护上述DNA条形码或上述DNA条形码扩增引物在制备用于筛选优质西藏棕色蘑菇品种的产品中的应用。
一种用于筛选优质西藏棕色蘑菇的产品，包含用于检测上述17个DNA条形码的扩增引物。
优选地，包含上下游核苷酸序列分别如SEQ ID NO：18～51所示的17对引物中的一对或多对。
优选地，所述产品还包含用于PCR扩增反应和用于荧光毛细管电泳检测所需的试剂。
优选地，所述产品为试剂盒。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种用于筛选优质西藏棕色蘑菇的DNA条形码、引物，可以利用西藏棕色蘑菇野生样品及少量组织或菌丝进行鉴别和优良品种选育；可以在西藏棕色蘑菇的菌丝体、原基、子实体、孢子等不同生长阶段鉴别品种和优良品种选育；筛选周期短，不收样品种类的限制，且不会造成浪费，克服了传统育种方法选育西藏棕色蘑菇品种不够准确费时费力的缺点。本发明的DNA条形码、引物可以准确地辨别形态相似性很高的品种，且与总蛋白、总可溶性蛋白、总水解氨基酸、总多糖和总多酚含量高，抗氧化活性强，多酚氧化酶活性低优良品质对应，辅助选育优良的西藏棕色蘑菇品种；不仅成本低，效率高，操作简便，结果稳定可靠性重复性好。本发明与传统育种方法及其他现有DNA条形码技术相比较，它具有省时、省力、省钱、准确、高效的优点，在优质西藏棕色蘑菇的遗传育种上发挥积极作用，同时也为种质资源的鉴定及保护提供了一种有效方法。
附图说明
图1为西藏棕色蘑菇总水解氨基酸含量高的优质品种筛选特异引物2.1，2.2PCR扩增产物毛细管电泳检测结果。
图2为实施例2和对比例2的总水解氨基酸含量比较结果。
图3为利用引物2.1扩增施例2和对比例2的扩增结果。
图4为利用引物2.2扩增施例2和对比例2的扩增结果。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例0西藏棕色蘑菇DNA条形码的构建及鉴定方法
依据西藏棕色蘑菇全基因组中所有简单重复序列(simple sequence repeat，SSR)位点分析筛选并设计了17对引物，利用这17对引物对样品基因组进行扩增所得片段多态性可辅助选育具有总蛋白、总可溶性蛋白、总水解氨基酸、总多糖和总多酚含量高，抗氧化活性强，多酚氧化酶活性低优良品质的棕色蘑菇。
(2)总水解氨基酸含量高的品种SSR特异引物扩增
西藏棕色蘑菇子实体中总水解氨基酸含量测定参照GB 5009.124-2016《食品安全国家标准食品中氨基酸的测定》规定的方法进行测定。
选取总水解氨基酸含量高于160毫克每克的西藏棕色蘑菇样品(该指标为双孢蘑菇As2796的总水解氨基酸含量平均值)。引物序列如表1，方法如(1)所述进行SSR特异引物扩增，扩增结果如图1所示，电泳图中片段大小等于所扩增片段实际bp数加上M13荧光引物的18bp。
表1西藏棕色蘑菇总水解氨基酸含量高的优质品种筛选特异引物
引物2.1扩增片段(靶序列)如SEQ ID NO：4所示，213bp。
引物2.2扩增片段(靶序列)如SEQ ID NO：5所示，198bp。
检测判断：通过引物扩增片段中的SSR位点和SSR重复元件进行判断。当使用引物2.1进行片段扩增时，若扩增得到一个片段(一个峰)，含有1个SSR位点，SSR重复元件为AT，且扩增片段有11次重复AT，则判断待测样品为总水解氨基酸含量高的西藏棕色蘑菇；当使用引物2.2进行片段扩增时，扩增得到1个片段(1个峰)，含有1个SSR位点，SSR重复元件为AT，且扩增片段有5次重复AT，则判断待测样品为总水解氨基酸含量高的西藏棕色蘑菇。当同时分别使用上述引物1.1、1.2进行综合检测判断时，准确性最好。
实施例2总水解氨基酸指标筛选验证
以广泛栽培的优质双孢蘑菇品种As2796为对比例2，优质西藏棕色蘑菇为实施例2。采集对比例2和实施例2子实体真空冷冻干燥的方法脱水后粉碎并过50目筛，总水解氨基酸含量测定参照GB 5009.124-2016《食品安全国家标准食品中氨基酸的测定》规定的方法进行测定。如图2所示，实施例2总水解氨基酸含量高于对比例2。
采集对比例2和实施例2子实体样品，提取基因组利用引物2.1，2.2进行扩增，方法如实施例1。
(1)引物2.1的扩增结果如图3所示；具体地，引物2.1所扩增的片段SSR重复元件为AT；实施例西藏棕色蘑菇有1个SSR位点，是260bp扩增片段的11次重复AT；对比例双孢菇As2796有1个SSR位点，是252bp扩增片段的7次重复AT，具体序列信息如下所示；其中，前18个碱基为M13荧光引物的18bp，下划线部分为SSR重复元件。
252bp扩增片段序列：
TGTAAAACGACGGCCAGTGCTTCACTCGTGGTGCTACTCCACAAAAACTCTATTCATCTAATTTAGATCAAGCACATATATAT ATATATCACGAAGATGCATTCAATAAAGCAGCACTTTCATCCGGTTTTGATTCAAAGCGCCTACGCATGGCGATAATCATTTTGGTA AACCTGGGGTTCCATTGGTAAGAGGCAAAAAAATATATTCCGGGACGGCAGCATACCAAAGGAGATTGAGGCCCTGGAGAGT；
260bp扩增片段序列：
TGTAAAACGACGGCCAGTGCTTCACTCGTGGTGCTACTCCACAAAAACTCTATTCATCTAATTTAGATCAAGCACATATATATATATATATATATATCACGAAGATGCATTCAATAAAGCAGCACTTTCATCCGGTTTTGATTCAAAGCGCCTACGCATGGCGATAATCATTTTGGTAAACCTGGGGTTCCATTGGTAAGAGGCAAAAAAATATATTCCGGGACGGCAGCATACCAAAGGAGATTGAGGCCCTGGAGAGT。
(2)引物2.2的扩增结果如图4所示；具体地，引物2.2所扩增的片段SSR重复元件为AT；实施例西藏棕色蘑菇有1个SSR位点，是213bp扩增片段的5次重复AT；对比例双孢菇As2796有1个SSR位点，是214bp扩增片段的6次重复AT。具体序列信息如下所示；其中，前18个碱基为M13荧光引物的18bp，下划线部分为SSR重复元件。
213bp扩增片段序列：
TGTAAAACGACGGCCAGTTACCGAATTGCCCACTGGTCAAGAGAGAGTTGATATTCCAGGCCGAAATCACTACCGACAAAAAA GCAAACATCAAGAGGAGAGCTTCAAATACTTAATATATATATGGACCTTGTCATGATAGAAACACTCACCAAAAAGAACAGTTCGCA GAAGGAGAAACGTATTAAACATAGCCATCGTGATCGTTGAAGC；
214bp扩增片段序列：
TGTAAAACGACGGCCAGTTACCGAATTGCCCACTGGTCAAGAGAGAGTTGATATTCCAGGCCGAAATCACTACCGACAAAAAAGCAAACATCAAGAGGAGAGCTTCAAATACTTAATATATATATATGGACCTTGTCATGAAGAAACACTCACCAAAAAGAACAGTTCGCAGAAGGAGAAACGTATTAAACATAGCCATCGTGATCGTTGAAGC
上述结果表明利用引物2.1，2.2可以将对比例2和实施例2有效区分开，引物2.1，2.2可用来筛选总水解氨基酸含量高的西藏棕色蘑菇。
Claims (10)
1.用于筛选优质西藏棕色蘑菇的DNA条形码，其特征在于，筛选总水解氨基酸含量高的西藏棕色蘑菇的DNA条形码包含核苷酸序列如SEQ ID NO：4～5所示的DNA片段中的一个或多个。
2.用于筛选优质西藏棕色蘑菇的DNA条形码扩增引物，其特征在于，筛选总水解氨基酸含量高的西藏棕色蘑菇的DNA条形码扩增引物包含上下游核苷酸序列分别如SEQ ID NO：24～27所示的2对引物中的一对或多对。
3.根据权利要求2所述的用于筛选优质西藏棕色蘑菇的DNA条形码扩增引物，其特征在于，包含上下游核苷酸序列分别如SEQ ID NO：24～27所示的2对引物中的多对。
4.一种筛选优质西藏棕色蘑菇品种的方法，其特征在于，筛选总水解氨基酸含量高的西藏棕色蘑菇，包括如下步骤：
S1.提取待测样品基因组DNA；
S2.以S1基因组DNA为模板，根据性状筛选需求，选择权利要求2或3所述的扩增引物中的一对或多对分别进行PCR扩增反应；
S3.将S2的PCR扩增产物经毛细管荧光电泳检测，通过扩增产物的片段数、SSR位点数、SSR重复元件及其重复次数进行判定。
5.根据权利要求4所述的一种筛选优质西藏棕色蘑菇品种的方法，其特征在于，步骤S3所述通过扩增产物的片段数、SSR位点数、SSR重复元件及其重复次数进行判定的标准为，当使用SEQ ID NO：24和25扩增时，扩增得到一个片段(一个峰)，含有1个SSR位点，SSR重复元件为AT，且扩增片段有11次重复AT，则判断待测样品为总水解氨基酸含量高的西藏棕色蘑菇；当使用SEQ ID NO：26和27扩增时，扩增得到1个片段(1个峰)，含有1个SSR位点，SSR重复元件为AT，且扩增片段有5次重复AT，则判断待测样品为总水解氨基酸含量高的西藏棕色蘑菇。
6.权利要求1所述的DNA条形码或权利要求2或3所述DNA条形码扩增引物在筛选或辅助选育优质西藏棕色蘑菇品种中的应用，其特征在于，在筛选或辅助选育总水解氨基酸含量高的西藏棕色蘑菇品种中的应用。
7.权利要求1所述的DNA条形码或权利要求2或3所述DNA条形码扩增引物在制备用于筛选优质西藏棕色蘑菇品种的产品中的应用，其特征在于，筛选总水解氨基酸含量高的西藏棕色蘑菇品种。
8.一种用于筛选优质西藏棕色蘑菇的产品，其特征在于，筛选总水解氨基酸含量高的西藏棕色蘑菇，包含用于检测权利要求1所述的DNA条形码的扩增引物。
9.根据权利要求8所述的产品，其特征在于，包含上下游核苷酸序列分别如SEQ ID NO：24～27所示的2对引物中的一对或多对。
10.根据权利要求8所述的产品，其特征在于，还包含用于PCR扩增反应和用于荧光毛细管电泳检测所需的试剂。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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