CN116970602B - 六妹羊肚菌、七妹羊肚菌和梯棱羊肚菌的种特异性引物及其应用 - Google Patents

六妹羊肚菌、七妹羊肚菌和梯棱羊肚菌的种特异性引物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了六妹羊肚菌、七妹羊肚菌和梯棱羊肚菌的种特异性引物及其应用，该应用方法包括以下步骤：1）通过三个物种的比较基因组学筛选物种特异性序列，开发物种专一性引物；2）通过ePCR筛选得到物种专一性引物；3）借助专一性引物对羊肚菌物种基因组DNA进行扩增，通过扩增目的条带的有无判定供试菌株的物种类别。本发明提供的3对特异性引物对通过PCR技术可以快速、准确、灵敏地实现上述应用，且引物特异性强，PCR扩增反应时间短，可快速鉴定出待测样品是六妹羊肚菌、七妹羊肚菌、或梯棱羊肚菌的哪一个种，并可快速检测出待测菌株是否发生了种间杂交。

Description

六妹羊肚菌、七妹羊肚菌和梯棱羊肚菌的种特异性引物及其 应用
技术领域
本发明申请型涉及生物学技术领域，具体涉及六妹羊肚菌、七妹羊肚菌和梯棱羊肚菌的种特异性引物及其应用。
背景技术
羊肚菌(Morchella spp.)俗称羊肚蘑或草笠竹，隶属于子囊菌门(Ascomycota)，盘菌目(Pezizales)，羊肚菌科(Morohellaceae)，羊肚菌属(Morchella)，是一种珍贵的食、药两用的真菌，因其菌盖表面凹凸不平、状如羊肚而得名。羊肚菌的野生产量少，采集困难，栽培技术不成熟，价格昂贵，近年来研究人员大力发展羊肚菌的人工培植技术。在科研工作者的不断努力下，我国的羊肚菌逐步走上商业化道路，据统计2021–2022年度，全国的羊肚菌种植面积已达25万亩。羊肚菌物种多样性丰富，全球至少包含78个系统发育学种，但可人工驯化栽培的羊肚菌主要为梯棱羊肚菌、六妹羊肚菌和七妹羊肚菌。
由于羊肚菌形态相近，可用于物种鉴定的形态特征较少，种内形态学特征差异较大，且不同生长阶段甚至同一生长阶段的形状、颜色和大小都存在较大差异，因而羊肚菌形态鉴定一直是分类学的难题。
羊肚菌在我国有着悠久的药用、食用历史，但一方面由于价格昂贵，市场上存在伪品销售的现象，如：钟菌Verpa spp.和鹿花菌Gyromitra escμLenta等，若加工不当极易导致食物中毒，另一方面，销售的羊肚菌菌种存在菌种混乱等问题，直接导致羊肚菌子实体生产率降低甚至绝收。因此亟需建立快速准确的羊肚菌鉴定方法，尤其是针对目前已经产业化栽培的六妹羊肚菌、七妹羊肚菌、梯棱羊肚菌菌种的真伪鉴别，对保障该产业的健康发展具有重要现实意义。
分子鉴别技术，如DNA条形码技术操作简便快捷，准确率高，已经被广泛应用于冬虫夏草等食药菌的真伪鉴别。已有文献报道可采用真菌通用片段ITS对羊肚菌属物种的鉴定，但依赖于对扩增条带的测序和序列分析，一方面成本较高，另外需要专业的数据分析工作和时间花费，无法及时快速的做到对待测样品的准确鉴定。特异性引物分子鉴定是一种有针对性的、快速准确的分析方法。目前尚未有针对六妹羊肚菌、七妹羊肚菌和梯棱羊肚菌的快速准确鉴定的特异性引物组的报道。
发明内容
为解决或部分解决相关技术中存在的问题，本发明申请提供六妹羊肚菌、七妹羊肚菌和梯棱羊肚菌的种特异性引物及其应用。本发明基于比较基因组学和电子PCR技术，针对已商业化的六妹羊肚菌、七妹羊肚菌、梯棱羊肚菌开发了3对特异性引物对，并结合收集自全国各地的人工栽培出菇子囊果标本和商业化栽培纯菌株，进行了物种识别的快速鉴定和种间杂交现象的挖掘。
本发明申请第一方面提供了引物组，包括：
六妹羊肚菌的特异性引物对，其包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1～2所示的上、下游引物；七妹羊肚菌的特异性引物对，其包括核苷酸序列如SEQ ID NO.3～4所示的上、下游引物；梯棱羊肚菌的特异性引物对，其包括核苷酸序列如SEQ ID NO.5～6所示的上、下游引物。
本发明申请第二方面提供了一种羊肚菌种类快速准确鉴定方法，包括以下步骤：
1)通过三个物种的比较基因组学筛选物种特异性序列，开发物种专一性引物；
2)通过ePCR筛选得到物种专一性引物；
3)提取待测菌株总DNA作为PCR扩增模板；
4)分别以3对特异性引物对进行PCR扩增；
5)对获得的扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳方法进行鉴定，电泳结果显示哪对特异性引物对扩增出目的条带，说明待测菌株就是哪个物种，若有2对特异性引物对扩增出目的条带，则说明待测菌株是两个物种的杂交后代。
进一步的，所述3对特异性引物的获得通过比较基因组获得物种特异性序列，对特异性序列进行引物设计，并在六妹羊肚菌、七妹羊肚菌和梯棱羊肚菌群体中进行电子PCR得到物种专一性序列位点和引物。
进一步的，所述3对特异性引物所对应的物种特异性序列ID：D15A05、D01A03、D19A26，序列信息分别为SEQ ID NO.7～9所示。
SEQ ID No.7
D15A05
CGGGTCCATTAGCTTGGGTTAGGTTAGGTGCAAGCAAATCTTTACCTACAAGTAGGTAACCCATGGTTTGAGTGATAAGCCATGATCACATACAAAAGGGAAAAATAAAGATTTTCGTCAAAGAGAGGTATCATAACCTAACCCACTACACAAAAAGCCCTCTCCATTCATTACTGGGGGATTTGTACCAATTTACTCACAGTGGGTAAGCCGGATATGGCAGGTCGGGTTGGGTTGGGTATGGGTAAGCCTACTCATAATGTGGGTTAGGTTGGGTGAGGCTTCAATCTAACCCGGGTTCACCCATTACTGGGTCTGCTCGTCACCTCCGATTGCGGATAATCTATCTCTCCAAAACTGTACTCTAGGGTATTGCCTCGCCTCGAGATTGAGTCTCTAGAGGAACCCCCAAGACAAACCCCTAAGACAAAGTCTCCCGTTATTATATGTCATGTCCATTGCTACTTGCGTTGGATCTTACAAGTCTCGATCTCGCCGCGCATACTGATGGAGCGGTCTTTTAACAGCAGTATAGATAACCTTCTTCTCATCCTATCGCGCTTTTCCATTGTAATCAATAACATCGCCTTCCATTCCACTTGATCTATAGTTCTACTCCGCTGGAACGAGAGACTCAGCATAGATTGACCAACCCCGAAGAACATTAATAGCATAACCTCACGCCGG
SEQ ID No.8
D01A03
AGCGTGGGACTAGAGCAGTAGGGATTAGTACAAATCTCCTCAAATCATTCACACAAGATAACAAGGAACTAAATGGGTGAAAGGTTTATACCTTCGATGATAGAAGATCCGACTTTGTACGAGTTGTCTCCTTCTCAGGTAGTCATTTTTGGATATATCTAACGTCCTCAAACCATATTATTAGCATGTGCACGCAAATAAAGTTTGATTATTTCAGTGAAACTTACAGATATAAAAGTAAATTGGTGCTTGAGAGCTGTGTGTTGGTTTTTCAGTCGGGTATAAATAGGATCACAAGAACGCTTAGTAGGTAATAGCAGAATTAAAGTAGGTCCGAAACTCTGGAGCTGTCATCTAATAGTTTTTGACTACCAAAGTTCAAATGATCATATTAACTCCCCTCTGCATACAAATGCCTTCTGTTTAGGCGTCGGCCTTCTTCCAAAACAGGATATTAGGTTAAGTTAATTTTCCTCCGCCCCTACATATACCATTGAACTCTGGATCCACAAAAGGGTTTTGTTTAGTATATCCCCTAGCAGTTTGAGTATTCATATTGGGGGAACCGAGAATATATGGATATAAAGACTTCCATTAGCAAACCGTATTATTCGAAGCCCTTGCCCAAAGAGTATGACTGTGTGGTTGCCTCTTACTGTCAAGCAAGAGATTACAGGTCCCAATCCAGTGTCTCCAGCCGCCGAGATACCCATCTTGCCAGTCAGGCTGGGCTTTAGGAGTTTTCCCCAGTCATTTGCTCAAATGTACACAGGGGTAATCCCTTGAACGCCA
SEQ ID No.9
D19A26
GGAATTTTAGGGCGGGGGAACGAACATACATACCAGAGCCATGTGACCTAAATTGAGATATTCCCGCACCCAGTGGGGTTCTCTGAGATTCGATCGGCTTCCCATAGACCGCCTAGGAAATGGAGTGGGATACACGCCCTCTATCTTTTCACTCTCATGCATAGGCACATGGATGTAATACTACTTACTGTTGCCGGGTGTGGCTCGATGAACTGTCAGCTTTGAAGCGTGGCTCGAATCACTACATACATGTATGTAGTCTTGAGAAATAGTGCGCAGTGTTACCGAAGACATGCGCATGCATGGATCGAGGTAATTGTTAAGAAGGCTAATGTGATATCGATATTCACATTAACTTCGGGTACCTAGTCTCCTTTTATAGCCTGGTGGAATAAGTTGTTTTATAATTTATTATCTATTATATGATATCATTATTGAAGGTTAGGTAACTTCTATACTTCTCAGACCGGAATCGAGGTTGTTTTGCAATTATGCAAGAGCACGTTGTAGTACGTGGCGTATGATGAGGCTGCTAAACATGTAGCTAAACAAGTGGCTAAGGAAGATGTGTCTAGACGAGTAGCGACGTAAGAGAGAACCACACACTAGATTAGTCTTCTTGTACTCATAGGTCATCATCACAAATACATTGTCTGTCTTGTCTTCGGCC
进一步的，所述3对特异性引物的扩增体系相同，均采用10μL反应体系：10×buffer 1.0μL，dNTP 0.15μL，TaKaRa的rTaq酶0.15μL，F引物/R引物各0.5μL，20–50ng/μL的DNA模板0.6μL，ddH2O补足10.0μL；
进一步的，六妹羊肚菌的特异性引物对D15A05F/R的PCR扩增程序为：95℃预变性3min；95℃变性20sec，63℃退火15sec，72℃延伸25sec，34个循环；72℃延伸5min；
进一步的，七妹羊肚菌的特异性引物对D01A03F/R的PCR扩增程序为：95℃预变性3min；95℃变性20sec，62℃退火15sec，72℃延伸25sec，34个循环；72℃延伸5min；
进一步的，梯棱羊肚菌的特异性引物对D19A26F/R的PCR扩增程序为：95℃预变性3min；95℃变性20sec，62℃退火15sec，72℃延伸25sec，38个循环；72℃延伸5min；
进一步的，对获得的扩增产物通过1.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定方法进行鉴定；
所述琼脂糖凝胶电泳鉴定方法为：PCR产物5μL+1μL 10x Loading Buffer，电压100V，时间20min，鉴定六妹羊肚菌的特征在于，特异性引物对D15A05F/R成功扩增，获得大小为687bp的唯一条带；鉴定七妹羊肚菌的特征在于，特异性引物对D01A03F/R成功扩增，获得大小为792bp的唯一条带；鉴定梯棱羊肚菌的特征在于，特异性引物对D19A26F/R成功扩增，获得大小为670bp的唯一条带；
进一步的，对获得的扩增产物通过1.0％琼脂糖凝胶电泳检测方法进行六妹羊肚菌、七妹羊肚菌、梯棱羊肚菌种间杂交现象的检测；
所述琼脂糖凝胶电泳检测方法：PCR产物5μL+1μL 10x Loading Buffer，电压100V，时间20min，检测出两个物种发生杂交现象的特征在于，待测样品可同时被2对特异性引物对成功扩增，分别获得相应特异性引物对的唯一目的条带。
应当理解的是，以上的一般描述和后文的细节描述仅是示例性和解释性的，并不能限制本发明申请。
本发明的有益技术效果：
本发明提供的3对特异性引物对的序列目前国内均未见报道，可以利用3对特异性引物对进行扩增，通过检测目的条带的有无实现产业化栽培种六妹羊肚菌、七妹羊肚菌、梯棱羊肚菌的快速鉴定，该方法简捷且结果稳定可靠。此方法还可以用于检测六妹羊肚菌、七妹羊肚菌、梯棱羊肚菌的杂交现象。
附图说明
图1为六妹羊肚菌特异性引物对D15A05F/R扩增条带的琼脂糖凝胶电泳图，其中，M代表Marker，样本15、16、17、18、20代表六妹羊肚菌，样本14和22代表七妹羊肚菌，样本13、19、21、23、24代表梯棱羊肚菌。
图2为七妹羊肚菌特异性引物对D01A03F/R扩增条带的琼脂糖凝胶电泳图，其中，M代表Marker，样本14和22代表七妹羊肚菌，样本15、16、17、18、20代表六妹羊肚菌，样本13、19、21、23、24代表梯棱羊肚菌。
图3为梯棱羊肚菌特异性引物对D19A26F/R扩增条带的琼脂糖凝胶电泳图其中，M代表Marker，样本13、19、21、23、24代表梯棱羊肚菌，样本15、16、17、18、20代表六妹羊肚菌，样本14和22代表七妹羊肚菌。
图4为252个待测样品与已知物种的聚类分支情况。
图5为样品A013、A047、A048、A051利用特异六妹羊肚菌特异性性引物对D15A05F/R扩增获得的条带的电泳检测结果。其中，M代表Marker，样本11代表A013、样本41代表A047、样本42代表A048、样本45代表A051。
图6为样品A013、A047、A048、A051利用特异七妹羊肚菌特异性性引物对D01A03F/R扩增获得的条带的电泳检测结果。其中，M代表Marker，样本11代表A013、样本41代表A047、样本42代表A048、样本45代表A051。
图7为六妹羊肚菌特异性引物对D15A05F/R设计片段序列和样本A013、A047、A048、A051测序序列的比对结果。
图8为六妹羊肚菌特异性引物对D01A03F/R设计片段序列和样本A013、A047、A048、A051测序序列的比对结果。
具体实施方式
下面将参照附图更详细地描述本发明申请的可选实施方式。虽然附图中显示了本发明申请的可选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明申请而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了使本发明申请更加透彻和完整，并且能够将本发明申请的范围完整地传达给本领域的技术人员。
在本发明申请使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的，而非旨在限制本发明申请。在本发明申请和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一种”、“所述”和“该”也旨在包括多数形式，除非上下文清楚地表示其他含义。还应当理解，本文中使用的术语“和/或”是指并包含一个或多个相关联的列出项目的任何或所有可能组合。
以下结合附图对本发明申请六妹羊肚菌、七妹羊肚菌和梯棱羊肚菌的种特异性引物及其应用进行详细说明，具体如下：
用于六妹羊肚菌、七妹羊肚菌和梯棱羊肚菌的鉴定方法、特异性引物组及其应用，该方法包括以下步骤：1)通过三个物种的比较基因组学(六妹羊肚菌基因组序列[https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/JAMGYU000000000]，七妹羊肚菌基因组序列[https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/JAMGZG000000000.1/]和梯棱羊肚菌基因组序列[https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCA_003444635.2])筛选物种特异性序列，开发物种专一性引物；2)通过ePCR筛选得到物种专一性引物；3)提取待测样品总DNA作为PCR扩增模板；4)分别以3个特异性引物对进行PCR扩增；5)对获得的扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳方法进行鉴定，电泳结果显示哪对特异性引物对扩增出目的条带，说明待测菌株就是哪个物种，若有2对特异性引物对扩增出目的条带，则说明待测菌株是两个物种的杂交后代。
根据所述的一种用于六妹羊肚菌、七妹羊肚菌和梯棱羊肚菌的鉴定方法、特异性引物组及其应用，其中所述的
六妹羊肚菌的特异性引物的序列为SEQ ID NO.1～2：
D15A05F：5’-CGGGTCCATTAGCTTGGGTT-3’；
D15A05R：5’-CCGGCGTGAGGTTATGCTAT-3’。
七妹羊肚菌的特异性引物的序列为SEQ ID NO.3～4：
D01A03F：5’-AGCGTGGGACTAGAGCAGTA-3’；
D01A03R：5’-TGGCGTTCAAGGGATTACCC-3’。
梯棱羊肚菌的特异性引物的序列为SEQ ID NO.5～6：
D19A26F：5’-GGAATTTTAGGGCGGGGGAA-3’；
D19A26R：5’-GGCCGAAGACAAGACAGACA-3’。
在本发明中，利用特异性引物对D15A05F/R引物对PCR扩增获得大小为687bp的唯一条带，表明菌株是六妹羊肚菌；利用特异性引物对D01A03F/R引物对PCR扩增获得大小为792bp的唯一条带，表明菌株是七妹羊肚菌；利用特异性引物对D19A26F/R引物对PCR扩增获得大小为670bp左右的唯一条带，表明菌株是梯棱羊肚菌；检测样品若能检测到两条特异性目的条带，说明该菌株为这两个种的杂交菌株，可用作开展菌丝融合杂交的实验材料。
本发明基于前期研究工作获得的六妹羊肚菌(M.sextelata)、七妹羊肚菌(M.eximia)和梯棱羊肚菌(M.importuna)的基因组序列，设计了3对特异性引物对，扩增条带均为单一条带，通过琼脂糖凝胶电泳检测目的条带的有无即可鉴定待测菌株，方法简捷，结果稳定易观察。
经大量实验证明，本发明所涉及的3对特异性引物对的扩增成功率均高于95％，其中，六妹羊肚菌的特异性引物对D15A05F/R的成功扩增率为100％，七妹羊肚菌的特异性引物对D01A03F/R的成功扩增率为100％，梯棱羊肚菌的特异性引物对D19A26F/R的成功扩增率为96.2％；引物特异性好，灵敏度高，扩增条带均为单一条带，通过检测目的条带的有无即可鉴定菌株的种类，结果稳定可靠，提高了鉴定效率。
本发明中所涉及的特异性引物组的开发方法和引物序列目前国内外均未报道，针对目前已经产业化栽培的六妹羊肚菌、七妹羊肚菌、梯棱羊肚菌的菌株真伪进行快速准确的鉴别，对保障该产业的健康发展具有重要现实意义。
为更清楚起见，下面通过以下实施例进行详细说明。
实施例1
1样品总DNA提取
取羊肚菌干品菌柄约30mg，经高通量组织研磨器SCIENTZ-48研磨后，用北京擎科生物科技有限公司的DNA提取试剂盒提取总DNA，用重蒸水稀释至25ng/μL备用。
2ITS通用引物PCR扩增反应及测序
使用真菌通用的ITS序列作为羊肚菌DNA条形码：
PCR扩增体系：2×Taq MasterMix(Dye)15μl，10μM/L的真菌通用引物ITS1F/ITS4R各0.75μL，DNA模板2μL浓度25ng/μL，ddH2O补足至30μL。
PCR扩增程序：95℃预变性5min；95℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸40sec，38个循环；72℃延伸5min。
琼脂糖凝胶电泳：PCR产物5ml(含Loading Buffer)，电压100V，时间25min，可获得600–800bp之间的唯一条带。
PCR产物测序：将扩增的PCR产物送到北京擎科生物科技有限公司进行测序。
3通过序列比对分析，对待测样品进行物种鉴定
3.1通过BLAST比对，对待测样品进行物种鉴定
测序获得的序列去掉两端测序杂峰和引物序列后，提交到NCBI(National Centerfor Biotechnology Information)，https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/BlastAlign.cgi，进行BLAST比对，解析获得待测样品的物种名称；
3.2通过与已知物种ITS序列的聚类分析，对待测样品进行物种鉴定从NCBI下载六妹羊肚菌(Genbank NO.JQ321877)、七妹羊肚菌(Genbank NO.JQ321901)、梯棱羊肚菌(Genbank NO.JQ321874)及其近源种头丝羊肚菌(Genbank NO.JQ321880)、欧氏羊肚菌(Genbank NO.MK321847)和Mel-8(Genbank NO.JQ723045)的ITS序列(序列信息见序列表)。所有序列用MAFFT进行比对获得序列矩阵，在MEGA-X软件上构建单个片段的邻接树(neighbor-joining，NJ)，建树建树时采用Kimura2-parameter模型，所有对位排列结果中的空位(gaps)或缺失数据(missing data)作完全删除(complete deletion)处理，系统树的每个分支的支持率以自展法(bootstrap)进行检验，重复次数为1000次。图4显示的是252个待测样品与已知物种的聚类分支情况。BLAST比对结果和聚类分析的结果完全一致，待测样品的物种鉴定情况见表1。
表1待测样品的物种鉴定信息表
4特异性引物对D15A05F/R在待测样品中进行PCR扩增
10μL反应体系：10×buffer 1.0μL，dNTP 0.15μL，TaKaRa的rTaq酶0.15μL，D15A05F/R引物各0.5μL，25ng/μL的DNA模板0.6μL，ddH2O补足10.0μL；
PCR扩增程序为：95℃预变性3min；95℃变性20sec，63℃退火15sec，72℃延伸25sec，34个循环；72℃延伸5min；
琼脂糖凝胶电泳方法：PCR产物5μL+1μL 10x Loading Buffer，电压100V，时间20min。
5特异性引物对D01A03F/R在待测样品中进行PCR扩增
10μL反应体系：10×buffer 1.0μL，dNTP 0.15μL，TaKaRa的rTaq酶0.15μL，D01A03F/R引物各0.5μL，25ng/μL的DNA模板0.6μL，ddH2O补足10.0μL；
PCR扩增程序为：95℃预变性3min；95℃变性20sec，62℃退火15sec，72℃延伸25sec，34个循环；72℃延伸5min；
琼脂糖凝胶电泳方法：PCR产物5μL+1μL 10x Loading Buffer，电压100V，时间20min。
6特异性引物对D19A26F/R在待测样品中进行PCR扩增
10μL反应体系：10×buffer 1.0μL，dNTP 0.15μL，TaKaRa的rTaq酶0.15μL，D19A26F/R引物各0.5μL，25ng/μL的DNA模板0.6μL，ddH2O补足10.0μL；
95℃预变性3min；95℃变性20sec，62℃退火15sec，72℃延伸25sec，38个循环；72℃延伸5min；
琼脂糖凝胶电泳方法：PCR产物5μL+1μL 10x Loading Buffer，电压100V，时间20min。
7检测发现杂交个体
根据特异性引物组扩增条带的检测结果发现：样品A013、A047、A048、A051利用六妹羊肚菌特异性引物对D15A05F/R成功扩增，获得大小为687bp的唯一条带，利用七妹羊肚菌特异性引物对D01A03F/R成功扩增，获得大小为792bp的唯一条带。图5显示为样品A013、A047、A048、A051利用特异六妹羊肚菌特异性性引物对D15A05F/R扩增获得的条带的电泳检测结果，图6显示为样品A013、A047、A048、A051利用特异七妹羊肚菌特异性性引物对D01A03F/R扩增获得的条带的电泳检测结果。其中，M代表Marker，样本11代表A013、样本41代表A047、样本42代表A048、样本45代表A051。
8将杂交个体特异性片段进行测序和BLAST比对将样品A013、A047、A048、A051利用特异性引物对D15A05F/R、D01A03F/R扩增的条带送到北京擎科生物科技有限公司进行测序。测序结果如SEQ ID NO.10～17所示。
SEQ ID NO.10
A013-D01A03
AAGGAACTAAATGGGTGAAAGGTTTATACCTTCGATGATAGAAGATCCGACTTTGTACGAGTTGTCTCCTTCTCAGGTAGTCATTTTTGGATATATCTAACGTCCTCAAACCATATTATTAGCATGTGCACGCAAAGAAAGTTTGATTATTTCATTGAAACTTACAGATATAAAAATAAATTGGTGCTTGAGAGCTGTGTGTTGGTTTTTCAGTCGGGGATAAATAGGATCACAAGAACGCTTAGTAGGTAATAGCAGAATTAAAGTAGGTCCGAATCTCTGGAGCTGTCATCTAATAGTTTTTGACTACCAAAGTTCAAATGATCATATTAACTCCCCTCTGCATACAAATGCCTTCTGTTTAGGCGTCCGCCTTCTTCCAAAACAGGATATTAGGTTAAGTTAATTTTCCTCCGCCCCTACATATACCATTGAACTCTGGATCCACAAAAGGGTTTTGTTTAGTATTTCCCCTAGCAGTTTGAGTATTCATATCGGGGGAACCGAGAATATATGGATATAAAGACTTCCATTAGCAAACTGTATTATTCGAAGCCCTTGCCCAAAGAGTATGACTGTGTGGTTGCCTCTTACTGTCAAGCGAGAGATTACAGGTCCCAATCCAGTGTCTCCAGCCGCCGAGATACCCATCTTGCCAGTCAGGCTGGGCTTTAGGAGTTTTCCCCAGTCATTTGCTC
SEQ ID NO.11
A047-D01A03
AAGGAACTAAATGGGTGAAAGGTTTATACCTTCGATGATAGAAGATCCGACTTTGTACGAGTTGTCTCCTTCTCAGGTAGTCATTTTTGGATATATCTAACGTCCTCAAACCATATTATTAGCATGTGCACGCAAAAAAAGTTTGATTATTTCATTGAAACTTACAGATATAAAAGTAAATTGGTGCTTGAGAGTTGTGTGTTGGTTTTTCAGTCGGGTATAAATAGGATCACAAGAACGCTTAGTAGGTAATAGCAGAATTAAAGTAGGTCCGAAACGCTGGAGCTGTCATCTAATAGTTTTTGACTACCAAAGTTCAAATGATCATATTAACTCCCCTCTGCATACAAATGCCTTCTGTTTAGGCGTCCGCCTTCTTCCAAAACAGGATATTAGGTTAAGTTAATTTTCCTCCGCCCCTACATATACCATTGAACTCTGGATCCACAAAAGGGTTTTGTTTAGTATTTCCCCTAGCAGTTTGAGTATTCATATTGGGGGAACCGAGAATATATGGATATAAAGACTTCCATTAGCAAACCGTATTATTCGAAGCCCTTGCCCAAAGAGTATGACTGTGTGGTTGCCTCTTACTGTCAAGCAAGAGATTACAGGTCCCAATCCAGTGTCTCCAGCCGCCGAGATACCCATCTTGCCAGTCAGGCTGGGCTTTAGGAGTTTTCCCCAGTCATTTGCTC
SEQ ID NO.12
A048-D01A03
AAGGAACTAAATGGGTGAAAGGTTTATACCTTCGATGATAGAAGATCCGACTTTGTACGAGTTGTCTCCTTCTCAGGTAGTCATTTTTGGATATATCTAACGTCCTCAAACCATATTATTAGCATGTGCACGCAAAAAAAGTTTGATTATTTCATTGAAACTTACAGATATAAAAGTAAATTGGTGCTTGAGAGTTGTGTGTTGGTTTTTCAGTCGGGTATAAATAGGATCACAAGAACGCTTAGTAGGTAATAGCAGAATTAAAGTAGGTCCGAAACGCTGGAGCTGTCATCTAATAGTTTTTGACTACCAAAGTTCAAATGATCATATTAACTCCCCTCTGCATACAAATGCCTTCTGTTTAGGCGTCCGCCTTCTTCCAAAACAGGATATTAGGTTAAGTTAATTTTCCTCCGCCCCTACATATACCATTGAACTCTGGATCCACAAAAGGGTTTTGTTTAGTATTTCCCCTAGCAGTTTGAGTATTCATATTGGGGGAACCGAGAATATATGGATATAAAGACTTCCATTAGCAAACCGTATTATTCGAAGCCCTTGCCCAAAGAGTATGACTGTGTGGTTGCCTCTTACTGTCAAGCAAGAGATTACAGGTCCCAATCCAGTGTCTCCAGCCGCCGAGATACCCATCTTGCCAGTCAGGCTGGGCTTTAGGAGTTTTCCCCAGTCATTTGCTC
SEQ ID NO.13
A051-D01A03
AAGGAACTAAATGGGTGAAAGGTTTATACCTTCGATGATAGAAGATCCGACTTTGTACGAGTTGTCTCCTTCTCAGGTAGTCATTTTTGGATATATCTAACGTCCTCAAACCATATTATTAGCATGTGCACGCAAAGAAAGTTTGATTATTTCATTGAAACTTACAGATATAAAAATAAATTGGTGCTTGAGAGCTGTGTGTTGGTTTTTCAGTCGGGGATAAATAGGATCACAAGAACGCTTAGTAGGTAATAGCAGAATTAAAGTAGGTCCGAATCTCTGGAGCTGTCATCTAATAGTTTTTGACTACCAAAGTTCAAATGATCATATTAACTCCCCTCTGCATACAAATGCCTTCTGTTTAGGCGTCCGCCTTCTTCCAAAACAGGATATTAGGTTAAGTTAATTTTCCTCCGCCCCTACATATACCATTGAACTCTGGATCCACAAAAGGGTTTTGTTTAGTATTTCCCCTAGCAGTTTGAGTATTCATATCGGGGGAACCGAGAATATATGGATATAAAGACTTCCATTAGCAAACTGTATTATTCGAAGCCCTTGCCCAAAGAGTATGACTGTGTGGTTGCCTCTTACTGTCAAGCGAGAGATTACAGGTCCCAATCCAGTGTCTCCAGCCGCCGAGATACCCATCTTGCCAGTCAGGCTGGGCTTTAGGAGTTTTCCCCAGTCATTTGCTC
SEQ ID NO.14
A013-D15A05
AAGCAATCTTTACTACAGTAGGTAACCCATGGTTTGAGTGATAAGCCATGATCACATACAAAAGGGAAAAATAAAGATTTTCGTCAAAGAGAGGTATCATAACCTAACCCATTACACAAAAGCCCTCTCCATTCATTACTGGGGGATTTGTACCAATTTACTCACAGTGGGTAAGCCGGGTATGGCAGGTCGGGTTGGGTTGGGTATGGGTAAGCCTACTCATAATGTGGGTTAGGTTGGGTGAGGCTTCAATCTAACCCGGGTTCACCCATTACTGGGTCTGCTCGTCACCTCCGATTGCGGATAATCTATCTCTCCAAAACTGTACTCTAGGGTATTGCCTCGCCTCGAGATTGAGTCTCTAGAGGAACCCCCAAGACAAACCCCTAAGACAAAGTCTCCCGTTATTATATGTCATGTCCATTGCTACTTGCGTTGGATCTTACAAGTCTCGATCTCGCTGCGTATACTGATGGAGCGGTCTTTTAACAGTAGTATAGATAACCTTCTTCTCATCCTATCGCGCTTTTCCATTGTAATCAATAACATCGCCTTCCATTCCACTTGATCTATAGCTCTACTCCGCTGGAACGAGAGACTCAGCATAGATTTACCAACCCCGAAGAACATTAATAGCACCCCCCCCCCCCGGGGGGGAGGTGGATG
SEQ ID NO.15
A047-D15A05
GGTGGTCCATCTTTACCTACAGTAGGTAACCCATGGTTTGAGTGATAAGCCATGATCACATACAAAAGGGAAAAATAAAGATTTTCGTCAAAGAGAGGTATCATAACCTAACCCATTACACAAAAGCCCTCTCCATTCATTACTGGGGGATTTGTACCAATTTACTCACAGTGGGTAAGCCGGGTATGGCAGGTCGGGTTGGGTTGGGTATGGGTAAGCCTACTCATAATGTGGGTTAGGTTGGGTGAGGCTTCAATCTAACCCGGGTTCACCCATTACTGGGTCTGCTCGTCACCTCCGATTGCGGATAATCTATCTCTCCAAAACTGTACTCTAGGGTATTGCCTCGCCTCGAGATTGAGTCTCTAGAGGAACCCCCAAGACAAACCCCTAAGACAAAGTCTCCCGTTATTATATGTCATGTCCATTGCTACTTGCGTTGGATCTTACAAGTCTCGATCTCGCTGCGTATACTGATGGAGCGGTCTTTTAACAGTAGTATAGATAACCTTCTTCTCATCCTATCGCGCTTTTCCATTGTAATCAATAACATCGCCTTCCATTCCACTTGATCTATAGCTCTACTCCGCTGGAACGAGAGACTCAGCATAGATTTACCAACCCCGAAGAACATTATAGTACCCCCCCCCCCCCCCGGGGGCCCCCCC
SEQ ID NO.16
A048-D15A05
GGAGTGGCCATCTTTACCTACAGTAGGTAACCCATGGTTTGAGTGATAAGCCATGATCACATACAAAAGGGAAAAATAAAGATTTTCGTCAAAGAGAGGTATCATAACCTAACCCATTACACAAAAGCCCTCTCCATTCATTACTGGGGGATTTGTACCAATTTACTCACAGTGGGTAAGCCGGGTATGGCAGGTCGGGTTGGGTTGGGTATGGGTAAGCCTACTCATAATGTGGGTTAGGTTGGGTGAGGCTTCAATCTAACCCGGGTTCACCCATTACTGGGTCTGCTCGTCACCTCCGATTGCGGATAATCTATCTCTCCAAAACTGTACTCTAGGGTATTGCCTCGCCTCGAGATTGAGTCTCTAGAGGAACCCCCAAGACAAACCCCTAAGACAAAGTCTCCCGTTATTATATGTCATGTCCATTGCTACTTGCGTTGGATCTTACAAGTCTCGATCTCGCTGCGTATACTGATGGAGCGGTCTTTTAACAGTAGTATAGATAACCTTCTTCTCATCCTATCGCGCTTTTCCATTGTAATCAATAACATCGCCTTCCATTCCACTTGATCTATAGCTCTACTCCGCTGGAACGAGAGACTCAGCATAGATTTACCAACCCCGAAGAACTTATAATTTTTCCCCGCGGGGGGGGGGGGGAGGAGAAAAG
SEQ ID NO.17
A051-D15A05
GACTGTTTGGTATGTGACCCATGGTTTGAGTGATAAGCCATGATCACATACAAAAGGGAAAAATAAAGATTTTCGTCAAAGAGAGGTATCATAACCTAACCCACTACACAAAAAGCCCTCTCCATTCATTACTGGGGGATTTGTACCAATTTACTCACAGGGGGTAAGCCGGATATGGCAGGTCGGGTTGGGTTGGGTATGGGTAAGCCTACTCATAATGGGGGTTAGGTTGGGGGAGGCTTCAATCTAACCCGGGTTCACCCATTACGGGGTCTGCTCGTCACCTCCGATTGCGGATAATCTATCTCTCCAAAACTGTACTCTAGGGTATTGCCTCGCCTCGAGATTGAGTCTCTAAAGGAACCCCCAAGACAAACCCCTAAAACAAAGTCTCCCGTTATTATATGTCATGTCCATTGCTACTTGCGTTGGATCTTACAAGTCTCGATCTCGCCGCGCATACTGATGGAGCGGTCTTTTAACAGCAGTATAAATAACCTTCTTCTCATCCTATCGCGCTTTTCCATTGTAATCAATAACATCGCCTTCCATTCCACTTGATCTATAGTTCTACTCCGCTGGAACGAGAGACTCAGCATAGATTGACCAACCCCGAAGAAATTATATCCCCCCCCCCCCCCGGGGGGGGGTGGTAATTGTGTTA
将上述序列去掉两端测序杂峰和引物序列后，提交到NCBI(National Center forBiotechnology Information)，https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/BlastAlign.cgi，进行BLAST比对，比对结果如图7、图8所示，图7显示了六妹羊肚菌特异性引物对D15A05F/R设计片段序列和样本A013、A047、A048、A051测序序列的比对结果，图8显示了六妹羊肚菌特异性引物对D01A03F/R设计片段序列和样本A013、A047、A048、A051测序序列的比对结果。
以上已经描述了本发明申请的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。本文中所用术语的选择，旨在最好地解释各实施例的原理、实际应用或对市场中的技术的改进，或者使本技术领域的其它普通技术人员能理解本文披露的各实施例。

Claims (10)

1.引物组，其特征在于，包括：
六妹羊肚菌的特异性引物对，其包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1～2所示的上、下游引物；七妹羊肚菌的特异性引物对，其包括核苷酸序列如SEQ ID NO.3～4所示的上、下游引物；梯棱羊肚菌的特异性引物对，其包括核苷酸序列如SEQ ID NO.5～6所示的上、下游引物。
2.一种羊肚菌种类快速准确鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)通过三个物种的比较基因组学筛选物种特异性序列，开发物种专一性引物；
2)通过ePCR筛选得到物种专一性引物；所述物种专一性引物如权利要求1中所示；
3)提取待测菌株总DNA作为PCR扩增模板；
4)分别以3对特异性引物对进行PCR扩增；
5)对获得的扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳方法进行鉴定，电泳结果显示哪对特异性引物对扩增出目的条带，说明待测菌株就是哪个物种，若有2对特异性引物对扩增出目的条带，则说明待测菌株是两个物种的杂交后代。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述3对特异性引物的获得通过比较基因组获得物种特异性序列，对特异性序列进行引物设计，并在六妹羊肚菌、七妹羊肚菌和梯棱羊肚菌群体中进行电子PCR得到物种专一性序列位点和引物。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述3对特异性引物所对应的物种特异性序列ID：D15A05、D01A03、D19A26，序列信息分别为SEQ ID NO.7～9所示。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述3对特异性引物的扩增体系相同，均采用10ul反应体系：10×buffer 1.0μL，dNTP 0.15μL，TaKaRa的rTaq酶0.15μL，F引物/R引物各0.5μL，20–50ng/ul的DNA模板0.6μL，ddH2O补足10.0ul；
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，六妹羊肚菌的特异性引物对D15A05F/R的PCR扩增程序为：95℃预变性3min；95℃变性20sec，63℃退火15sec，72℃延伸25sec，34个循环；72℃延伸5min；
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，七妹羊肚菌的特异性引物对D01A03F/R的PCR扩增程序为：95℃预变性3min；95℃变性20sec，62℃退火15sec，72℃延伸25sec，34个循环；72℃延伸5min；
8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，梯棱羊肚菌的特异性引物对D19A26F/R的PCR扩增程序为：95℃预变性3min；95℃变性20sec，62℃退火15sec，72℃延伸25sec，38个循环；72℃延伸5min；
9.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，对获得的扩增产物通过1.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定方法进行鉴定；
所述琼脂糖凝胶电泳鉴定方法为：PCR产物5μL+1μL 10x Loading Buffer，电压100V，时间20min，鉴定六妹羊肚菌的特征在于，特异性引物对D15A05F/R成功扩增，获得大小为687bp的唯一条带；鉴定七妹羊肚菌的特征在于，特异性引物对D01A03F/R成功扩增，获得大小为792bp的唯一条带；鉴定梯棱羊肚菌的特征在于，特异性引物对D19A26F/R成功扩增，获得大小为670bp的唯一条带；
10.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，对获得的扩增产物通过1.0％琼脂糖凝胶电泳检测方法进行六妹羊肚菌、七妹羊肚菌、梯棱羊肚菌种间杂交现象的检测；
所述琼脂糖凝胶电泳检测方法：PCR产物5μL+1μL 10x Loading Buffer，电压100V，时间20min，检测出两个物种发生杂交现象的特征在于，待测样品可同时被2对特异性引物对成功扩增，分别获得相应特异性引物对的唯一目的条带。
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