CN118086565A - 一种用于鉴别云柠1号柠檬品种的InDel分子标记的开发和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于鉴别云柠1号柠檬品种的InDel分子标记的开发和应用，属于分子标记技术领域。本发明提供了一条用于鉴别云柠1号柠檬品种的InDel基因片段，所述InDel基因片段的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明还提供了所述InDel基因片段的筛选方法，并开发了一套简单、快捷且共显性的PCR标记以及引物对，并构建了鉴别方法。本发明通过引物对进行PCR扩增，云柠1号的产物为一个647bp的长条带与一个442bp的短条带，其它柠檬的产物为一个442bp的短条带。本发明可以直接从胶图上判断各材料的基因型，从而在幼苗期快速鉴定柠檬品种是否为云柠1号，克服了传统表型鉴定费时费力且准确率不高的缺点。
Description
技术领域
本发明属于分子标记技术领域，具体涉及一种用于鉴别云柠1号柠檬品种的InDel分子标记的开发和应用。
背景技术
柠檬是酸橙和枸橼的杂交后代。在中国，柠檬主要在云南、四川等热带和亚热带山区被广泛栽植，是热带和亚热带人民的重要经济作物之一。
云柠1号柠檬是从尤力克柠檬中筛选得到的优良柠檬株系，具有遗传性状稳定、早结、优质、丰产、抗性强等特点，是云南柠檬产区的主导品种。目前，生产上推广使用的柠檬品种较多，而不同品种具有不同的最佳适种区，错误引种栽植会导致产量锐减甚至绝收。其次，在种苗生产上，种苗生产企业的接穗品种来源方式多样，非正规引种方式在种苗生产中还占有一定的比例，这给种植企业与农户带来了严重的生产经营隐患。目前常采用形态学标记的方法初步鉴定种苗，但由于形态学受环境影响较大，导致其应用仅限于遗传背景差异较大的品种，对于遗传背景差异较小的不同柠檬品种，形态学标记并不能对它们进行有效区分。因此，生产上急需一种能快速鉴别云柠1号优良柠檬种苗的手段。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于鉴别云柠1号柠檬品种的InDel分子标记的开发和应用，可以在早期快速鉴定遗传背景差异较小的不同柠檬品种。
本发明提供了一条用于鉴别云柠1号柠檬的InDel基因片段，所述InDel基因片段的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
本发明还提供了上述InDel基因片段的筛选方法，包括以下步骤：
(1)将若干份已发表的柠檬品种的重测序数据与柑橘基因组数据库和云柠1号柠檬品种的重测序数据进行搜集、整合；
(2)将所述各柠檬品种的重测序数据分别比对到甜橙参考基因组，使用BWA软件进行数据比对，使用GATK软件进行群体基因型鉴定，分析出相对于甜橙参考基因组的各柠檬品种的变异信息，获得不同柠檬品种基因组上的差异位点；
(3)使用iGV软件将所述差异位点可视化，筛选获得云柠1号相对其它柠檬特有的205bp的杂合插入片段。
优选的，步骤(1)所述已发表的柠檬品种的重测序数据的来源包括尤力克柠檬、北京柠檬、墨西哥莱檬和无酸柠檬的重测序数据。
优选的，所述参考基因组版本为SWO.v2.0.genome.fa(http://citrus.hzau.edu.cn/data/Genome_info/SWO.v2.0/SWO.v2.0.genome.fa)。
本发明还提供了检测上述InDel基因片段的引物对，包括核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID No.3所示的反向引物。
本发明还提供了上述InDel基因片段或上述引物对在鉴别云柠1号柠檬或制备鉴别云柠1号柠檬的试剂盒中的应用。
本发明还提供了一种鉴别云柠1号柠檬的方法，包括以下步骤：提取待测柠檬的基因组DNA，与上述引物对混合配制PCR扩增体系，经PCR扩增后根据扩增产物的琼脂糖凝胶条带判断待测柠檬品种是否为云柠1号；
当琼脂糖凝胶上显示一条647bp和一条442bp的条带时，所述待测柠檬品种为云柠1号。
优选的，所述PCR扩增体系以20μL计，包括：7μLPCRMix，100ng基因组DNA，正向引物1μM，反向引物1μM和余量的ddH2O。
优选的，所述PCR扩增的程序，包括：98℃预变性3min；98℃变性10sec，55℃退火20sec，72℃延伸30sec，35个循环；72℃再延伸5min，12℃保存。
优选的，所述647bp的条带的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，442bp的条带的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。
优选的，当琼脂糖凝胶上只显示一条442bp的条带时，所述待测柠檬品种为其它品种；
所述442bp的条带的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。
有益效果：本发明提供了一条用于鉴别云柠1号柠檬的InDel基因片段，所述InDel基因片段的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明通过将云柠1号与其它柠檬品种进行重测序数据分析，并经过甜橙参考基因组的比对，筛选得到一条云柠1号柠檬特有的205bp的杂合插入。本发明将筛选得到的所述InDel基因片段开发为分子标记，在所述InDel基因片段的上游处设计正向引物，下游设计反向引物，组成引物对。
本发明还基于所述引物对构建了鉴别云柠1号柠檬的方法，经PCR扩增后，云柠1号的产物为一个647bp的长条带与一个442bp的短条带，其它柠檬的产物为一个442bp的短条带。本发明所述鉴别方法，可以直接从胶图上判断各个材料该位点的基因型，从而在幼苗期快速鉴定柠檬产区的柠檬品种是否为云柠1号，便于种植企业和农户精确选择云柠1号进行种植，利于柠檬市场打假，降低柠檬种植企业和农户的投资风险，对促进柠檬产业发展和乡村振兴具有重要意义。本发明所述鉴别的方法同时还克服了传统表型鉴定时准确率不高的缺点。
附图说明
图1为云柠1号柠檬与其它柠檬序列差异对比结果图；
图2为云柠1号柠檬与其它柠檬的形态比较结果图，图中1～6：云柠1号柠檬、尤力克柠檬、粗柠檬、北京柠檬、墨西哥莱檬和无酸柠檬；
图3为引物对在云柠1号柠檬以及其它柠檬扩增结果图，图中1～6：云柠1号柠檬、尤力克柠檬、粗柠檬、北京柠檬、墨西哥莱檬和无酸柠檬。
具体实施方式
本发明提供了一条用于鉴别云柠1号柠檬的InDel基因片段，所述InDel基因片段的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示：CACTAATGCTACACATTTTAAAATTTTTATTTTAAAAAATTATCTTAAATAATGTGTCATTAATTGAGTGGTTGATAATTATTTACAATATCTAAATGAATTAATTATATTATCTCACCAACCAATTGATAAATACCATATTATTTGAGATAATTTTTTAAGATAAAAAATTTAGGATGTGTATCATTATTATTAGTCAGTTTAT。
本发明通过生物信息学的方法，将云柠1号与尤力克柠檬、粗柠檬、北京柠檬、墨西哥莱檬和无酸柠檬的重测序数据分别比对到甜橙参考基因组后，发现云柠1号相对其它5份柠檬特有的InDel变异作为候选位点进行分子标记开发，即在云柠1号相对其它柠檬有一个205bp的杂合插入。
本发明还提供了上述InDel基因片段的筛选方法，包括以下步骤：
(1)将若干份已发表的柠檬品种的重测序数据与柑橘基因组数据库和云柠1号柠檬品种的重测序数据进行搜集、整合；
(2)将所述各柠檬品种的重测序数据比对到甜橙参考基因组，所述参考基因组版本为SWO.v2.0.genome.fa(http://citrus.hzau.edu.cn/data/Genome_info/SWO.v2.0/SWO.v2.0.genome.fa)，使用BWA软件进行数据比对，使用GATK软件进行群体基因型鉴定，分析出相对于甜橙参考基因组的各柠檬品种的变异信息，获得不同柠檬品种基因组上的差异位点；
(3)使用iGV软件将所述差异位点可视化，筛选获得云柠1号相对其它柠檬特有的205bp的杂合插入片段。
本发明所述已发表的柠檬品种的重测序数据的来源，优选包括尤力克柠檬、北京柠檬、墨西哥莱檬和无酸柠檬的重测序数据。本发明通过下载已发表的四份代表性柠檬品种的重测序数据，并整合果蔬园艺作物种质创新与利用全国重点实验室构建的柑橘基因组数据库(http://citrus.hzau.edu.cn/index.php)和云南省农业科学院热带亚热带经济作物研究所完成的云柠1号柠檬品种和粗柠檬的重测序数据。
本发明优选利用BWA软件将上述6份材料的测序reads分别比对到高质量的甜橙参考基因组(http://citrus.hzau.edu.cn/data/Genome_info/SWO.v2.0/SWO.v2.0.genome.fa)，得到6份材料相对甜橙参考基因组的变异信息，获得不同柠檬品种基因组上差异的SNP、InDel和SVs位点。
本发明利用iGV软件将上述变异信息进行可视化，最终筛选云柠1号相对其它5份柠檬特有的InDel变异作为候选位点进行分子标记开发，发现云柠1号相对其它柠檬有一个205bp的杂合插入，且该插入序列如SEQ ID No.1所示。
本发明还提供了检测上述InDel基因片段的引物对，包括核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示的正向引物和SEQ ID No.3所示的反向引物。
本发明优选根据基因组的序列，在上述InDel基因片段的上游处设计正向引物(SEQ ID No.2：CGGTCTTACGTTAAATCGTCG)，下游设计反向引物(SEQ ID No.3：GAGGGGAATGTCGCTGTC)。本发明所述引物对优选委托天一公司进行合成。
本发明还提供了上述InDel基因片段或上述引物对在制备鉴别云柠1号柠檬的试剂盒中的应用。
在本发明中，根据所述InDel基因片段，将所述InDel序列开发为PCR标记，云柠1号的产物为一个647bp的长条带与一个442bp的短条带，其它柠檬的产物为一个442bp的短条带，产物序列信息见序列信息。基于以上实验设计，可以直接从胶图上判断各个材料该位点的基因型。
本发明还提供了一种鉴别云柠1号柠檬的方法，包括以下步骤：提取待测柠檬的基因组DNA，与上述引物对混合配制PCR扩增体系，经PCR扩增后根据扩增产物的琼脂糖凝胶条带判断待测柠檬品种是否为云柠1号；
当琼脂糖凝胶上显示一条647bp和一条442bp的条带时，所述待测柠檬品种为云柠1号。
本发明对所述基因组DNA的提取方法并没有特殊限定，利用本领域的常规方法对植株成熟叶片进行DNA提取即可，如实施例中采用改良的CTAB法提取柠檬的基因组DNA。
本发明所述PCR扩增体系以20μL计，优选包括：7μL PCRMix(购于翌圣公司)，100ng基因组DNA，正向引物1μM，反向引物1μM和余量的ddH2O。本发明所述PCR扩增的程序，优选包括：98℃预变性3min；98℃变性10sec，55℃退火20sec，72℃延伸30sec，35个循环；72℃再延伸5min，12℃保存。
本发明所述扩增产物在北京市六一电泳仪水平电泳槽上，利用2.0％琼脂糖凝胶电泳检测，使用1×TAE缓冲液(0.04M Tris-acetate，0.001M EDTA，pH 8.0)，电压8V/cm，电泳30min。电泳完毕，使用BIO-RAD凝胶成像系统(UVP)拍照保存，扩增结果为647bp、442bp两条带型的为云柠1号，只有442bp单条带型的为其它柠檬
本发明所述647bp的条带的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示：CGGTCTTACGTTAAATCGTCGACACGCAGCGCAACACATTCAAGTGAACCCCTTTTTGTCTTTCTATCATAATAAAAATGGGCCACCAACTCCCGGAATACGCAAACTCACGCACCGAATGGACTGCCCATCAACATCATCTCAATTACGCCATCCCCGGTTCCAAATATTATCATCATCCAGCAACGCCCACGTTGGTAATTACAAAAAAGTTTATTTTTTTTAATACTGATTTTTAGTTTCCTTACTGCCTAAATATCTGTGGAATCATTGGTATTAATTATGCCCATTCGACGTAAAAGTTGTTGTCACCGACGGCGGTGAGTACTTTCGCTCGGGACTTCCGAGATATATATATTGCTTGTACTCTCAATTAGTTTATCACTAATGCTACACATTTTAAAATTTTTATTTTAAAAAATTATCTTAAATAATGTGTCATTAATTGAGTGGTTGATAATTATTTACAATATCTAAATGAATTAATTATATTATCTCACCAACCAATTGATAAATACCATATTATTTGAGATAATTTTTTAAGATAAAAAATTTAGGATGTGTATCATTATTATTAGTCAGTTTATATGTGCCGCGAAGATAACGACGTTCGCCTGCACTCCCACAAAGACAGCGACATTCCCCTC。在本发明中，云柠1号和其它品种的柠檬，经扩增后产生的442bp的条带的核苷酸序列相同，均如SEQ ID No.5所示：CGGTCTTACGTTAAATCGTCGACACGCAGCGCAACACATTCAAGTGAACCCCTTTTTGTCTTTCTATCATAATAAAAATGGGCCACCAACTCCCGGAATACGCAAACTCACGCACCGAATGGACTGCCCATCAACATCATCTCAATTACGCCATCCCCGGTTCCAAATATTATCATCATCCAGCAACGCCCACGTTGGTAATTACAAAAAAGTTTATTTTTTTTAATACTGATTTTTAGTTTCCTTACTGCCTAAATATCTGTGGAATCATTGGTATTAATTATGCCCATTCGACGTAAAAGTTGTTGTCACCGACGGCGGTGAGTACTTTCGCTCGGGACTTCCGAGATATATATATTGCTTGTACTCTCAATTAGTTTATATGTGCCGCGAAGATAACGACGTTCGCCTGCACTCCCACAAAGACAGCGACATTCCCCTC。
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种于鉴别云柠1号柠檬的InDel分子标记的开发和应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
1、首先，下载已发表的四份代表性柠檬品种的重测序数据(北京柠檬：https://sra-pub-run-odp.s3.amazonaws.com/sra/SRR17035887/SRR17035887；无酸柠檬：https://sra-pub-run-odp.s3.amazonaws.com/sra/SRR17035885/SRR17035885；墨西哥莱蒙：https://sra-pub-run-odp.s3.amazonaws.com/sra/SRR3948350/SRR3948350；尤力克柠檬：https://sra-downloadb.be-md.ncbi.nlm.nih.gov/sos5/sra-pub-zq-11/SRR003/952/SRR3952134/SRR3952134.sralite.1)，并整合果蔬园艺作物种质创新与利用全国重点实验室构建的柑橘基因组数据库(http://citrus.hzau.edu.cn/inde x.php)和云南省农业科学院热带亚热带经济作物研究所完成的云柠1号柠檬品种和粗柠檬的重测序数据(粗柠檬与云柠1号：https://doi.org/10.6084/m9.figshare.25304563.v1)。
2、用BWA软件将6份材料的测序reads分别比对到高质量的甜橙参考基因组(http://citrus.hzau.edu.cn/data/Genome_info/SWO.v2.0/SWO.v2.0.genome.fa)，得到6份材料相对甜橙参考基因组的变异信息，获得不同柠檬品种基因组上差异的SNP、InDel和SVs位点。
3、利用IGV软件将这些变异信息进行可视化，最终筛选云柠1号相对其它5份柠檬特有的InDel变异作为候选位点进行分子标记开发。发现云柠1号相对其它柠檬有一个205bp的杂合插入(附图1)。
4、根据以上变异信息，将SEQ ID No.1所示的InDel序列开发为PCR标记：根据基因组的序列，在该InDel上游处设计正向引物(SEQ ID No.2)，下游设计反向引物(SEQ IDNo.3)。
实施例2
云柠1号与其它柠檬的鉴定
1、采用改良的CTAB法提取云柠1号柠檬、尤力克柠檬、粗柠檬、北京柠檬、墨西哥莱檬、无酸柠檬的基因组DNA，云柠1号柠檬与5份代表性柠檬叶形态如图2所示。
2、利用实施例1中设计的SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示的引物对，分析上述所有柠檬的基因组DNA。
PCR反应体系如下：7μL PCRMix(购于翌圣公司)，100ng DNA，正、反向引物(合成于天一公司)各1μM，ddH2O补充至终体积20μL。
热循环参数为：98℃3min；98℃10sec，55℃20sec，72℃30sec，35个循环；72℃5min，12℃保存，反应是在BIOCENER仪上完成。
扩增产物在北京市六一电泳仪水平电泳槽上2.0％琼脂糖凝胶电泳检测，使用1xTAE缓冲液(0.04M Tris-acetate，0.001M EDTA，pH 8.0)，电压8V/cm，电泳30min。电泳完毕，使用BIO-RAD凝胶成像系统(UVP)拍照保存。
结果如图3所示，引物对在云柠1号和其它柠檬的基因组DNA中进行扩增，扩增结果为647bp、442bp两条带型的为云柠1号，只有442bp单条带型的为其它柠檬。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其它实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (10)
1.一条用于鉴别云柠1号柠檬品种的InDel基因片段，其特征在于，所述InDel基因片段的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.权利要求1所述InDel基因片段的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将若干份已发表的柠檬品种的重测序数据与柑橘基因组数据库和云柠1号柠檬品种的重测序数据进行搜集、整合；
(2)将所述各柠檬品种的重测序数据分别比对到甜橙参考基因组，使用BWA软件进行数据比对，使用GATK软件进行群体基因型鉴定，分析出相对于甜橙参考基因组的各柠檬品种的变异信息，获得不同柠檬品种基因组上的差异位点；
(3)使用iGV软件将所述差异位点可视化，筛选获得云柠1号相对于其它柠檬而言特有的205bp的杂合插入片段。
3.根据权利要求2所述筛选方法，其特征在于，步骤(1)所述已发表的柠檬品种的重测序数据包括源于尤力克柠檬、北京柠檬、墨西哥莱檬和无酸柠檬的重测序数据。
4.检测权利要求1所述InDel基因片段的引物对，其特征在于，包括核苷酸序列如SEQID No.2所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID No.3所示的反向引物。
5.权利要求1所述InDel基因片段或权利要求4所述引物对在鉴别云柠1号柠檬或制备鉴别云柠1号柠檬的试剂盒中的应用。
6.一种鉴别云柠1号柠檬的方法，其特征在于，包括以下步骤：提取待测柠檬的基因组DNA，与权利要求4所述引物对混合配制PCR扩增体系，经PCR扩增后根据扩增产物的琼脂糖凝胶条带判断待测柠檬品种是否为云柠1号；
当琼脂糖凝胶上显示一条647bp和一条442bp的条带时，所述待测柠檬品种为云柠1号。
7.根据权利要求6所述方法，其特征在于，所述PCR扩增体系以20μL计，包括：7μL PCRMix，100ng基因组DNA，正向引物1μM，反向引物1μM和余量的ddH2O。
8.根据权利要求6或7所述方法，其特征在于，所述PCR扩增的程序，包括：98℃预变性3min；98℃变性10sec，55℃退火20sec，72℃延伸30sec，35个循环；72℃再延伸5min。
9.根据权利要求6所述方法，其特征在于，所述647bp的条带的核苷酸序列如SEQ IDNo.4所示，442bp的条带的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。
10.根据权利要求6所述方法，其特征在于，当琼脂糖凝胶上只显示一条442bp的条带时，所述待测柠檬品种为其它品种；
所述442bp的条带的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。
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2024
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 吴骏平;杨建军;官泉明;邹宝印;章申;余珍;周国振;朱博;: "柑桔育种研究概述", 现代园艺, no. 11, 10 June 2019 (2019-06-10) * |
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