CN113215220A - 一种基于转录组测序的橄榄ssr分子标记开发方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于转录组测序的橄榄SSR分子标记开发方法，属于分子生物学技术领域。本方法步骤包括转录组测序、转录组SSR位点鉴别与引物设计、SSR‑PCR反应体系优化、SSR‑PCR反应体系稳定性验证、SSR‑PCR扩增与有效性检测。本发明通过对不同发育时期的橄榄果实测序获得的转录组数据，通过生物信息学分析软件进行SSR位点鉴别与引物设计，开发橄榄SSR分子标记引物，开发效率高，填补了目前橄榄SSR分子标记稀缺的空白。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种基于转录组测序的橄榄SSR分子标记开发方法。
背景技术
橄榄[Cauarium album（Lour.）Raeusch]，橄榄科（Burseraceae）橄榄属（Cauarium），是我国南方特有果树之一，栽培历史悠久，为药食同源果树。现有的种质资源主要通过引种、实生优良单株、芽变株系中选育，遗传背景模糊，且命名不规范，传统的形态学无法快速有效地进行鉴定和分类，给种质资源保存、应用及育种工作带来很多不便。简单序列重复（SSR）是一类由1~6个碱基组成的基元串联重复而成的DNA序列，SSR分子标记的开发途径分为基于基因组开发的SSR和基于表达序列开发的SSR（EST-SSR）。橄榄的全基因组信息还未知，且成本高；EST-SSR标记不仅标记多态性高、共显性、重复性好，且由于EST-SSR来源于表达的基因组区域，能直接反映相关基因多样性，同时在不同物种间具有良好的通用性；目前，关于橄榄EST-SSR引物的大批量开发还属空白，因此本发明对于进行橄榄种质资源鉴定及遗传背景分析提供了一个快速有效的方法，同时对于橄榄SSR分子标记缺乏的实际问题解决意义重大。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，发明提供一种基于转录组测序的橄榄SSR分子标记开发方法，为后续利用SSR分子标记进行橄榄种质资源鉴定、橄榄遗传多样性研究提供可靠的技术手段。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种基于转录组测序的橄榄SSR分子标记开发方法，包括如下步骤：
（1）通过二代和三代转录组测序，将测序结果进行过滤和从头组装后获得转录组数据；
（2）从转录组数据进行SSR位点鉴别；
（3）根据SSR位点鉴别信息进行引物设计；
（4）引物反应体系筛选；
（5）引物有效性鉴定。
上述步骤（1）转录组测序转录组测序样本为‘长营’不同发育时期果实。
上述步骤（2）转录组SSR位点鉴别为：使用软件 MISA对转录组的所有 Isoform进行搜索，寻找 Isoform中的 SSR位点；；SSR分子标记筛选参数：两个SSR序列的距离短于100bp，当做一个SSR标记，寻找 Isoform中的 SSR位点，搜索标准为含有二、三、四、五、六个核苷酸重复，最小重复数依次为6、5、4、4、4。
上述步骤（3）中SSR引物设计方法为：根据找到的SSR信息利用NCBI Primer-BLAST及DNAMAN在SSR序列两侧进行引物设计；预计引物扩增长度100~280 bp，引物长度18~27bp，GC含量在40%~60%之间；退火温度（Tm）设置在57~63℃，上下游引物Tm值相差不大于2℃，避免引物二级结构如二聚体、错配、发卡结构的出现。
上述步骤（4）引物反应体系筛选为：应用L9（33）正交设计，对2×Taq PCR MasterMixⅡ体积、引物体积、DNA模板含量进行3因素3水平正交实验筛选反应体系；筛选所得反应体系为：2×Taq PCR Master MixⅡ10 μL，引物浓度0.5 μL，模板DNA含量9 ng，ddH2O补足至20 μL；反应程序为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，56℃退火45 s，72℃延伸90 s，循环35次；72℃延伸90 s，4℃保存。
上述步骤（5）引物有效性鉴定为：引物合成后，筛选上下游引物退火温度无差异引物进行PCR扩增，扩增产物在2%的TAE琼脂糖凝胶电泳中进行有效性筛选。
上述一种基于转录组测序的橄榄SSR分子标记开发方法，筛选、鉴定获得26对橄榄SSR分子标记有效性引物；具体引物序列如表1所示：
表1 26对橄榄SSR分子标记有效性引物
有益效果在于：
1. 本发明基于转录组数据开发的SSR分子标记引物，效益高、挖掘的位点多、信息全面，且近缘物质间具有高度的可转移性和通用性。
2. 本发明能进行大批量的SSR分子标记引物开发，相较于传统方式的开发更加便利、高效。
附图说明：
图1 SSR-PCR反应体系的正交设计优化扩增电泳图。
图2 SSR-PCR反应体系稳定性验证。图中1~4分别为东山长穗、青皮长营、甜榄、梅埔2号； a~c分别为编号为13、23、24的引物。
图3 48对引物有效性筛选的PCR扩增电泳图。图中编号1~26为筛选的有效引物。
具体实施方式
为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明。
转录组测序
转录组测序样本为橄榄果实，采样时间2018年7月至11月，分别为花后20 d、40 d、70 d、110 d，品种为‘长营’，果实采后迅速放入液氮速冻，后送至广东（广州）基迪奥生物科技有限公司进行转录组测序，每个时期重复3次，共12个文库，作为分析数据。测序结果进行过滤和从头组装后获得转录组数据。
转录组SSR位点鉴别
使用软件 MISA（http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/）对转录组的所有Isoform进行搜索，寻找Isoform中的SSR位点。如果两个SSR序列的距离短于100 bp，当做一个SSR标记。寻找Isoform中的 SSR位点，搜索标准为含有二、三、四、五、六个核苷酸重复，最小重复数依次为6、5、4、4、4。
表2 橄榄转录组SSR序列分布特征
表3 转录组SSR序列长度分布
3. SSR引物设计
根据找到的SSR信息利用NCBI Primer-BLAST及DNAMAN在SSR序列两侧进行引物设计。预计引物扩增长度100~280 bp，引物长度18~27 bp，GC含量在40%~60%之间；退火温度（Tm）设置在57~63℃，上下游引物Tm值相差不大于2℃，尽量避免引物二级结构如二聚体、错配、发卡结构的出现。从所设计的SSR引物中随机筛选100对引物，交由福州尚亚生物技术有限公司合成。
反应体系优化
以‘自来圆’橄榄叶片DNA提取样为模板，使用试剂盒完成样品基因组DNA提取，引物模板编号为21（F：5’-TAGAAAAACGAACCCGGATG-3’，R：5’-TTGCCCTTTTAACTGATGGG-3’），应用L9（33）正交设计，对2×Taq PCR Master MixⅡ含量、引物体积（浓度10 μM）、DNA模板含量进行3个因素3水平正交实验（表3），共9个组合，反应体系为20 μL，具体各因素水平及9个处理的实验组合见表4。PCR扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳进行筛选。结果见图1。筛选最佳反应体系为：2×Taq PCR Master MixⅡ10 μL，引物浓度0.5 μL，模板DNA含量9 ng，ddH2O补足至20 μL。
表4 SSR-PCR 反应体系正交设计因素水平
表5 SSR-PCR反应体系正交试验L9（33）
5. SSR-PCR扩增反应程序
PCR扩增反应在S1000TM Thermal Cycler 96孔型的PCR仪进行，反应程序设置为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，56℃退火45 s，72℃延伸90 s，循环35次；72℃延伸90 s，4℃保存。
反应体系稳定性验证
根据正交结果筛选的最佳SSR反应体系，分别以东山长穗、青皮长营、甜榄、梅埔2号橄榄样本，使用试剂盒完成样品基因组DNA提取，随机选取的引物（引物编号13、23、24）进行PCR扩增，检测筛选的SSR-PCR最佳反应体系的稳定性。结果见图2，结果表明：四个品种（系）的扩增条带清晰，且与预期扩增片段长度一致，说明筛选的最佳反应体系稳定性好。
引物有效性检测
从所设计的SSR引物中随机筛选100对引物，交由福州尚亚生物技术有限公司合成，合成后筛选上下游引物退火温度无差异的引物（48对），以甜榄基因组DNA为模板，进行PCR扩增，扩增产物选用2wt% Tris-Acetic acid-EDTA（TAE）琼脂糖凝胶电泳进行检测，电泳上样量3 μL，电泳缓冲液为1×TAE，电压75 V，电泳时间60 min，电泳结果后用凝胶成像仪扫描记录，筛选与预期目标片段大小一致的有效引物，以扩增产物条带清晰度高、无杂带、无背景作为引物筛选标准，48对引物的扩增图见图4，最后筛选到26对有效性引物，筛选到的具体引物序列见表6。
表6 筛选的26对橄榄SSR引物
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福建农林大学
<120> 一种基于转录组测序的橄榄SSR分子标记开发方法
<130> 52
<160> 52
<170> PatentIn version 3.3
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<211> 20
<212> DNA
<213> SEQ ID NO.33
<400> 33
gggctgttta tgttggcagt 20
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> SEQ ID NO.34
<400> 34
cacacagaat tgttcacccg 20
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> SEQ ID NO.35
<400> 35
tagaaaaacg aacccggatg 20
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> SEQ ID NO.36
<400> 36
ttgccctttt aactgatggg 20
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> SEQ ID NO.37
<400> 37
gcatttgcag tctccctgat 20
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> SEQ ID NO.38
<400> 38
ccaccaacat taaccaaggc 20
<210> 39
<211> 20
<212> DNA
<213> SEQ ID NO.39
<400> 39
ttggatcaac gtgcatgagt 20
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> SEQ ID NO.40
<400> 40
tgcattctcg acacaaccat 20
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> SEQ ID NO.41
<400> 41
tagaaaaacg aacccggatg 20
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213> SEQ ID NO.42
<400> 42
ttgccctttt aactgatggg 20
<210> 43
<211> 20
<212> DNA
<213> SEQ ID NO.43
<400> 43
ttggatcaac gtgcatgagt 20
<210> 44
<211> 20
<212> DNA
<213> SEQ ID NO.44
<400> 44
tgcattctcg acacaaccat 20
<210> 45
<211> 20
<212> DNA
<213> SEQ ID NO.45
<400> 45
tagaaaaacg aacccggatg 20
<210> 46
<211> 20
<212> DNA
<213> SEQ ID NO.46
<400> 46
ttgccctttt aactgatggg 20
<210> 47
<211> 20
<212> DNA
<213> SEQ ID NO.47
<400> 47
ttggatcaac gtgcatgagt 20
<210> 48
<211> 20
<212> DNA
<213> SEQ ID NO.48
<400> 48
tgcattctcg acacaaccat 20
<210> 49
<211> 20
<212> DNA
<213> SEQ ID NO.49
<400> 49
tagaaaaacg aacccggatg 20
<210> 50
<211> 20
<212> DNA
<213> SEQ ID NO.50
<400> 50
ttgccctttt aactgatggg 20
<210> 51
<211> 20
<212> DNA
<213> SEQ ID NO.51
<400> 51
tagaaaaacg aacccggatg 20
<210> 52
<211> 20
<212> DNA
<213> SEQ ID NO.52
<400> 52
ttgccctttt aactgatggg 20
Claims (7)
1.一种基于转录组测序的橄榄SSR分子标记开发方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）通过二代和三代转录组测序，将测序结果进行过滤和从头组装后获得转录组数据；
（2）从转录组数据进行SSR位点鉴别；
（3）根据SSR位点鉴别信息进行引物设计；
（4）引物反应体系筛选；
（5）引物有效性鉴定。
2.根据权利按要求1所述的一种基于转录组测序的橄榄SSR分子标记开发方法，其特征在于：步骤（1）转录组测序转录组测序样本为‘长营’不同发育时期果实。
3.根据权利按要求1所述的一种基于转录组测序的橄榄SSR分子标记开发方法，其特征在于：步骤（2）转录组SSR位点鉴别为：使用软件 MISA对转录组的所有 Isoform进行搜索，寻找 Isoform中的 SSR位点；SSR分子标记筛选参数：两个SSR序列的距离短于100 bp，当做一个SSR标记，寻找 Isoform中的 SSR位点，搜索标准为含有二、三、四、五、六个核苷酸重复，最小重复数依次为6、5、4、4、4。
4.根据权利按要求1所述的一种基于转录组测序的橄榄SSR分子标记开发方法，其特征在于：步骤（3）SSR引物设计方法为：根据找到的SSR信息利用NCBI Primer-BLAST及DNAMAN在SSR序列两侧进行引物设计；预计引物扩增长度100~280 bp，引物长度18~27 bp，GC含量在40%~60%之间；退火温度设置在57~63℃，上下游引物Tm值相差不大于2℃，避免引物二级结构如二聚体、错配、发卡结构的出现。
5.根据权利按要求1所述的一种基于转录组测序的橄榄SSR分子标记开发方法，其特征在于：步骤（4）引物反应体系筛选为：应用L9（33）正交设计，对2×Taq PCR Master MixⅡ体积、引物体积、DNA模板含量进行3因素3水平正交实验筛选反应体系；筛选所得反应体系为：2×Taq PCR Master MixⅡ10 μL，引物浓度0.5 μL，模板DNA含量9 ng，ddH2O补足至20 μL；反应程序为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，56℃退火45 s，72℃延伸90 s，循环35次；72℃延伸90 s，4℃保存。
6.根据权利按要求1所述的一种基于转录组测序的橄榄SSR分子标记开发方法，其特征在于：步骤（5）引物有效性鉴定为：引物合成后，筛选上下游引物退火温度无差异引物进行PCR扩增，扩增产物在2%的TAE琼脂糖凝胶电泳中进行有效性筛选。
7.根据权利按要求1所述的一种基于转录组测序的橄榄SSR分子标记开发方法，其特征在于：筛选、鉴定获得26对橄榄SSR分子标记有效性引物，具体引物序列如下：
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110603002.XA CN113215220A (zh) | 2021-05-31 | 2021-05-31 | 一种基于转录组测序的橄榄ssr分子标记开发方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110603002.XA CN113215220A (zh) | 2021-05-31 | 2021-05-31 | 一种基于转录组测序的橄榄ssr分子标记开发方法 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN113215220A true CN113215220A (zh) | 2021-08-06 |
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202110603002.XA Pending CN113215220A (zh) | 2021-05-31 | 2021-05-31 | 一种基于转录组测序的橄榄ssr分子标记开发方法 |
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| Country | Link |
|---|---|
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116516042A (zh) * | 2023-05-18 | 2023-08-01 | 河北省农林科学院经济作物研究所 | 一种与连翘种质资源鉴定相关的ssr分子标记及其对应引物与应用 |
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| CN103667275A (zh) * | 2013-12-13 | 2014-03-26 | 江西省林业科学院 | 油茶ssr分子标记 |
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-
2021
- 2021-05-31 CN CN202110603002.XA patent/CN113215220A/zh active Pending
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| CN116516042B (zh) * | 2023-05-18 | 2024-04-26 | 河北省农林科学院经济作物研究所 | 一种与连翘种质资源鉴定相关的ssr分子标记及其对应引物与应用 |
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