CN114540519B

CN114540519B - 用于鉴别大曲中解淀粉芽孢杆菌的引物、试剂盒及鉴别方法

Info

Publication number: CN114540519B
Application number: CN202210281844.2A
Authority: CN
Inventors: 罗爱民; 王颖; 吴茗花; 邱勇
Original assignee: Sichuan University
Current assignee: Sichuan University
Priority date: 2022-03-22
Filing date: 2022-03-22
Publication date: 2024-01-23
Anticipated expiration: 2042-03-22
Also published as: CN114540519A

Abstract

本发明属于白酒检测技术领域，公开了用于鉴别大曲中解淀粉芽孢杆菌的引物、试剂盒及鉴别方法。用于鉴别大曲中解淀粉芽孢杆菌的引物，为一对特异性ARMS引物：ARMS‑1F和ARMS‑1R，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2所示。本发明利用qPCR技术，建立了解淀粉芽孢杆菌的ARMS‑qPCR检测方法，实现区分大曲中解淀粉芽孢杆菌与其他近缘菌种，经特异性、检出限验证，表明利用本发明可快速、准确地进行鉴定，且相较于传统形态学、生理生化鉴定手段有误差大、效率低的缺点，该方法具体有操作简便、反应快速，能实现精准的定性鉴定。

Description

用于鉴别大曲中解淀粉芽孢杆菌的引物、试剂盒及鉴别方法

技术领域

本发明属于白酒检测技术领域，具体涉及用于鉴别大曲中解淀粉芽孢杆菌的引物、试剂盒及鉴别方法。

背景技术

四甲基吡嗪（Tetramethylpyrazine，TTMP）又名川芎嗪，属生物碱类，是一种含氮杂环化合物，广泛存在于食品原料、咖啡以及乳制品中，具有烘烤香气、甜香，是中国白酒中的重要香气化合物之一。近年来，很多文献报道了大曲中高产四甲基吡嗪菌株的筛选情况，常见的高产四甲基吡嗪的菌株有地衣芽孢杆菌、暹罗芽孢杆菌、蛋白水解芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌等。

芽孢杆菌是大曲中高产四甲基吡嗪的主要菌株。枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和萎缩芽孢杆菌等是近缘种。区分解淀粉芽孢杆菌与其他菌株，可以判断高产四甲基吡嗪的菌株在大曲中的生长情况。

传统的大曲中解淀粉芽孢杆菌的区分方法是微生物涂布平板法，需要提取大曲样品进行稀释涂布，待平板长出菌落通过形态学观察来判断种类，同时以生理生化实验辅助来辨别菌种，但芽孢杆菌近缘种在形态上难以区分，且生理生化实验复杂繁琐，导致该方法误差大且耗时。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

为解决背景技术中的问题，本发明的第一目的在于提供用于鉴别大曲中解淀粉芽孢杆菌的引物，该引物可以鉴别出大曲中解淀粉芽孢杆菌与其他近缘菌种。

本发明的第二目的在于提供用于鉴别大曲中解淀粉芽孢杆菌的试剂盒。

本发明的第三目的在于提供用于鉴别大曲中解淀粉芽孢杆菌的方法。能够快速、准确地鉴别出解淀粉芽孢杆菌与其他近缘菌种。

为达到上述目的，本发明采用的第一个技术方案为：

用于鉴别大曲中解淀粉芽孢杆菌的引物，为一对特异性ARMS引物：ARMS-1F和ARMS-1R，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2所示。

优选的，所述ARMS引物是使用PCR引物2-F和2-R扩增解淀粉芽孢杆菌后设计得到，所述2-F和2-R的碱基序列分别如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4所示。

本发明采用的第二个技术方案为：

用于鉴别大曲中解淀粉芽孢杆菌的试剂盒，包含第一个技术方案的用于鉴别大曲中解淀粉芽孢杆菌的引物。

本发明采用的第三个技术方案为：

用于鉴别大曲中解淀粉芽孢杆菌的方法，包含以下步骤：

提取待测菌株基因组DNA；

以待检测菌株基因组DNA为模板，利用权利要求1或2所述的用于鉴别大曲中解淀粉芽孢杆菌的引物进行实时荧光定量PCR方法进行定量分析，根据扩增循环数差值鉴别出大曲中解淀粉芽孢杆菌。

优选的，所述实时荧光定量PCR方法反应程序为：95℃预变性10 min；95℃变性10s，60℃退火30 s，75℃延伸45s，40个循环，在60℃收集荧光信号。

优选的，实时荧光定量PCR反应体系为：总体积20μL，包括qPCR Mix 10μ L，2.5 µmol/L、0.8μL的ARMS-1F引物，2.5 µmol/L、0.8μL的ARMS-1R 引物，待测菌株基因组DNA模板1μL，ddH₂O7.4uL。

优选的，所述待测菌株包含解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、嗜气芽孢杆菌、不动芽孢杆菌和人参芽孢杆菌。

与现有技术相比，本发明具有以下效益：

本发明针对解淀粉芽孢杆菌与其他近缘芽孢杆菌设计特异性ARMS引物，利用qPCR技术，建立了解淀粉芽孢杆菌的ARMS-qPCR检测方法，实现区分大曲中解淀粉芽孢杆菌与其他近缘菌种，经特异性、检出限验证，表明利用本发明可快速、准确地进行鉴定，且相较于传统形态学、生理生化鉴定手段有误差大、效率低的缺点，该方法具体有操作简便、反应快速，能实现精准的定性鉴定。

附图说明

图1是本发明解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的8对ARMS引物对的荧光扩增图；

图2是本发明特异性引物ARMS-1F和ARMS-1R对8种近缘芽孢杆菌的特异性荧光扩增图；

图3是本发明特异性引物ARMS-1F和ARMS-1R对解淀粉芽孢杆菌的检出限荧光扩增图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面结合具体实施方式并参照附图，对本发明进一步详细说明。应该理解，这些描述只是示例性的，而并非要限制本发明的范围。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本发明的概念。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

ARMS即突变扩增阻滞体系，其核心在于在引物的3’末端加入错配的碱基，使其与模板错配时不能够正常延伸。在设计特异性引物时，其他物种的DNA序列的一个3’末端碱基的错配并不能够有效阻滞扩增进行时，就可以在引物的近末端引入一个或两个人为的错配碱基以增强反应的特异性。引物3’末端最后一个碱基和待鉴别物种完全匹配，而不和其他物种匹配。待鉴别物种的片段被扩增出来而非目的物种的DNA不能扩增，从而达到鉴别的目的，该方法快速高效，在物种鉴定中有广泛应用。此外，突变扩增阻滞体系(ARMS)有开放性，可以与荧光定量PCR和微列阵等技术相结合从而具有更多的应用领域。

分子生物学检测方法因其能够实现核酸定性及定量检测，且操作简便快速，得到越来越广泛地运用。实时荧光定量PCR技术是一种基于DNA检测的定量、定性方法，具有快速、特异性强、灵敏度高、准确性高等特点，常被用于掺假鉴定。

本发明利用Ezup柱式细菌基因DNA抽提试剂盒提取待测样本基因组DNA；根据芽孢杆菌近缘种的文献选择一对引物进行PCR扩增；再通过扩增出的解淀粉碱基序列，以ARMS技术为指导设计特异性ARMS引物，利用实时荧光定量PCR鉴别目标菌株与其他近缘菌株和大曲中常见菌株。本发明将实时荧光定量PCR (Quantitative Real-time PCR，qPCR），技术与突变扩增阻滞体系（amplification refractory mutation system，ARMS）技术相结合的手段，建立了大曲中的解淀粉芽孢杆菌与其他近缘菌种的鉴别方法。

本发明提供的用于大曲中解淀粉芽孢杆菌的鉴别方法，包括以下步骤：

（1）利用Ezup柱式细菌基因DNA抽提试剂盒提取待测样本基因组DNA，共8种芽孢杆菌；

（2）建立实时荧光定量反应体系：总体积20μL，包括qPCR Mix 10μ L，上下游引物(2.5 µmol/L)各0.8μL，DNA模板1μL，ddH₂O7.4uL；

（3）建立实时荧光反应程序：95℃预变性10 min；95℃变性10 s，60℃退火30 s，75℃延伸45s，40个循环，在60℃收集荧光信号；

（4）所述实时荧光定量PCR方法实验设置：

特异性ARMS引物有效性验证：用解淀粉芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌验证8对ARMS引物的有效性。

特异性检测：选择特异性实验得到的有效引物，将解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、嗜气芽孢杆菌、不动芽孢杆菌和人参芽孢杆菌共8种芽孢杆菌的DNA为模板DNA进行qPCR实验。

检出限检测：将解淀粉芽孢杆菌的DNA模板浓度进行稀释，设置9组实验：模板DNA浓度分别为30ng/L、20 ng/L、10 ng/L、1 ng/L、0.1 ng/L、0.01 ng/L、0.001 ng/L、0.0001ng/L，空白对照以ddH₂O为模板，进行qPCR实验。

（5）所述实时荧光定量PCR方法判定标准为：

当目标菌株与非目标菌株的Ct值的差值＞4，说明该ARMS引物能够实现区分效果；当目标菌株与非目标菌株的Ct值的差值≤4，说明该ARMS引物不能区分。

为更好地理解本发明提供的技术方案，下述以多个具体实例分别说明应用本发明上述实施方式提供的用于鉴别大区中解淀粉芽孢杆菌的引物、鉴别方法，及性能测试。

本发明以下具体实例中，利用Primer Premier 5设计特异性ARMS引物，本发明所用的实时荧光定量PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

实施例1：设计ARMS引物

（1）采用引物2-F和2-R扩增解淀粉芽孢杆菌

引物核苷酸序列：

2-F：TCGGAAGGTGCGGCTGGATC（SEQ ID NO:3）

2-R：AAGGCATCCACCGTGCGCCC（SEQ ID NO:4）

扩增的解淀粉芽孢杆菌序列：

CTAGTAAGTTGTCTGCCAGATTACGGATATAAGACCTTGGGTCTTATAAACAGAACGTTCCCTGTCTTGTTTAGTTTTGAAGGATCATTCGATTCTTCGAGATAATGTTCTTTGAAAACTAGATAACAGAAGTAATTCACATTCAATTGTAATGCAAGATATCACGTAGTGATTCTTTTTAACGGTTAAGTTAGAAAGGGCGCACGGTGGATGCCTTA。（SEQ ID NO:5）

复制此序列进入National Center for Biotechnology Information(NCBI)官网得到更长的序列：

ACAGATGATTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTATCGGAAGGTGCGGCTGGATCACCTCCTTTCTAAGGATTTTAACGGAATATAAGACCTTGGGTCTTATAAACAGAACGTTCCCTGTCTTGTTTAGTTTTGAAGGATCATTCGATTCTTCGAGATGTTGTTCTTTGAAAACTAGATAACAGAAGTAATTCACATTCAATTGTAATGCAAGATATCACGTAGTGATTCTTTTTAACGGTTAAGTTAGAAAGGGCGCACGGTGGATGCCTTGGCACTAGGAGCCGATGAAGGACGGGACGAACACCGATATGCTTCGGGGAGCTGTAAGCAAGCTTTGATCCGGAGATTTCCGAATGGGGAAACCCACCACTCGTAATGGAGTGGTATCCATATCTGAATACATAGGATATGAGAAGGCAGACCCGGGGAACTGAAACA。（SEQID NO:6）

（2）利用上述序列通过Primer Premier 5设计8对ARMS引物，为方便后续描述，分别排序为~/>，每对引物对应的核苷酸序列如下：

ARMS-1F：AAGGATCATTCGATTCTTCGAG；（SEQ ID NO:1）

ARMS-1R：TGTTCGTCCCGTCCTTCAT。（SEQ ID NO:2）

ARMS-2F：AAGGATCATTCGATTCTTCGTG；（SEQ ID NO:7）

ARMS-2R：TGTTCGTCCCGTCCTTCAT。（SEQ ID NO:8）

ARMS-3F：AAGGATCATTCGATTCTTCCAG；（SEQ ID NO:9）

ARMS-3R：TGTTCGTCCCGTCCTTCAT。（SEQ ID NO:10）

ARMS-4F：AAGGATCATTCGATTCTTGGAG；（SEQ ID NO:11）

ARMS-4R：TGTTCGTCCCGTCCTTCAT。（SEQ ID NO:12）

ARMS-5F：TCGTCCCGTCCTTCATC；（SEQ ID NO:13）

ARMS-5R：TTCCTAGTAAGCTAAGAAGCTC。（SEQ ID NO:14）

ARMS-6F：TCGTCCCGTCCTTCATC；（SEQ ID NO:15）

ARMS-6R：TTCCTAGTAAGCTAAGAAGCAC。（SEQ ID NO:16）

ARMS-7F：TCGTCCCGTCCTTCATC；（SEQ ID NO:17）

ARMS-7R：TTCCTAGTAAGCTAAGAAGGTC。（SEQ ID NO:18）

ARMS-8F：TCGTCCCGTCCTTCATC；（SEQ ID NO:19）

ARMS-8R：TTCCTAGTAAGCTAAGAACCTC。（SEQ ID NO:20）

实施例2：菌株基因组DNA的提取

（1）菌株的液态培养：从瓷珠保藏管中接种8种菌株的瓷珠，在无菌条件下放入液态培养基中。

液态培养基：酵母膏5 g，蛋白胨10 g，氯化钠10 g，pH7.0-7.2，蒸馏水1L，121℃灭菌30 min。

（2）吸取1mL过夜的菌液，离心获得菌体后，采用Ezup柱式细菌基因DNA抽提试剂盒提取DNA，-20℃保存备用。

实验菌株包括：解淀粉芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌，蜡样芽孢杆菌，苏云金芽孢杆菌，嗜气芽孢杆菌，不动芽孢杆菌，人参芽孢杆菌。

实施例3：验证8对ARMS引物的有效性

（1）实时荧光定量PCR方法的建立：

总体积20μL，包括qPCR Mix 10μ L，上下游引物(2.5 µmol/L)各0.8μL， DNA模板1μL，ddH₂O7.4uL。DNA模板为提取的解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的DNA。

需要说明的是，由于，①大曲里面常见的产四甲基吡嗪的菌株主要是地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌等等；②申请人在前期从NCBI基因库里面对比碱基序列，发现仅枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌的碱基序列非常相似，是最难区分的；其他的菌株如地衣芽孢杆菌跟解淀粉芽孢杆菌的碱基序列差异比较大，比较好区分。因此，第一步验证引物有效性只需要对区分难度最大的枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌进行鉴别，在第一步只用枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌验证ARMS-1F和ARMS-1R的有效性，申请人在第二步特异性用8种菌全部验证，结果也证明是可行的。

（2）解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的反应程序：

95℃预变性10 min；95℃变性10 s，60℃退火30 s，75℃延伸45s，40个循环，在60℃收集荧光信号。

（3）结果判定：

如图1所示，A表示解淀粉芽孢杆菌，B表示枯草芽孢杆菌。可从图看出引物、引物、引物/>、引物/>有扩增，引物/>、引物/>、引物/>、引物/>未扩增。

解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的8对ARMS引物对的Ct值如表1所示。

表1

由表1可知，解淀粉芽孢杆菌与枯草芽孢杆菌引物ARMS-1F和ARMS-1R（A-，B-/>）的Ct值相差远＞4，且该对引物扩增出基因的循环较少，耗时短，可以作为区分解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的特异性引物，因此可以说明ARMS-1F和ARMS-1R这对引物的有效性，选择采用这对特异性ARMS引物继续做后续实验。

实施例4：实时荧光定量PCR方法的对8种菌的特异性检测

（1）解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、嗜气芽孢杆菌、不动芽孢杆菌和人参芽孢杆菌的DNA，以不同菌株DNA作为模板，进行实时荧光定量PCR反应。

（2）实时荧光定量PCR方法的建立和反应程序同实施例3。

（3）结果判定：

如图2和表2所示，解淀粉芽孢杆菌检测的Ct值与其他菌株的Ct值相比Ct差值远＞4。说明ARMS-1F和ARMS-1R这对特异性ARMS引物可以有效的区分解淀粉芽孢杆菌与其他菌株，具有特异性。

表2 特异性引物ARMS-1F和ARMS-1R对8种近缘芽孢杆菌的Ct值

实施例5：实时荧光定量PCR方法的检出限检测

（1）实时荧光定量PCR方法的建立和反应程序同实施例3。其中将解淀粉芽孢杆菌的DNA模板浓度进行稀释，设置9组实验：30ng/L，20 ng/L，10 ng/L，1 ng/L，0.1 ng/L，0.01ng/L，0.001 ng/L，0.0001 ng/L，空白对照以ddH₂O为模板。

（2）结果判定：

如图3和表3所示，0.01 ng/L、0.001 ng/L和0.0001 ng/L的Ct值与空白的Ct值相近，因此本方法可以检出0.01 ng/L的菌浓度。

表3 特异性引物ARMS-1F和ARMS-1R对解淀粉芽孢杆菌检出限的Ct值

从以上实施例可以看出，采用传统方法从菌落形态、菌体显微观察和生理生化实验上区分解淀粉芽孢杆菌与其近缘菌株，且耗时长久，实验繁琐，误差较大。本发明建立的ARMS技术与实时荧光PCR检测方法，所需设备简单，结果明确快速。表明该方法可运用于区分大曲中解淀粉芽孢杆菌的鉴别方法。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

<110>四川大学

<120>用于鉴别大曲中解淀粉芽孢杆菌的引物、试剂盒及鉴别方法

<160> 20

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 1

AAGGATCATT CGATTCTTCG AG 22

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 2

TGTTCGTCCC GTCCTTCAT 19

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 3

TCGGAAGGTG CGGCTGGATC 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 4

AAGGCATCCA CCGTGCGCCC 20

<210> 5

<211> 218

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 5

CTAGTAAGTT GTCTGCCAGA TTACGGATAT AAGACCTTGG GTCTTATAAA 50

CAGAACGTTC CCTGTCTTGT TTAGTTTTGA AGGATCATTC GATTCTTCGA 100

GATAATGTTC TTTGAAAACT AGATAACAGA AGTAATTCAC ATTCAATTGT 150

AATGCAAGAT ATCACGTAGT GATTCTTTTT AACGGTTAAG TTAGAAAGGG 200

CGCACGGTGG ATGCCTTA 218

<210> 6

<211>443

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 6

ACAGATGATT GGGGTGAAGT CGTAACAAGG TAGCCGTATC GGAAGGTGCG 50

GCTGGATCAC CTCCTTTCTA AGGATTTTAA CGGAATATAA GACCTTGGGT 100

CTTATAAACA GAACGTTCCC TGTCTTGTTT AGTTTTGAAG GATCATTCGA 150

TTCTTCGAGA TGTTGTTCTT TGAAAACTAG ATAACAGAAG TAATTCACAT 200

TCAATTGTAA TGCAAGATAT CACGTAGTGA TTCTTTTTAA CGGTTAAGTT 250

AGAAAGGGCG CACGGTGGAT GCCTTGGCAC TAGGAGCCGA TGAAGGACGG 300

GACGAACACC GATATGCTTC GGGGAGCTGT AAGCAAGCTT TGATCCGGAG 350

ATTTCCGAAT GGGGAAACCC ACCACTCGTA ATGGAGTGGT ATCCATATCT 400

GAATACATAG GATATGAGAA GGCAGACCCG GGGAACTGAA ACA 443

<210>7

<211>22

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 7

AAGGATCATT CGATTCTTCG TG 22

<210>8

<211>19

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 8

TGTTCGTCCC GTCCTTCAT 19

<210>9

<211>22

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 9

AAGGATCATT CGATTCTTCC AG 22

<210>10

<211>19

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 10

TGTTCGTCCC GTCCTTCAT 19

<210>11

<211>22

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 11

AAGGATCATT CGATTCTTGG AG 22

<210>12

<211>19

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 12

TGTTCGTCCC GTCCTTCAT 19

<210>13

<211>17

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 13

TCGTCCCGTC CTTCATC 17

<210>14

<211>22

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 14

TTCCTAGTAA GCTAAGAAGC TC 22

<210>15

<211>17

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 15

TCGTCCCGTC CTTCATC 17

<210>16

<211>22

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 16

TTCCTAGTAA GCTAAGAAGC AC 22

<210>17

<211>17

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 17

TCGTCCCGTC CTTCATC 17

<210>18

<211>22

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 18

TTCCTAGTAA GCTAAGAAGG TC 22

<210>19

<211>17

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 19

TCGTCCCGTC CTTCATC 17

<210>20

<211>22

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 20

TTCCTAGTAA GCTAAGAACC TC 22

Claims

1.用于鉴别大曲中解淀粉芽孢杆菌的引物，其特征在于，为一对特异性ARMS引物：ARMS-2F和ARMS-2R，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8所示。

2.如权利要求1所述的用于鉴别大曲中解淀粉芽孢杆菌的引物，其特征在于，所述ARMS引物是使用PCR引物2-F和2-R扩增解淀粉芽孢杆菌后设计得到，所述2-F和2-R的碱基序列分别如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4所示。

3.用于鉴别大曲中解淀粉芽孢杆菌的试剂盒，其特征在于，包含如权利要求1或2所述的用于鉴别大曲中解淀粉芽孢杆菌的引物。

4.用于鉴别大曲中解淀粉芽孢杆菌的方法，其特征在于，包含以下步骤：

提取待测菌株基因组DNA；

以待检测菌株基因组DNA为模板，利用权利要求1或2所述的用于鉴别大曲中解淀粉芽孢杆菌的引物进行实时荧光定量PCR方法进行定性分析，根据扩增循环数差值鉴别出大曲中解淀粉芽孢杆菌。

5.如权利要求4所述的用于鉴别大曲中解淀粉芽孢杆菌的方法，其特征在于，所述实时荧光定量PCR方法反应程序为：95℃预变性10 min；95℃变性10 s，60℃退火30 s，75℃延伸45s，40个循环，在60℃收集荧光信号。

6.如权利要求4或5所述的用于鉴别大曲中解淀粉芽孢杆菌的方法，其特征在于，实时荧光定量PCR反应体系为：总体积20μL，包括qPCR Mix 10μ L，2.5 µmol/L、0.8μL的ARMS-2F引物，2.5 µmol/L、0.8μL的ARMS-2R 引物，待测菌株基因组DNA模板1μL，ddH₂O7.4uL。

7.如权利要求4所述的用于鉴别大曲中解淀粉芽孢杆菌的方法，其特征在于，所述待测菌株包含解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、嗜气芽孢杆菌、不动芽孢杆菌和人参芽孢杆菌。