ES2584538B1 - Cepa de Bacillus amyloliquefaciens y uso en el control de enfermedades causadas por bacterias y hongos en las plantas - Google Patents

Abstract

Cepa de Bacillus amyloliquefaciens y uso en el control de enfermedades causadas por bacterias y hongos en plantas.#La presente invención se refiere a la cepa Bacillus amyloliquefaciens CECT8836, así como mutantes de la misma, y al uso de dicha cepa como plaguicida en el control del enfermedades de plantas causadas por hongos y bacterias. Aspectos adicionales dela invención se refieren a métodos de preparación de suspensiones y extractos de la cepa B. amyloliquefaciens CECT8836, composiciones plaguicidas que comprenden dicha cepa y un extracto de B. amyloliquefaciens CECT8836 con actividad antimicrobiana. Por último la invención se refiere a un método de control biológico de diferentes enfermedades de plantas causadas por hongos y bacterias tanto en plantas hortícolas como frutales que comprende el tratamiento de estas plantas con la cepa B. amyloliquefaciens CECT8836, una composición que la incluya o un extracto libre de células derivado de B. amyloliquefaciens CECT8836.

Description

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DESCRIPCION

Cepa de Bacillus amyloliquefaciens y uso en el control de enfermedades causadas por bacterias y hongos en las plantas

La presente invention se refiere al campo de los fitosanitarios, concretamente a una nueva cepa de Bacillus amyloliquefaciens y a su uso en el control biologico de micosis y bacteriosis en cultivos de interes agronomico, especialmente en hortlcolas y frutales de pepita.

ESTADO DE LA TECNICA

Es bien conocido el impacto que causa el uso masivo de productos fitosanitarios sinteticos en el medio ambiente y en la salud de los consumidores. Por este motivo se ha reorientado el control de enfermedades en las plantas hacia el uso racional de fungicidas y bactericidas, y la aplicacion de metodos menos toxicos y con menor impacto ambiental. En este sentido se tiende a un manejo integrado de plagas (MIP), en el que se combinan diferentes metodos (flsicos, mecanicos, qulmicos, biologicos, geneticos, legales y culturales) con el fin de obtener un buen control de los agentes patogenos reduciendo la cantidad de tratamientos realizados. Esta reorientation en el control ha sido en parte forzada por una demanda social de productos agricolas mas sanos, lo cual ha propiciado un nuevo marco legislativo para productos fitosanitarios en la Union Europea regulado por la directiva 2009/128/CE y el Reglamento (CE) 1107/2009 del Parlamento Europeo y del Consejo relativos al uso sostenible y comercializacion de los plaguicidas. Esta directiva tiene como objetivo principal la reduction del uso de productos fitosanitarios y su sostenibilidad a traves de una gestion integrada de plagas y enfermedades, y de la proteccion del medio ambiente, estableciendo que los medios de lucha fitosanitaria deben ser preferentemente biologicos y flsicos.

Actualmente los antibioticos son los productos fitosanitarios que muestran mayor efectividad en el control de enfermedades bacterianas en plantas. Sin embargo, el uso prolongado de antibioticos favorece la generation de cepas resistentes del patogeno que esta siendo erradicado, lo cual limita su efectividad. Ademas, la aparicion de resistencia a los antibioticos en bacterias fitopatogenas puede transferirse a otras

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bacterias, incluyendo patogenos humanos. Este hecho explica la prohibition del uso de antibioticos en agricultura en muchos paises, entre los que se encuentra la Union Europea. Una alternativa a los antibioticos son los antimicrobianos de amplio espectro, tales como los compuestos cupricos, pero en este caso presentan una eficacia limitada y un impacto ambiental negativo debido a su toxicidad y acumulacion en el medio ambiente.

Dentro de este nuevo escenario, los plaguicidas microbianos basados en cepas microbianas, principalmente de especies fungicas y bacterianas, ofrecen una alternativa o complemento a los plaguicidas quimicos. Sin embargo, en la actualidad se dispone de un numero reducido de plaguicidas microbianos, siendo ademas la gran mayoria efectivos en el control de enfermedades fungicas y no de enfermedades bacterianas.

Asi, es de gran interes el desarrollo de plaguicidas microbianos capaces de controlar la bacteriosis en las plantas.

A pesar de los esfuerzos que se estan haciendo en la busqueda y desarrollo de cepas bacterianas activas utiles en el control de infecciones bacterianas y fungicas, se ha comprobado que la mayoria de estas cepas dan lugar a la production de metabolitos secundarios toxicos, carecen de una adecuada aptitud ecologica para la colonization de las plantas, muestran una menor eficacia que los productos quimicos sinteticos asi como cierta inestabilidad a lo largo del tiempo, lo cual dificulta la formulation de estas cepas en composiciones de larga duration.

En algunos casos se ha tenido evidencia de que las cepas bacterianas no colonizan ni sobreviven de manera efectiva en los organos del hospedador a proteger, requiriendose la aplicacion de estas cepas a elevadas concentraciones o de formulaciones complejas de dichas cepas, para conseguir un efecto significativo de control de la enfermedad. Ademas, aunque se trata de productos biologicos que presentan ventajas sobre otros productos plaguicidas de smtesis, el hecho de tratarse de organismos vivos implica que las condiciones ambientales y del hospedador influyen en su actividad biologica, lo que hace que su eficacia sea en general variable y significativamente inferior a la de los productos quimicos de referencia.

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Un aspecto muy importante a tener en cuenta esta relacionado con la bioseguridad, uno de los principales requisitos que tienen en cuenta las autoridades responsables de la aprobacion de productos de consumo humano, incluyendo productos fitosanitarios (EPA en USA, EFSA en Europa). Asl, algunas de las especies que han sido descritas como buenos agentes de biocontrol se han visto relacionadas con la posible patogenicidad oportunista o no oportunista, como es el caso de las especies Pseudomonas fluorescens y Pantoea agglomerans, que han sido citadas como causantes de infecciones y sepsis hospitalarias, consideracion que puede ser un obstaculo en la autorizacion de cepas de estas especies para su uso como agente plaguicida. En la UE, las cepas Pseudomonas fluorescens A506, Pantoea vagans C9- 1, P. agglomerans E325 y P. agglomerans P10c no han sido consideradas como QPS ("Qualified presumption of safety” en ingles, que significa presuncion cualificada de seguridad, un termino similar al conocido GRAS, "generally recognized as safe”, que significa generalmente reconocido como seguro).

Otro punto importante a tener en cuenta es el proceso de produccion a nivel industrial. La necesidad de disponer de productos con una mayor vida util requiere la preparation de estos productos preferiblemente en forma de solido deshidratado. Los procesos de deshidratacion utilizados requieren etapas de secado que afectan significativamente a la viabilidad de los microorganismos, limitando el rendimiento del proceso, en especial en bacterias Gram negativas como Pseudomonas sp. y Pantoea sp., las cuales son mas sensibles a los tratamientos termicos y de deshidratacion que las Gram positivas. En el caso concreto del genero Bacillus, el hecho que produzcan esporas favorece enormemente su formulation en forma de polvo deshidratado ya que la perdida de viabilidad es muy baja, obteniendo un rendimiento muy elevado al final del proceso.

En este sentido, son varias las cepas de Bacillus subtilis o especies relacionadas que se han desarrollado como agentes de biocontrol, como son la cepa QST713 (Bonaterra A et al, "Prospects and limitations of microbial biopesticides for control of bacterial and fungal pomefruit tree diseases”, Trees 2012, vol. 26, pp. 215-226) y la FZB42 de la especie B. amyloliquefaciens. Ambas cepas son el ingrediente activo de productos autorizados o pendientes de autorizacion para su uso como plaguicidas microbianos. Sin embargo, muchas de estas cepas muestran un perfil de actividad limitado y normalmente focalizado en el control de hongos.

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Por lo tanto, a pesar de los esfuerzos realizados existe todavla la necesidad de cepas bacterianas alternativas a las existentes que, aun siendo eficientes en el control de hongos fitopatogenos, tambien muestren eficacia en el control de la infeccion causada por bacterias fitopatogenas y que superen los inconvenientes del estado de la tecnica.

EXPLICACION DE LA INVENCION

Los inventores han aislado una nueva cepa del genero Bacillus que se caracteriza por tener un espectro de actividad amplio, siendo muy eficiente en el control de diferentes patogenos bacterianos y fungicos. Ademas supera algunas de las limitaciones mostradas por otras cepas ya descritas en el estado de la tecnica, tal y como se muestra mas abajo.

Asl, en un primer aspecto la invention se refiere a una cepa de Bacillus amyloliquefaciens depositada en la Coleccion Espanola de Cultivos Tipo (CECT) con el numero de acceso CECT8836, o un mutante de la misma, donde dicho mutante: (a) se obtiene utilizando la cepa Bacillus amyloliquefaciens CECT8836 como producto de partida y (b) mantiene la actividad antagonista asl como la capacidad de colonizar o sobrevivir de la cepa de partida en una parte de una planta.

La cepa de Bacillus amyloliquefaciens de la invencion, aislada de flores de Lobularia maritima de la region de Girona, fue depositada por el solicitante de acuerdo con el Tratado de Budapest el 11 de febrero de 2015 en la Coleccion Espanola de Cultivos Tipo (CECT), situada en la Universidad de Valencia, Edificio de investigation, Campus de Burjassot, 46100 Burjassot, Valencia, Espana. La cepa recibio el numero de acceso CECT8836 despues de que fuera considerada viable.

La invencion tambien se refiere a mutantes de la cepa Bacillus amyloliquefaciens CECT8836. Se entiende por "mutantes” bacterias que se obtienen utilizando como producto de partida la cepa B. amyloliquefaciens CECT8836 de la invencion y que se caracterizan por mantener las propiedades de dicha cepa depositada, en cuanto a la capacidad antagonista frente a bacterias fitopatogenas, bioseguridad y aptitud ecologica en la colonization de las plantas. Un "mutante” de B. amyloliquefaciens CECT8836 se entiende tambien segun la presente invencion como una "variante” de B. amyloliquefaciens CECT8836. El experto en la materia entendera que usando la

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cepa de la invencion como material de partida es posible obtener de forma rutinaria, por ejemplo mediante mutagenesis espontanea o mutacion dirigida, mutantes que conserven las caracterlsticas y ventajas pertinentes descritas en la presente memoria. Los metodos para obtener mutantes de una cepa bacteriana concreta son conocidos en la tecnica. Un ejemplo puede encontrarse en (Sambrook, J. y Russell, D.W. "Molecular cloning: a laboratory Manual”, Capltulo 13, "Mutagenesis”, Cold Spring Harbor, 3a Ed., 2001).

En la presente invencion el termino "cepa de la invencion” se refiere no solo a la cepa B. amyloliquefaciens CECT8836, sino tambien a mutantes de la misma.

Tal y como se ilustra mas abajo, la cepa de la invencion se caracteriza por mostrar:

(i) actividad antagonista de la cepa de partida frente a las bacterias Erwinia amylovora, Pseudomonas syringae pv syringae, P. syringae pv tomato, Xanthomonas axonopodis pv vesicatoria, X. arboricola pv fragariae, Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis, Ralstonia solanacearum, Rhizobium radiobacter, Pectobacterium carotovorum, y a los hongos Phytophthora cinnamomi, P. cactorum, Penicillium expansum, Botrytis cinerea, Fusarium oxysporum y Pytium ultimum (FIG. 3);

(ii) presencia de los genes fenD, srfAA, bacA, spaS, bmyB, e ituC relacionados con la slntesis de peptidos antimicrobianos (FIG. 1). Ademas, se comprobo que esta cepa tambien inclula los genes beaS, dfnM, dhbA y mlnI, relacionados con la slntesis de poliquetidos y otros compuestos diversos con actividad antimicrobiana;

(iii) capacidad de colonizar o sobrevivir en una parte aerea de una planta; y

(iv) capacidad de inhibir infecciones causadas por E. amylovora y P. syringae pv. syringae en plantas de peral, por P. syringae pv. tomato en plantas de tomate; y por X. axonopodis pv. vesicatoria en plantas de pimiento (FIG. 6).

La elevada actividad antagonista de la cepa de la invencion es en parte consecuencia de la produccion de compuestos peptldicos y no peptldicos que inhiben el crecimiento de bacterias y hongos patogenos. Entre estos compuestos cabe destacar las surfactinas, fengicinas, bacilomicinas, iturinas, bacilisina y subtilina. Aunque muchas cepas de Bacillus contienen genes relacionados con la bioslntesis de estos peptidos

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con actividad antimicrobiana, no todas ellas muestran actividad antagonista frente a patogenos vegetales, ya sean bacterianos o fungicos. En este sentido, en el Ejemplo 1 de abajo se muestra que muchas de las cepas de Bacillus (que poseen genes de slntesis de alguno de estos peptidos antimicrobianos), no tienen actividad antagonista relevante frente a hongos y bacterias fitopatogenas. En cambio, en la FIG. 3 se puede observar que la cepa B. amyloliquefaciens CECT8836 de la invencion exhibe un amplio espectro de antagonismo destacado frente a diferentes fitopatogenos bacterianos, ademas de frente a diferentes hongos fitopatogenos. Dicho efecto antagonista sorprendente tambien queda reflejado en la FIG. 6, donde se muestra la efectividad de la cepa de la invencion en la inhibicion de infecciones de E. amylovora, P. syringae pv. syringae en plantas de peral, P. syringae pv tomato en plantas de tomate y X. axonopodis pv vesicatoria en plantas de pimiento. En el Ejemplo 1 tambien queda demostrado que la cepa de la invencion tiene la capacidad de producir todas las isoformas detectables de los diferentes peptidos antimicrobianos analizados (FIG. 2), donde se incluyen las surfactinas, fengicinas, bacilomicinas e iturinas. Ademas, sorprendentemente, como ya se ha indicado mas arriba, la cepa CECT8836 presenta 6 genes relacionados con la slntesis de peptidos antimicrobianos, as! como otros 4 genes relacionados con la slntesis de poliquetidos y otros compuestos diversos con actividad antimicrobiana. Este perfil antimicrobiano, esto es, elevado numero de genes involucrados en la slntesis de diferentes antimicrobianos para un amplio abanico de actividades, as algo peculiar y sorprendente de la cepa de la invencion cuando se compara con otras cepas de Bacillus procedentes de ambientes naturales relacionados con las plantas (ver FIG. 1 donde se listan otras cepas de Bacillus aisladas del medio).

En la presente invencion el termino "aptitud ecologica” se refiere a la capacidad de un microorganismo para colonizar, multiplicarse en condiciones favorables, y sobrevivir en condiciones adversas en un ambiente (en este caso planta).

En la presente invencion el termino "parte aerea de una planta” incluye la flor, hoja y fruto de una planta.

La planta puede ser una planta de tipo hortlcola o frutal, tal como un peral, tomate, coliflor o pimiento, entre otras.

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La presencia de los genes relacionados con la slntesis de peptidos antimicrobianos puede determinarse mediante parejas de cebadores definidos por las secuencias SEC ID NO: 3-26 tal y como se describe en el Ejemplo 1. La actividad antagonista in vitro y ex vivo contra hongos y bacterias fitopatogenas puede determinarse segun se describe en los Ejemplos 3-4. La capacidad para inhibir infecciones de E. amylovora, P. syringae pv syringae, P. syringae pv tomato y X. axonopodis pv vesicatoria puede determinarse segun se describe en el Ejemplo 3. La capacidad de colonization y supervivencia en plantas en condiciones de campo se describe en el Ejemplo 6. La capacidad de control de enfermedades fungicas y bacterianas en condiciones de campo puede determinarse segun se describe en el Ejemplo 7.

La cepa de la invention posee varias ventajas que la hacen especialmente adecuada para su uso en el control integrado de plagas. En la presente invencion el termino "control integrado de plagas” (o "manejo integrado de plagas”) tiene el significado habitual en el campo de la agricultura, donde se entiende como una estrategia que usa una gran variedad de metodos complementarios: flsicos, mecanicos, qulmicos, biologicos, geneticos, legales y culturales para el control de plagas. Estos metodos se aplican en tres etapas: prevention, observation y aplicacion. Es un metodo ecologico que aspira a reducir o eliminar el uso de plaguicidas de slntesis qulmica y a minimizar el impacto en el medio ambiente. Se habla tambien de control ecologico o biologico de plagas. Asl, en la presente invencion los terminos "control de plagas”, "control biologico de plagas” se usan indistintamente y se refieren al control integrado de plagas.

Para empezar, los miembros de la especie B. amyloliquefaciens en particular, son seguros al estar consideradas como GRAS por la FDA en Estados Unidos y como QPS por la EFSA en la Union Europea. En consecuencia, la cepa de la invencion es adecuada para su uso en agricultura.

Ademas de su reconocida bioseguridad, tal y como se muestra mas abajo la cepa de la invencion es altamente efectiva en la prevencion de infecciones causadas por diferentes patogenos bacterianos y fungicos en plantas hortlcolas y frutales. De los datos mostrados mas abajo se puede concluir, ademas, que esta efectividad se debe principalmente a su elevada actividad antagonista frente a estos patogenos y a su sorprendente aptitud ecologica para colonizar y sobrevivir en los organos aereos de la

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plantas como hojas, frutos y/o flores. En particular, en el Ejemplo 6 se muestra que la cepa de la invention tiene una elevada capacidad para colonizar y sobrevivir en organos de las plantas a proteger contra diferentes infecciones, especialmente bacterianas. Esta sorprendente aptitud ecologica es muy importante para el control biologico de las plagas.

En vista de lo anterior, en otro aspecto la invencion se refiere al uso de la cepa B. amyloliquefaciens CECT8836 o un mutante de la misma como plaguicida en plantas.

En la presente invencion el termino “plaguicida” se entiende con su acepcion habitual en el campo de la agronomla como un producto destinado a matar, repeler, regular o interrumpir el crecimiento de seres vivos considerados plagas. Queda claro que, debido a la naturaleza de la cepa B. amyloliquefaciens CECT8836 o mutante de la misma, en la presente invencion se entiende que “plaguicida” es un plaguicida biologico o ecologico, tambien denominado bioplaguicida. En el ambito de la presente invencion el termino “plaguicida” tendrla el mismo significado que el termino “fitosanitario”.

En un aspecto mas la invencion proporciona el uso de la cepa B. amyloliquefaciens CECT8836 o mutante de la misma en el control de una enfermedad causada por una bacteria u hongo en una planta.

En la presente invencion el termino “control de la enfermedad” significa que previene, cura o erradica la enfermedad.

En una realization, la planta a ser tratada es una planta hortlcola o frutal.

En otra realizacion la cepa de la invencion o un mutante de la misma se usa en la prevention de infecciones causadas por bacterias u hongos en plantas.

De cara a su uso como plaguicida en plantas, es importante poder obtener grandes cantidades de celulas viables de la cepa. Tal y como se muestra en el Ejemplo 5, una vez concentrada y liofilizada, la composition muestra una viabilidad celular del 100% que se mantiene durante el almacenaje. .

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En otro aspecto, la presente invention se refiere a un procedimiento para la obtencion de una suspension de celulas viables derivada de la cepa de la invencion que comprende: (i) inocular la cepa de la invencion en un medio de cultivo apropiado, y (ii) someter el medio de cultivo inoculado de la etapa (i) a condiciones propicias para el crecimiento de la cepa.

La expresion "derivada de la cepa de la invencion” significa que la suspension se obtiene a partir de la cepa objeto de la presente invencion.

La cepa de la invencion puede inocularse en el medio de cultivo a una concentration final entre el 1 y el 5%. Preferentemente el cultivo a inocular se encuentra en fase de crecimiento exponencial. El crecimiento celular se frenara al alcanzar, preferentemente, una concentracion celular entre 7*10*8 y 2*10*9 UFC/ml. Medios de cultivo adecuados para el crecimiento de la cepa de la invencion son medios sinteticos, como LB (de Lysogenic broth) y PM (medio de production salino), o medios de origen vegetal como melazas (por ejemplo de cana de azucar, remolacha). Condiciones adecuadas para el crecimiento de la cepa son temperaturas entre 25 y 35 °C, pH entre 6 y 8, y concentracion de oxlgeno entre 10 y 50%. El crecimiento de la cepa de la invencion se produce bajo agitation. Un ejemplo del procedimiento detallado de obtencion de celulas de la cepa de la invencion esta reflejado en el Ejemplo 4.

En otra realization del procedimiento de obtencion de la suspension, las celulas se separan del medio para obtener una suspension concentrada. Tecnicas de separation adecuadas incluyen la centrifugation o filtration del cultivo. Llevando a cabo la centrifugation del cultivo, por ejemplo, a un mlnimo de 8000 rpm, se obtienen celulas en el sedimento, que se resuspenden en parte del medio de cultivo o en un medio tamponado adecuado de manera que la concentracion de la cepa sea de aproximadamente alrededor de 1010 UFC/ml.

Una vez obtenida la suspension, esta puede someterse a una etapa de deshidratacion. La deshidratacion se puede llevar a cabo mediante un proceso de liofilizacion. Alternativamente, se puede deshidratar la suspension por secado mediante lecho fluidizado. Otra option es deshidratar la suspension mediante atomization. En este sentido otra caracterlstica ventajosa de la cepa de la invencion

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es que exhibe una elevada resistencia a los procesos de deshidratacion que son habituales en la obtencion de microorganismos a escala industrial. Con el fin de mejorar la viabilidad de las celulas se puede anadir a la suspension, antes de llevar a cabo el proceso de deshidratacion, un ingrediente osmoprotector inerte.

En otra realization particular, el procedimiento para la obtencion de una suspension de celulas viables de la invention comprende resuspender las celulas resultantes de la etapa de separacion en un tampon adecuado para dar lugar a una suspension concentrada de celulas.

Con vistas a su uso en el control de plagas, los agentes plaguicidas suelen ser formulados en composiciones que incluyen tambien aditivos adecuados para el uso agricola para el cual estan disenados. Las composiciones de la invencion pueden ser solidas (incluyendo, por ejemplo, concentrado de bacterias deshidratadas) o llquidas (incluyendo suspensiones concentradas de bacterias).

"Compuestos adecuados para el uso agricola” se refiere a aquellos compuestos y/o materiales que son adecuados para su uso en agricultura. En general dichos compuestos deben ser no toxicos para el ser humano y preferentemente deben ser respetuosos con el medio ambiente.

En una realizacion particular, las composiciones plaguicidas de la invencion pueden contener compuestos para mejorar la adherencia de las cepas en las plantas a tratar, compuestos fitofortificantes, nutrientes, humectantes, estabilizantes, osmoprotectores, antioxidantes, protectores solares, compuestos tamponadores o combinaciones de los mismos. Algunos compuestos para mejorar la adherencia son gelatinas, almidones, pectinas, alginatos y diversos tipos de gomas como xantanos. Muchos de estos compuestos son tambien humectantes. Entre los protectores solares se incluyen colorantes como rojo Congo. Los fitofortificantes son compuestos que pueden favorecer que los cultivos desarrollen vigor o tolerancia frente a patogenos o a condiciones ambientales adversas como, por ejemplo, analogos del acido jasmonico y ciertos estimulantes de las defensas en plantas como harpinas, quitosanos, y laminarinas. En particular las composiciones plaguicidas de la invencion contienen al menos un osmoprotector como aditivo. Ejemplos de compuestos osmoprotectores son betalnas, aminoacidos y trealosa.

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En un aspecto mas la presente invention proporciona una composition que comprende la cepa de la invencion y al menos un agente plaguicida adicional, dicho plaguicida adicional no afectando negativamente a la actividad de la cepa CECT8836. En una realization, la composicion de la invencion comprende un plaguicida adicional. En otra realizacion, el agente plaguicida adicional se selecciona del grupo que consiste en una cepa bacteriana efectiva en el control de una infection bacteriana o fungica, un fungicida, un insecticida o un nematicida.

En una realizacion particular, el agente plaguicida adicional es otra cepa bacteriana con efectividad en el control de la infeccion bacteriana o fungica. Entre las cepas bacterianas con efectividad en el control de varias infecciones, ademas de la cepa de la invencion CECT8836, se encuentra otra cepa B. amyloliquefaciens la CECT8837, o un mutante de la misma, aislada por los inventores de la presente invencion. En una realizacion, la composicion de la invencion comprende B. amyloliquefaciens CECT8836 y B. amyloliquefaciens CECT8837 junto con aditivos adecuados para el uso agricola.

En otro aspecto la invencion se refiere a una cepa de Bacillus amyloliquefaciens depositada en la Coleccion Espanola de Cultivos Tipo (CECT) con el numero de acceso CECT8837, o un mutante de la misma, donde dicho mutante: (a) se obtiene utilizando la cepa Bacillus amyloliquefaciens CECT8837 como producto de partida, y (b) se caracteriza por mantener la actividad antagonista asl como la capacidad de colonizar o sobrevivir de la cepa de partida en una parte aerea de una planta.

La cepa B. amyloliquefaciens CECT8837, aislada de hojas de un abeto comun procedente de la region de Lleida (Espana), fue depositada por el solicitante de acuerdo con el Tratado de Budapest el 11 de febrero de 2015 en la Coleccion Espanola de Cultivos Tipo (CECT), situada en la Universidad de Valencia, Edificio de investigation, Campus de Burjassot, 46100 Burjassot, Valencia, Espana. La cepa de B. amyloliquefaciens recibio el numero de acceso CECT8837.

Se entiende por ”mutante” una bacteria que se obtiene utilizando como producto de partida la cepa B. amyloliquefaciens CECT8837 de la invencion y que se caracteriza por mantener las propiedades de dicha cepa depositada, en cuanto a la capacidad

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antagonista frente a bacterias fitopatogenas, bioseguridad y aptitud ecologica en la colonization de las plantas. Un "mutante” de B. amyloliquefaciens CECT8837 se entiende tambien segun la presente invention como una "variante” de B. amyloliquefaciens CECT8837. El experto en la materia entendera que usando esta cepa de la invention como material de partida es posible obtener de forma rutinaria, por ejemplo mediante mutagenesis espontanea o mutation dirigida, mutantes que conserven las caracterlsticas y ventajas pertinentes descritas en la presente memoria. Los metodos para obtener mutantes de una cepa bacteriana concreta son conocidos en la tecnica. Un ejemplo puede encontrarse en (Sambrook, J. et al., 2001 citado mas arriba).

Al igual que la cepa B. amyloliquefaciens CECT8836, los inventores han observado que la cepa B. amyloliquefaciens CECT8837, asl como mutantes de la misma, tienen propiedades ventajosas para su uso como plaguicidas en el control de infecciones causadas por hongos o bacterias en plantas, especialmente las causadas por bacterias. Esta cepa es segura, posee una elevada actividad antagonista frente a gran diversidad de fitopatogenos bacterianos y fungicos y es capaz de colonizar y sobrevivir en las plantas en diferentes condiciones ambientales. Tal y como se ilustra en los ejemplos de mas abajo, la cepa CECT8837 se caracteriza por tener las siguientes propiedades:

(i) actividad antagonista frente a las bacterias Erwinia amylovora,

Pseudomonas syringae pv syringae, P. syringae pv tomato, Xanthomonas axonopodis pv vesicatoria, X. arboricola pv fragariae, Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis, Ralstonia solanacearum, Agrobacterium tumefaciens, E. carotorova, y a los hongos Phytophthora cinnamomi, P. cactorum, Penicillium

expansum, Stemphylium vesicarium, Botrytis cinerea, y Pytium ultimum; y no presenta antagonismo contra F. oxysporum;

(ii) presencia de los genes fenD, srfAA, bacA, bmyB, e ituC, relacionados con la slntesis de peptidos antimicrobianos (FIG. 1). Ademas, se comprobo que esta cepa tambien inclula los genes beaS, dfnM, dhbA y mlnI, relacionados con la slntesis de poliquetidos y otros compuestos diversos con actividad antimicrobiana. Esta cepa no presenta los genes spaS a diferencia de la cepa CECT8836;

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(iii) capacidad de colonizar o sobrevivir en una parte aerea de la planta;

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(iv) capacidad de inhibir infecciones causadas por E. amylovora y P. syringae pv. syringae en plantas de peral, por P. syringae pv. tomato en plantas de tomate; y por X. axonopodis pv. vesicatoria en plantas de pimiento.

Asl, la presente invention se refiere al uso de la cepa CECT8837 como plaguicida en una planta, particularmente en la prevention, curacion o erradicacion de enfermedades causadas por bacterias u hongos en plantas, preferiblemente del tipo hortlcola o frutal. Otros aspectos se refieren a composiciones que comprenden la cepa o un mutante de la misma junto con compuestos aceptables a nivel agricola y/o al menos un plaguicida, dichos compuestos no afectando negativamente a la actividad de la cepa CECT8837 y dichos plaguicidas siendo tal y como se definen mas arriba; y al uso de estas composiciones en el control de la infection causada por bacterias u hongos en plantas.

La invencion tambien se refiere a un procedimiento de obtencion de una suspension de celulas viables a partir de B. amyloliquefaciens CECT8837 o un mutante de la misma, que es analogo al descrito para B. amyloliquefaciens CECT8836.

La invencion se refiere en otro aspecto a un extracto libre de celulas derivado de la cepa B. amyloliquefaciens CECT8836, B. amyloliquefaciens CECT8837, o de un mutante de las mismas, obtenible mediante el procedimiento que comprende: (i) inocular la cepa en un medio de cultivo apropiado, (ii) someter el medio de cultivo inoculado a condiciones de crecimiento adecuadas, (iii) separar las celulas del medio de cultivo de la etapa (ii), (iv) recoger extracto libre de celulas; y (v) opcionalmente someter el extracto libre de celulas a un proceso de concentration.

Medios de cultivo, condiciones de inoculation y condiciones de crecimiento adecuados para la cepa de la invencion para la obtencion del extracto son los mismos que los descritos mas arriba para el procedimiento de obtencion de una suspension de celulas a partir de la cepa CECT8836 o una mutante de la misma. Preferentemente, el crecimiento de las celulas se frenara en fase estacionaria, mas preferentemente despues de 30-48 horas. En otra realization, la etapa (ii) tiene lugar a una temperatura

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entre 25 y 35°C, un pH entre 6 y 9, y una concentration de oxlgeno entre 10 y 50%, con agitation hasta alcanzar una concentration celular superior a 1^10*9 UFC/ml. En cuanto a la etapa (v), ejemplos no limitantes de procesos de concentration adecuados son deshidratacion (liofilizacion, atomization), filtration, ultrafiltracion, precipitation, centrifugation, y cromatografla. Adicionalmente, con el fin de incrementar su actividad, el extracto de la invention se puede someter a un proceso de fraccionamiento para separar las fracciones mas activas. Preferentemente, el fraccionamiento comprende una cromatografla de discrimination molecular y/o de fase reversa.

Los extractos de la cepa B. amyloliquefaciens CECT8836, CECT8837 o un mutante de estas pueden usarse directamente en el control de enfermedades bacterianas y fungicas, aunque preferentemente, formaran parte de una composition plaguicida junto con otros compuestos aceptables a nivel agricola. Por lo tanto, aspectos adicionales de la invencion proporcionan una composicion que comprende el extracto de la invention, uno o mas compuestos aceptables a nivel agricola y/o uno o mas plaguicidas adicionales, as! como el uso de dichas composiciones como plaguicida y en el control de enfermedades causadas por bacterias u hongos de plantas. En una realization la composition plaguicida comprende un extracto libre de celulas obtenido a partir de CECT8836 segun se define mas arriba y un plaguicida adicional seleccionado de entre la cepa CECT8836 y la cepa CECT8837. En otra realization la composition plaguicida comprende un extracto libre de celulas obtenido a partir de la cepa CECT8837 y un plaguicida adicional seleccionado de entre la cepa CECT8836 y la cepa CECT8837.

Por ultimo la invention se refiere a un metodo de control biologico de una enfermedad bacteriana o fungica en una planta que comprende la administration de una cepa de la invention (CECT8836, CECT8837) o mutante de la misma, una composition, una suspension que comprenda dicha cepa, o un extracto libre de celulas derivado de dicha cepa.

A lo largo de la description y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras caracterlsticas tecnicas, aditivos, componentes o pasos. Ademas, la palabra “comprende” incluye el caso “consiste en”. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y caracterlsticas de la invention se desprenderan en parte de la description y en parte de la practica de la invention. Los

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siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustracion, y no se pretende que sean limitativos de la presente invencion. Los signos numericos relativos a los dibujos y colocados entre parentesis en una reivindicacion, son solamente para intentar aumentar la comprension de la reivindicacion, y no deben ser interpretados como limitantes del alcance de la proteccion de la reivindicacion. Ademas, la presente invencion cubre todas las posibles combinaciones de realizaciones particulares y preferidas aqul indicadas.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS

FIG. 1. Dendrograma correspondiente al coeficiente de disimilaridad de 64 aislados de Bacillus sp. segun su perfil de presencia de genes biosinteticos de peptidos antimicrobianos (srfAA, bacA, bmyB, fenD, spaS e ituC). Los slmbolos indican presencia (+) o ausencia (-) del gen. Se indican las siete agrupaciones principales al nivel de disimilaridad de 7 (G1, G2, G3, G4, G5, G6, G7), asl como la posicion de la cepa CECT8836 en el dendrograma (flecha).

FIG. 2. Dendrograma correspondiente al coeficiente de disimilaridad de 64 aislados de Bacillus sp., segun su perfil de produccion de isoformas de peptidos clclicos correspondientes a las famllias de las iturinas (I1, I2, I3, I4), fengicinas (F1, F2, F3, F4, F5, F6, F7) y surfactinas (S1, S2, S3, S4). Los slmbolos indican presencia (+) y ausencia (-) de la isoforma mayoritaria. Se indican las cuatro agrupaciones principales al nivel de disimilaridad de 5 (G1, G2, G3, G4), asl como la posicion de la cepas CECT8836 en el dendrograma (flecha).

FIG. 3. Dendrograma correspondiente al coeficiente de disimilaridad de 64 aislados de Bacillus sp., segun su perfil de antagonismo in vitro en agar LB y NA, frente a ocho bacterias fitopatogenas (Erwinia amylovora PMV6076, Pseudomonas syringae pv syringae EPS94, P. syringae pv tomato DC3000, Xanthomonas axonopodis pv vesicatoria CFBP3275, X. arboricola pv. fragariae CFBP3549, Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis CECT790, Ralstonia solanacearum CECT125, Rhizobium radiobacter CECT472 y Pectobacterium carotovorum CECT225), y en PDA, frente a cinco hongos fitopatogenos (Phytophthora cinnamomi CECT2965, P. cactorum F490, Penicillium expansum EPS26, Fusarium oxysporum ATCC201829 y Pythium ultimum CECT2364). La actividad inhibitoria de cada cepa de Bacillus contra cada

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indicador se clasifico en: 1, halos de inhibicion inferiores a 10 mm; 2, halos de inhibicion entre 10 y 20 mm; 3, halos de inhibicion superiores a 20 mm. Finalmente, para cada cepa de Bacillus se calculo un Indice global de actividad (GAI) a partir del sumatorio de la actividad inhibitoria para los correspondientes hongos o bacterias indicadores y medio de cultivo utilizado. Los valores maximos de GAI eran de 24 para la actividad contra bacterias (8 bacterias indicadoras para un nivel maximo de actividad de 3) y de 15 para la actividad contra hongos (5 hongos indicadores para un nivel maximo de actividad de 3). Asl, valores elevados indican una actividad antifungica/antibacteriana alta y con amplio espectro de actividad. Con los datos de actividad inhibitoria de cada cepa se calcula la matriz de distancias entre las diferentes cepas por el metodo de Ward y se obtiene finalmente el dendrograma de la figura. Este metodo permite calcular el coeficiente de disimilaridad entre dos cepas de modo que la distancia respectiva es mayor cuanto mayor sea su valor (mas diferentes son las cepas).

Se indican las cinco agrupaciones principales que se observan al nivel de disimilaridad de 3.5 (G1, G2, G3, G4, G5), asl como la posicion de la cepa CECT8836 en el dendrograma (flecha).

FIG. 4. Arbol filogenetico correspondiente al coeficiente de disimilaridad de 31 cepas de Bacillus sp., segun la interrelation entre las secuencias rpoB de las distintas cepas. Se senala la posicion de la cepa CECT8836 en el dendrograma (flecha).

FIG. 5. Patron de amplification aleatoria de ADN polimorfico (RAPD) obtenido con el cebador SPASF (A) y el SRFAF (B). M, marcador de peso molecular 1 Kb Plus (Invitrogen); 1, CECT8836; 2, CECT8837; 3, EPS2068; 4, EPS2113; 5, EPS2119; 6, EPS2128; 7, EPS2064; 8, EPS2068; 9, QST713; 10, FZB42; 11, EPS2004; 12, Control negativo.

FIG. 6. Efecto de los tratamientos con diferentes cepas de Bacillus sp., en la intensidad de las infecciones causadas por E. amylovora y P. syringae pv. syringae en plantas de peral (A y B), por P. syringae pv. tomato en plantas de tomate (C) y por X. axonopodis pv. vesicatoria en plantas de pimiento (D). Los resultados se comparan con un control no tratado (NTC), con un control tratado con la cepa QST713 de B. amyloliquefaciens y con un control tratado con el antibiotico estreptomicina (Str). Los

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valores son las medias de tres replicas y las barras de error representan el 95% del intervalo de confianza de la media. Letras iguales sobre las barras indican que los tratamientos no difieren significativamente segun la prueba de Tukey (P<0,05). Y, intensidad de las infecciones (%).

FIG. 7. Cinetica de crecimiento (•), porcentaje de esporulacion (□) y evolucion del pH (O) de Bacillus amyloliquefaciens CECT8836 en medio LB (A) y medio salino modificado (B) a 28 °C y de la actividad antimicrobiana de los extractos libres de celulas derivados de CECT8836 sobrenadantes frente a Erwinia amylovora (A) y P. syringae pv. syringae (A). X, tiempo (horas). Y, concentracion de viables (Log10 UFC/ml). W, esporulacion (%). Z, Porcentaje de inhibicion (%).

FIG. 8. Perfil cromatografico resultante de la HPLC correspondiente a las cepas de Bacillus CECT8836 (A), QST713 (B) y FZB42 (C) enriquecidas en medio de cultivo llquido PM. En el eje Y se representa la Absorbancia para cada una de las fracciones recogidas (mAU= miliunidades de absorbancia) y en el eje X el tiempo en el que se recoge cada una de las fracciones (en minutos).

FIG. 9. Recuento de viables despues del proceso de fermentacion en medio LB (■) y despues del proceso de la liofilizacion en lactosa 15% (□) en dos ensayos independientes. Eje Y= concentracion de viables (Log10 UFC/g).

FIG. 10. Multiplication y supervivencia de la cepa CECT8836 de Bacillus amyloliquefaciens (•) y de la poblacion total de bacterias en el control no tratado (O) en un parcela comercial de coliflor (A) y de remolacha (B) bajo condiciones de campo. X= tiempo (dlas). Y= supervivientes (Log10 UFC/hoja).

FIG. 11. Efecto de los tratamientos con la cepa de CECT8836 de Bacillus amyloliquefaciens sola (CECT8836) o juntamente con el extracto de cultivo (CECT8836 + S) en la reduction de la intensidad de las infecciones causadas por Hyaloperonospora brassicae en plantas de coliflor (A), por Cercospora beticola en plantas de remolacha (B) y por Erwinia amylovora en plantas de peral (C). Los resultados se comparan con un control no tratado (NTC) y con un control tratado con un producto de referencia, un compuesto de cobre (Cu) en los ensayos de control contra hongos y con el antibiotico estreptomicina (Str) en el ensayo contra la bacteria.

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Los valores son las medias de tres replicas y las barras de error representan el 95% del intervalo de confianza de la media. Letras iguales sobre las barras indican que los tratamientos no difieren significativamente segun la prueba de Tukey (P<0,05). Y, intensidad de las infecciones (%).

EJEMPLOS

Ejemplo 1. Aislamiento y caracterizacion de las cepas B. amyloliquefaciens CECT8836 y B. amyloliquefaciens CECT8837

Para obtener los aislados se tomaron muestras de hojas, flores y frutos obtenidos a partir de plantaciones comerciales de plantas hortlcolas y de frutales de pepita y hueso, asl como de plantas silvestres en terrenos colindantes a parcelas comerciales. Todas las muestras eran procedentes de campos de cultivo y entornos naturales de clima mediterraneo. Las muestras se procesaron segun metodos microbiologicos convencionales (Mora et al., “Antimicrobial peptide genes in Bacillus strains from plant environments”, International Microbiology, 2011, vol. 14, pp. 213-223), y se aislaron bacterias del genero Bacillus en medio LB a 40°C durante 48 h, constituyendo una coleccion de 68 aislados. Dichos aislados se sometieron a un estudio para determinar la presencia de los genes srfAA, bmyB, ituC, fenD, spaS y bacA, involucrados en la produccion de peptidos antimicrobianos (PAMs), concretamente, de los ciclopipopeptidos surfactina, bacilomicina, iturina y fengicina, del lantibiotico subtilina, y del dipeptido bacilisina, respectivamente (Chen et al., “Comparative analysis of the complete genome sequence of the plant growth-promoting bacterium Bacillus amyloliquefaciens FZB42”, Nature Biotechnology, 2007, vol. 25, pp. 1007-1014). El DNA de los aislados y de las cepas de referencia B. amyloliquefaciens FZB42 (control positivo) (Koumoutsi et al., Structural and Functional Characterization of Gene Clusters Directing Nonribosomal Synthesis of Bioactive Cyclic Lipopeptides in Bacillus amyloliquefaciens Strain FZB42, 2004, Journal of bacteriology, vol. 186, pp.1084 - 1096) y B. polymyxa RGAF84 (control negativo) (Landa et al., Integrated management of Fusarium wilt of chickpea with sowing date, host resistance, and biological control, 2004, Phytopathology, Vol. 94, pp. 946-960) se utilizaron para verificar la correcta amplification de los genes mediante PCR. El DNA se obtuvo a partir de cultivos de la cepa en fase exponencial obtenidos mediante cultivo en caldo LB inoculado al 1% (v/v) e incubado a 28 °C mediante agitation (100 rpm). El material obtenido se sometio a

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centrifugacion a 8000 rpm durante 15 minutos y el sedimento que contenla las celulas y esporas se utilizo para extraer el DNA mediante tampon Tris-salino-EDTA-SDS antioxidante y precipitacion con isopropanol, ajustando la concentration a10ng DNA/pL utilizando el sistema Nanodrop. Las reacciones de amplification se realizaron en condiciones estandar utilizando los cebadores definidos para cada uno de los genes. Concretamente las secuencias SEC ID NO: 1 (srfAAF:

TCGGGACAGGAAGACATCAT) y 2 (srfAAR: CCACTCAAACGGATAATCCTGA) para el gen srfAA, SEC ID NO: 3 (bmyBF: GAATCCCGTTGTTCTCCAAA) y 4 (bmyBR: GCGGGTATTGAATGCTTGTT) para el gen bmyB, SEC ID NO: 5 (ituCF:

GGCTGCTGCAGATGCTTTAT) y 6 (ituCR: TCGCAGATAATCGCAGTGAG) para el gen ituC, SEC ID NO: 7 (fenDF: GGCCCGTTCTCTAAATCCAT) y 8 (fenDR: GTCATGCTGACGAGAGCAAA) para el gen fenD, SEC ID NO: 9 (spaSF: GGTTTGTTGGATGGAGCTGT) y 10 (spaSR: GCAAGGAGTCAGAGCAAGGT) para el gen spaS, y SEC ID NO: 11 (bacAF: CAGCTCATGGGAATGCTTTT) y 12 (bacAR: CTCGGTCCTGAAGGGACAAG) para el gen bacA. Las condiciones fueron de 4 min a 95°C, 35 ciclos de 1 min a 94°C, 1 min a 58°C, y 1 min a 72°C, con una etapa de extension final de 5 min at 72 °C seguida de una parada a 4°C. Para los cebadores del gen bmyB la temperatura de anillamiento fue de 55°C en vez de 58°C. Los productos amplificados se separaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 1.8 % en 1X Tris-acetato EDTA (TAE) durante 45 min a 90 V y visualizados con bromuro de etidio. Sorprendentemente, se observo gran diversidad en cuanto a la presencia de los genes. Entre los aislados se observo que la distribution de estos genes era bastante dispersa, pero que la presencia de mas de 3 genes de forma simultanea era menos frecuente (FIG. 1). Las cepas se distribuyeron en 7 grupos. La cepa CECT8836 aparece en el grupo 7. Destaca esta cepa por ser la unica que comprende todos los genes amplificados. La cepa CECT8837 aparece en el grupo 5 y se caracteriza por tener los genes, srfAA, bacA, bmyB, ituC y fenD, pero no presenta el gen spaS. Ademas de estos genes, en las cepas CECT8836 y CECT8837, tambien se han detectado los genes beaS, mini, dfnM y dhbA relacionados con la slntesis de los poliquetidos bacillaeno, macrolactina y dificidina, y el sideroforo bacillibactina, respectivamente. Estos genes se detectan con las secuencias SEC ID NO: 19 (beaSF1: CGCAAAAGCTCTTCGACCGCCGTC) y 20 (beaSR1:

CTCTCGTGCCGTCGGAATATCCGC) para el gen beaS, SEC ID NO: 21 (dfnMF1: CGGAGT GAAACCGTGCCGGGAT AAAGA) y 22 (dfnMR1:

GACCATTCAGAGCGGAAAGCTCC) para el gen dfnM, SEC ID NO: 23 (mlnIF1:

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GGAAGAAAAACAGTCGAGGCGATGCTG) y 24 (mlnIRI:

GAGAAGCTCCGCCGTCACCAGTG) para el gen mini, SEC ID NO: 25 (dhbAFI: CGCCTAAAGTAGCGCCGCCATCAACGC) y 26 (dhbAR2:

CCGCGATGGAGCGGGATTATCCG) para el gen dhbA (Arguelles-Arias et al., Baciiius amyioiiquefaciens GA1 as a source of potent antibiotics and other secondary metabolites for biocontrol of plant pathogens. 2009. Microbial Cell Factories. Vol: 8, Art: 63).

Tambien se determino el patron de production de ciclolipopeptidos (incluyendo las fengicinas, iturinas, surfactinas) de los 68 aislados de Baciiius obtenidos. En primer lugar se realizo la extraction de los ciclolipopeptidos a partir del cultivo de las cepas en medio LB durante 48h a 28°C mezclando a partes iguales el sobrenadante del cultivo libre de celulas con isoamil-alcohol. Las mezclas se removieron energicamente durante 2 minutos y posteriormente se recupero la fase organica (fase superior) al centrifugar la mezcla durante 10 minutos a 10.000 rpm. Posteriormente la fase organica se evaporo mediante un evaporador (Scan Speed 40 Teflon, AAPPTEC, LCC, Louisville, USA) y se disolvio en agua destilada al 0.085 % de acido trifluoroacetico (TFA). La fase organica ya disuelta se fracciono mediante cromatografla liquida de alta presion (HPLC) utilizando el equipo Agilent Technologies 1200 Series. utilizando una columna de fase reversa Kinetex XB-C18 (Phenomenex, Madrid, Espana). La elucion se llevo a cabo en las siguientes condiciones: gradiente lineal de 2-50% de acetonitrilo conteniendo 0,085% TFA durante 18 min, gradiente lineal de 50-100% de acetonitrilo durante 4 min, a un flujo constante de 1,85 ml/min. Los compuestos eluldos se detectaron mediante absorbancia a 220 nm.

Las fracciones obtenidas se analizaron mediante dos tecnicas de espectrometrla de masas, concretamente se analizaron por MALDI-TOF utilizando el equipo Bruker Daltonics Ultraflex (Bruker Daltonics, Bruker corporation, Billerica, USA) y tambien por ESI-MS utilizando el equipo (Esquire 6000 ESI ion Trap LC/MS (Bruker Daltonics, Bruker corporation, Billerica, USA). Utilizando estas dos tecnicas en paralelo fue posible la asignacion de cada pico de elucion a cada ciclolipopeptido en base a su masa molecular. Los resultados de produccion para las 68 cepas fueron analizados mediante un analisis jerarquico utilizando la distancia euclidea al cuadrado usando el software PC-SAS (version 9.1; SAS Institute Inc., Cary, NC) (FIG. 2). Las cepas se distribuyeron en 4 grupos caracterizados por la produccion diferencial de las diferentes

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isoformas. Las cepas B. amyloliquefaciens CECT8836 y CECT8837 se agruparon en el grupo 3. Este grupo se caracteriza por agrupar cepas productoras de la mayor parte de las isoformas correspondientes a las tres familias de ciclolipopeptidos analizadas, concretamente de las fengicinas, iturinas, surfactinas. Destaca el hecho sorprendente que las cepas CECT8836 y CECT8837 producen todas las 15 isoformas de cLPs.

Las 68 cepas de Bacillus spp. tambien fueron sometidas a pruebas de actividad antimicrobiana in vitro contra ocho bacterias fitopatogenas (Erwinia amylovora PMV6076, Pseudomonas syringae pv syringae EPS94, P. syringae pv tomato DC3000, Xanthomonas axonopodis pv vesicatoria CFBP3275, X. arboricola pv. fragariae CFBP3549, Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis CECT790, Ralstonia solanacearum CECT125, Rhizobium radiobacter CECT472 y Pectobacterium carotovorum CECT225) y 5 hongos fitopatogenos (Phytophthora cinnamomi CECT2965, P. cactorum F490, Penicillium expansum EPS26, Fusarium oxysporum ATCC201829 y Pytium ultimum CECT2364), utilizando la tecnica del repicado de colonias en sobrecapa de agar Luria Bertani (LB) y agar nutritivo (AN) para las bacterias y en sobrecapa de agar patata dextrosa (PDA) para los hongos. Los halos de inhibicion del crecimiento en los indicadores se determinaron al cabo de 48 h a 28°C para las bacterias y al cabo de 4 dlas a 25°C para los hongos. Los resultados de diametro de inhibicion se normalizaron y se utilizaron para realizar un analisis jerarquico de agregacion utilizando el coeficiente de Jaccard de disimilaridad con el algoritmo UPGMA (NTSYS, Exeter, USA) (FIG. 3). Se observan 5 agrupaciones diferentes en funcion del patron de actividad antibacteriana y antifungica a un nivel de similaridad de 5, siendo el grupo G5 el que incluye las cepas mas activas, tanto a nivel de grado de actividad como de espectro de actividad contra bacterias y hongos fitopatogenos. Una vez mas y de forma inesperada, este grupo incluye las cepas CECT8836 y CECT8837. Los restantes grupos presentaron cepas con una actividad menor o con un espectro de actividad limitado a algunos patogenos o a un medio de cultivo. Por lo tanto las cepas CECT8836 y CECT8837 poseen un potente efecto antifungico y antibacteriano de amplio espectro, que las diferencia del resto de los aislados que se obtienen de fuentes naturales.

Para determinar la especie de Bacillus a la que perteneclan los 15 aislados que poselan mayor presencia de genes biosinteticos de PAMs y mayor actividad antimicrobiana y espectro, se procedio a la caracterizacion bioqulmica mediante la

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galena API® 50 CHB/E (Biomerieux, France). A partir de los cultivos puros crecidos a 28°C durante 24h, se obtuvo una suspension de la que se depositaron 200 pl en cada pocillo despues de mezclar con el medio E. Las tiras de pruebas se leyeron despues de incubar a 37°C durante 16-24h dependiendo de cada cepa. Un test positivo aparecla como rojo debido al viraje del indicador colorimetrico como consecuencia de la acidification del medio. Para la determination de la cepa se utilizo el programa API system databases APILAB Plus software version 3.3.3 (BioMemrieux, France). Las cepas QST713 y FZB42 de Bacillus amyloliquefaciens y las cepas UMAF6614 y UMAF6639 de B. subtilis se incluyeron como controles de referencia. Asl se concluyo que las cepas B. amyloliquefaciens CECT8836 y CECT8837 eran B. subtilis/B. amyloliquefaciens y se mostraron Intimamente relacionadas con las cepas de referencia.

Con el fin de identificar las cepas CECT8836 y CECT8837 a nivel de especie de una forma mas fiable, se procedio a secuenciar parcialmente el gen 16S rDNA (Romero et al., ‘Isolation and evaluation of antagonistic bacteria towards the cucurbit powdery mildew fungus Podosphaera fusca’, 2004, Applied Microbiology and Biotechnology, Vol. 64, pp. 263-269) y el gen rpoB (Ki et al. ‘Structure of a protein-DNA complex essential for DNA protection in spores of Bacillus species’, 2009, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, Vol. 105, pp. 28062811). Para ello se procedio a realizar una PCR sobre el DNA extraldo de los cultivos con los cebadores SEQ16 F-1 (SEC ID NO: 13: GCGGCGTGCCTAATACAT) y SEQ16 R-3 (SEC ID NO: 14: TAAGGTTCTTCGCGTTGCTT) para el gen 16S rDNA, y los cebadores RPOBF (SEC ID NO: 15: TCAACTAGTTCAGTATGGACGACA) y RPOBR (SEC ID NO: 16: ATGACAGTCGCGGTAAAACC) en condiciones estandar (Lane, D.J., "Nucleic acid techniques in bacterial systematics”, Stackebrandt, E., and Goodfellow, M., eds., John Wiley and Sons, New York, NY, 1991, pp. 115-175). Los productos de PCR fueron purificados, concentrados convenientemente y secuenciados mediante un secuenciador ABI PRISM™ 310 Genetic Analyzer (PE Applied Biosystems, CA, USA). Las secuencias obtenidas fueron analizadas y alineadas mediante BioEdit Sequencing Editor, y la homologla determinada mediante el programa BLAST en la base de datos NCBI database. Con esta metodologla las cepas CECT8836 y CECT8837 se identificaron como B. amyloliquefaciens. Aunque ambas cepas estan relacionadas con otras cepas de la especie Bacillus amyloliquefaciens, cabe destacar que se agrupan en un sub-grupo claramente diferenciado dentro de esta especie al analizar la

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secuencia correspondiente al gen rpoB (FIG. 4). Este resultado pone de manifiesto la singularidad de las cepas CECT8836 y CECT8837 con respecto de otras cepas conocidas de B. amyloliquefaciens.

Finalmente con el fin de diferenciar las cepas de B. amyloliquefaciens CECT8836 y CECT8837 de otras cepas de Bacillus relacionadas con el biocontrol de enfermedades de plantas, se procedio a la amplification aleatoria de ADN polimorfico, tecnica conocida por el acronimo ingles RAPDs (Random Amplification of Polymorphic DNA), que utiliza cebadores cortos arbitrarios (8-12 nucleotidos) que generan tras la PCR con un solo cebador, amplificaciones que permiten realizar tipado de cepas (Williams J G et al, "DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers”, Nucleic Acids Res., 1990, vol. 18, pp. 6531-6535). Dicho estudio se realizo mediante cultivo de las cepas en medio LB en las condiciones descritas anteriormente, extraction del DNA, y realization de PCRs mediante cebadores especlficos conocidos en el estado de la tecnica asl como los genes previamente descritos para la detection especifica de genes biosinteticos de AMPs. Los siguientes cebadores fueron utilizados: SRFAAF (SEC ID No: 1), SRFAAR (SEC ID No: 2), BMYBF (SEC ID No: 3), ITUCF (SEC ID No: 5), FENDF (SEC ID No: 7), FENDR (SEC ID No: 8), SPASF (SEC ID No: 9), SPASR (SEC ID No: 10), BACA (SEC ID No: 11) previamente descritos en el presente documento, y BOX-A1R (SEC ID No: 17:

CTACGGCAAGGCGCAGCTGACG) (De Clerk and De Vos. ‘Genotypic diversity among Bacillus licheniformis strains from various sources’, 2004, FEMS Microbiol Lett., Vol. 231, pp. 91-98) y RAPD-OPG 5 (SEC ID No: 18: CTGAGACGGA) (Daffonchio et al., ‘PCR fingerprinting of whole genomes: the spacers between the 16S and 23s rRNA genes and of intergenic tRNA gene regions reveal a different intraspecific genomic variability of Bacillus cereus and Bacillus licheniformis’, 1998, Int J. Syst. Bacteriol., Vol. 48, pp. 107-116). El mix de PCR consistio en un volumen total de 25 pl conteniendo 1x de tampon, 2 mM de dNTPs, 2,5 mM de MgCl2, 0,4 pM de cebador y 0,5 U de Taq polimerasa (Invitrogen) y 3,5 pl de DNA (25 ng/pl). Las condiciones optimizadas para la reaction de PCR fueron una fase de desnaturalizacion de 5’ a 95°C; una fase de amplificacion consistente en 5 ciclos de 1’ a 94°C, 1’ a 40°C y 1’ a 72°C y 30 ciclos de 1’ a 94°C, 1’ a 60°C y 1’ a 72°C, y finalmente una fase de elongation de 5’ a 72°C. En la FIG. 5, se puede apreciar que las cepas CECT8836 y CECT8837 se pueden diferenciar de otras cepas de referencia como FZB42 y QST713 y de cepas aisladas aleatoriamente de ambientes naturales, mediante los patrones de

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bandas obtenidas con los cebadores SRFAAF (SED ID No: 1) y SPASF (SED ID No: 9). Dichos patrones son reproducibles en las mismas condiciones experimentales para todas las cepas y por tanto son una herramienta muy util para la identification especlfica de las cepas CECT8836 y CECT8837, y su diferenciacion de otras de la misma especie.

Ejemplo 2. Preparation de cultivos de las cepas de la invention para la obtencion de suspensiones celulares concentradas o extractos del medio de cultivo.

La cepa de la invencion, preferentemente en fase exponencial de crecimiento, se inoculo en el caldo de cultivo LB a una concentration final del 3%. El medio de cultivo inoculado se incubo a 30 °C, y pH 7, bajo agitation a 500 rpm en cultivos en "batch". En cultivos en biorreactor la concentracion de oxlgeno fue del 40%. En la fase estacionaria de crecimiento, tras las 24 h del inicio del cultivo, se obtuvo una concentracion celular de 2,0 x 109 UFC/ml.

Para obtener una suspension celular concentrada y el sobrenadante del cultivo libre de celulas, el material obtenido en fase estacionaria se sometio a centrifugation a 8000 rpm durante 15 min. El sedimento que contenla las celulas y esporas se resuspendio en un pequeno volumen de tampon fosfato para obtener una suspension celular concentrada de 1010 UFC/ml. El sobrenadante resultante de la centrifugacion, libre de celulas, que contenla los componentes del medio de cultivo transformados y metabolitos producidos por la cepa, se utilizo tambien para ensayos de actividad.

Ejemplo 3. Ensayos de control de infecciones causadas por bacterias fitopatogenas en plantas mediante tratamientos preventivos con las cepas de la invencion.

Para demostrar la eficacia de las cepas de B. amyloliquefaciens de la invencion en el control de bacteriosis se realizaron ensayos con plantas en condiciones de ambiente controlado en invernadero. El estudio se realizo con los 8 aislados que mostraron mayor production de ciclolipopeptidos, presencia de genes biosinteticos de peptidos antimicrobianos y mayor espectro de actividad antagonista in vitro frente a diferentes patogenos bacterianos. Se realizaron ensayos en 4 patosistemas diferentes, concretamente se determino la capacidad de las 8 cepas en la inhibition de las infecciones causadas por P. syringae pv. syringae y E. amylovora en plantas de peral,

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por P. syringae pv. tomato en plantas de tomate y por X. axonopodis pv. vesicatoria en plantas de pimiento.

Para los ensayos con plantas de peral, se utilizaron plantas auto-enraizadas de 2 anos de edad de la variedad Conference. En este caso se utilizaron las plantas cuando presentaban brotes de 3 a 4 centlmetros conteniendo de 5 a 6 hojas jovenes por brote. Para los ensayos con plantas de tomate y pimiento, se partio de semillas certificadas sembradas en contenedores de 1 L. Las plantas se utilizaron en ambos casos al alcanzar entre 25 y 30 centlmetros de altura. En el caso del ensayo en tomate se utilizaron plantas de la variedad Rio Grande, mientras que en el ensayo en pimiento se utilizaron plantas de la variedad Dulce Italiano. En todos los casos se realizaron los tratamientos con fungicidas e insecticidas preventivos as! como la fertilization una vez por semana con una solution de 200 ppm de NPK (20:10:20).

1- Los ensayos de eficacia se basaron en tratamientos preventivos de las cepas de Bacillus. En los ensayos en peral, tanto contra E. amylovora como contra P. syringae pv. syringae, se practico una incision doble en el nervio principal de las tres hojas expandidas en cada uno brotes. Posteriormente las plantas fueron pulverizadas hasta el punto de goteo (10 mL por planta) con la correspondiente suspension de la cepa de Bacillus a 10*8 UFC/mL (obtenida en el Ejemplo 2), obtenida a partir del ajuste por absorbancia de una suspension celular en solucion Ringer 1/4 de acuerdo con un calibration realizada previamente. El material tratado fue cubierto con bolsas de plastico y mantenido a 25°C durante 24 h con un fotoperiodo de 16h luz-8 h oscuridad. Posteriormente, se procedio a inocular las heridas practicadas en las hojas con una suspension de E. amylovora EPS101 y P. syringae pv. syringae EPS31 a 10*7 UFC/ml (ambas cedidas por la Universidad de Girona, Instituto de Tecnologla Agroalimentaria, CIDSAV) (Moragrega, C.; et al. 1998. Evaluation of drench treatments with phosphonate derivatives against Pseudomonas syringae pv. syringae on pear under controlled environment conditions. European Journal of Plant Pathology 104: 171-180; Cabrefiga, J.; Montesinos, E. 2005. Analysis of aggressiveness of Erwinia amylovora using disease-dose and time relationships. Phytopathology. 95: 1430-1437).

2- El material se introdujo de nuevo en bolsas de plastico y se mantuvo a 25°C en fotoperiodo. Para el ensayo en tomate y pimiento, a diferencia de los ensayos anteriores, no se realizaron heridas mediante el corte de las hojas, sino que estas

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se generaron durante el tratamiento con las cepas de Bacillus como consecuencia de la adicion de tierra de diatomeas a la suspension bacteriana. As! el tratamiento con las cepas de Bacillus se realizo mediante pulverizacion con una suspension de la cepa de Bacillus sp. a 10*8 UFC/mL, como en el caso anterior, pero anadiendo tierra de diatomeas (1 mg/ml) a la suspension. Las plantas tratadas se incubaron a 25°C durante 24 h con un fotoperiodo de 16 h luz-8 h oscuridad. Posteriormente, se procedio a inocular los patogenos mediante pulverizacion utilizando una suspension ajustada a 10*7 UFC/ml de P. syringae pv. tomato DC3000 para el ensayo en tomate y de X. axonopodis pv. vesicatoria CFBP3275 para el ensayo en pimiento.

En todos los ensayos el diseno experimental consistio en tres repeticiones de tres plantas por tratamiento de cepa de Bacillus. Se realizaron tambien controles no tratados, un control con una cepa de Bacillus de referencia (QST713) y un control tratado con estreptomicina a 100 mg/L. Se realizaron dos experimentos independientes para cada patogeno. La intensidad de las infecciones se medio en base a una escala semi-cuantitativa que se adapto para cada uno de los patogenos debido a que los slntomas de las infecciones y la progresion de la infeccion son caracterlsticos de cada patogeno. Para P. syringae pv. syringae se utilizo una escala de 0 a 3, donde: 0, sin slntomas; 1, necrosis localizada alrededor de la herida; 2, necrosis progresiva a los nervios proximos; y 3, necrosis de toda la hoja. Para E. amylovora se utilizo una escala de 0 a 4, 0, sin slntomas; 1, necrosis alrededor del nervio central; 2, necrosis total de la hoja; 3, progresion de la infeccion a traves del peciolo; y 4, progresion de la infeccion a traves del tallo. Para P. syringae pv. tomato se utilizo una escala de 0 a 2, donde, 0, sin slntomas; 1, presencia de pocas heridas necroticas en la hoja; 2, con alta densidad de heridas necroticas en la hoja. Finalmente para X. axonopodis pv. vesicatoria se utilizo una escala de 0a3, donde: 0, sin slntomas; 1, aparicion de pocas verrugas amarillas; 2, verrugas amarillas afectando la mitad de la hoja; 3, verrugas amarillas afectando la totalidad de la hoja.

En los 4 patosistemas, la cepa CECT8836 fue la que mostro una mayor reduction de la severidad de las infecciones. Las eficacias con respecto al control no tratado (NTC) fueron muy elevadas en todos los casos, concretamente del 92,9% contra E. amyovora en peral, del 88,6% contra P. syringae pv. syringae en peral, del 62,8% contra P. syringae pv. tomato en tomate y del 66,7% contra X. axonopodis pv.

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vesicatoria en pimiento (FIG. 6). Estas eficacias fueron similares a las observadas en el control basado en estreptomicina (100 mg/L) y mejores que las observadas en el tratamiento de referencia basado en la cepa QST713 (para la que se siguio el mismo protocolo que en el Ejemplo 2), cuando esta se incluyo (FIG. 6A). La cepa CECT8837 tambien destaco por su actividad.

Ejemplo 4. Estudio de la production de peptidos antimicrobianos en diferentes medios de cultivo y condiciones de incubation.

La singularidad de las cepas CECT8836 y CECT8837, pone de manifiesto el interes en determinar la naturaleza de su actividad antagonista e inhibitoria contra los diferentes patogenos. En primer lugar, se verifico que existla actividad antimicrobiana en el extracto resultante del crecimiento en "batch” de dichas cepas en caldo LB y en medio salino modificado a 28 °C, pH 7,0 y pO2 20%, y se determino como variaba esta actividad a lo largo del proceso de cultivo. Para ello, allcuotas de los cultivos tomadas a distintos tiempos, filtrados para eliminar las celulas, fueron liofilizados y el material resultante resuspendido en agua. El extracto fue ensayado mediante la tecnica ensayo de contacto en suspension, aplicando allcuotas de 20 pl del extracto a 180 pl de una suspension ajustada a 10*8 UFC/ml de E. amylovora y P. syringae pv. syringae. Pasadas 2 horas, se procedio a la determination de la inhibition del crecimiento de cada suspension respecto al control tratado con agua. Durante la realization de las curvas de crecimiento en cultivo en "batch”, ademas de la actividad antibacteriana, tambien se determino la concentration de celulas viables, el pH y el porcentaje de esporulacion (FIG. 7). Se observo que los cultivos creclan exponencialmente llegando a concentraciones celulares de alrededor de 10*9 UFC/mL en caldo LB y alrededor de 5x10*8 UFC/mL en medio salino modificado. La actividad inhibidora del crecimiento de las bacterias fitopatogenas por parte de los extractos de cultivo se inicio durante la fase exponencial y se estabilizo a partir de las 48 horas de cultivo ya entrada la fase estacionaria. La actividad contra E. amylovora fue mayor en los extractos obtenidos a partir de los cultivos en medio salino modificado. En cuanto a la actividad contra P. syringae fue similar en ambos casos, aunque los extractos obtenidos a partir de cultivos en caldo LB fueron ligeramente mas activos que los obtenidos a partir de cultivos en medio salino modificado, en contraste con los resultados obtenidos contra E. amylovora. Estos resultados son indicativos que durante el cultivo se estan produciendo componentes con alta actividad antibacteriana, que son producidos de

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manera diferencial en funcion del medio de cultivo utilizado, y que seguramente diferentes componentes son los que definen la actividad contra cada uno de los patogenos.

Los extractos de cultivo para diferentes cepas de Bacillus, incluyendo dos cepas de referencia, concretamente FZB42 y QST713, se analizaron mediante HPLC en una columna de fase reversa tal y como se ha descrito anteriormente en el ejemplo 1 durante la identification de los ciclolipopeptidos. Esta caracterizacion permitio observar que habla picos caracterlsticos que permitlan diferenciar la cepa CECT8836 de las cepas de Bacillus de referencia (FIG. 8). Estos picos podrlan corresponder a metabolitos que estarlan relacionados con la actividad antimicrobiana mostrada por la cepa CECT8836.

Ejemplo 5. Production a escala industrial de una composition de la invention.

Para la produccion a escala industrial de composiciones con las cepas de la invencion se pueden utilizar las condiciones optimas de fermentation que se detallan a continuation mediante bioreactor de tipo CSTR en medio llquido, aunque tambien se pueden utilizar tecnicas basadas en fermentacion en medio solido, todos ellos siendo metodos estandar utilizados en la industria microbiologica.

Para determinar las condiciones optimas se utilizo un fermentador Braun Biostat de 5 litros en medio LB a 28°C, pH 7,0, pO2 20% con rampa, y agitation a 100 rpm. Se inoculo un cultivo exponencial de la cepa B. amyloliquefaciens CECT8836 al 1% y se monitorizaron los parametros operacionales del bioreactor, finalizando el crecimiento en fase estacionaria a las 12 h, consiguiendo concentraciones celulares de entre 1-2x 10*9 UFC/ml. A continuacion se centrifugo el cultivo en continuo a 8000 rpm y 10 l/h y se recogieron las celulas asepticamente mediante una centrlfuga SA-1 Westfalia- Separator. Al final de esta etapa la biomasa se concentro unas 10-12 veces, resuspendiendose en tampon fosfato, obteniendose alrededor de 0,5 litros de concentrado 2-4x10*10 UFC/ml. Posteriormente al concentrado se le anadio un ingrediente osmoprotector inerte (lactosa 15%) y se deshidrato en un Liofilizador Virtis en condiciones estandar durante 36 h, obteniendose unos 40-50 g de peso seco (15% materia activa), con una concentration de 1x10*11 UFC/g p.s (FIG. 9). En dichas condiciones se obtiene un producto con una viabilidad de las celulas cercana al 100 %,

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estable y facil de almacenar y manejar, que a las dosis operativas de 108 UFC/ml permite preparar unos 100 litros de producto listo para ser aplicado en las plantas de cultivo a proteger. Posteriormente se envaso el material en bolsas hermeticas al vaclo, que conservadas a 4°C mantienen durante mas de un ano su vida util.

Ejemplo 6. Colonization de la superficie de plantas por la cepa CECT8836 en condiciones de campo.

Se estudio la capacidad de la cepa CECT8836 para colonizar y sobrevivir en hojas de remolacha y coliflor en condiciones de campo. Esta propiedad es muy importante para proteger las principales vlas de entrada de infecciones fungicas y bacterianas en las plantas. Para ello, a cepa CECT8836 fue cultivada en "batch” en caldo LB a 28°C, pH 7,0, pO2 20% hasta alcanzar una concentration de 5x10*9 UFC/mL (aproximadamente durante 24 h). Las celulas se recogieron por centrifugation y se resuspendieron en solution Ringer 1/4, hasta conseguir una concentracion de 1x10*8 UFC/mL. Con el fin de disponer de un sistema para el analisis especlfico de las cepas durante el experimento de colonizacion y evitar la interferencia de microbiota autoctona que pudiera quedar tras la desinfeccion, se obtuvieron mutantes espontaneos resistentes a rifampicina (cepa CECT8836R), de modo que esta propiedad se utilizo como herramienta de contra-seleccion en el recuento de viables en placa anadiendo los correspondientes antibioticos al agar. Estos mutantes espontaneos se obtuvieron sembrando una cantidad de 109 UFC en una placa de agar que contenla rifampicina (100 microgramos/ml), incubando a 30 °C durante 48 h. De las colonias resistentes a rifampicina que creclan en dicho medio se purifico una de ellas mediante aislamiento con el metodo de dilution por "agotamiento del asa de siembra" y se verifico su identidad comparando con la cepa salvaje CECT8836. La identidad se confirmo mediante, marcadores moleculares (genes 16S rDNA y rpo, genes biosinteticos de peptidos antimicrobianos srfAA, bacA, bmyB, fenD, spaS e ituC), espectro de actividad in vitro contra las bacterias y hongos fitopatogenos de la FIG. 3.

Los ensayos se realizaron en fincas comerciales localizadas en la provincia de Valladolid en el caso de remolacha, y en la provincia de Valencia en el caso de coliflor. El diseno experimental consistio en 4 bloques aleatorizados. Juntamente con los bloques correspondientes al tratamiento con la cepa CECT8836 se incluyeron los mismos bloques para el tratamiento control basado solo en agua. La aplicacion de la

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cepa CECT8836 se realizo mediante un pulverizador de mochila a 10 bar de presion y a 1000 L/ha de volumen de aplicacion. Los niveles poblacionales se determinaron justo despues de la aplicacion y posteriormente pasados 20 y 30 dlas del tratamiento. Para la determination de los niveles poblacionales se recolectaron 6 hojas de diferentes plantas para cada bloque experimental y una vez en el laboratorio las hojas correspondientes a cada bloque se homogeneizaron conjuntamente en tampon fosfato peptonado neutro mediante un agitador de palas. Los homogeneizados obtenidos de las hojas, que contenlan las celulas de la cepa CECT8836 inoculada se diluyeron adecuadamente y las diluciones se sembraron utilizando un sistema automatico de siembra en espiral sobre placas de agar LB suplementadas con rifampicina 100 mg/L. Para el recuento de bacterias totales en el control no tratado los extractos se sembraron en LB sin dicho antibiotico. Una vez sembrados los extractos, las placas se incubaron a 28°C durante 48 h y se contaron las colonias mediante un sistema de recuento automatico. La dinamica poblacional de la cepa CECT8836 fue similar tanto en remolacha como en coliflor (FIG. 10). En ambos casos los niveles poblacionales decrecieron en 10 y 100 veces pasados 20 dlas y a partir de ese momento se mantuvieron estables pasados 30 dlas. Estos resultados confirman la capacidad de la cepa de la invention en la colonization o supervivencia en organos de plantas con unos niveles que serlan suficientemente altos para conseguir un control adecuado de las posibles infecciones.

Ejemplo 7. Capacidad de control de enfermedades fungicas y bacterianas en condiciones de campo por la cepa CECT8836.

El primer ensayo en condiciones de campo se realizo en coliflor para el control de Hyaloperonospora brassicae, que causa el mildiu de la coliflor. El tratamiento con la suspension de la cepa CECT8836 consistio en el producto formulado en lactosa 15% re-suspendido en agua para obtener una concentration final de 5x10*7 UFC/ml. En el ensayo se incorporo un control no tratado y un control basado en un compuesto cuprico aplicado a la concentracion sugerida por el fabricante. Se realizaron un total de 3 aplicaciones mediante pulverization con la cepa CECT8836 en intervalos de 20 dlas mientras que 5 aplicaciones con el producto cuprico con una cadencia de entre 10 y 15 dlas. El diseno experimental consistio en 4 bloques aleatorizados de 15 m2 con 25 plantas por bloque. Al final del ensayo se determino la eficacia del tratamiento basado en la cepa CECT8836 en comparacion con el tratamiento basado en el compuesto

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cuprico. En este ensayo no se inoculo el patogeno de forma artificial sino que las infecciones fueron producidas por inoculo ya presente en la zona del ensayo. La evaluation de la severidad se hizo calculando el porcentaje de superficie foliar afectada por la infection del hongo.

El segundo ensayo en condiciones de campo se realizo en remolacha y se focalizo en el control de Cercospora beticola causante del cercosporiosis o mancha de la hoja de la remolacha. El tratamiento con la suspension de la cepa CECT8836 consistio en el producto formulado en lactosa 15% re-suspendido en agua para obtener una concentration final de 5x10*7 UFC/ml. En el ensayo se incorporo un control no tratado y un tratamiento en base a un compuesto cuprico aplicado a la dosis sugerida por el fabricante. Se realizaron un total de 3 aplicaciones con la cepa CECT8836 en intervalos de 20 dlas mientras que 5 aplicaciones con el producto cuprico con una cadencia de entre 10y15 dlas. El diseno experimental consistio en 4 bloques aleatorizados de 28 m2 con 150 plantas. En este caso tampoco se realizo inoculation artificial del patogeno.

Finalmente, se realizo un tercer ensayo en condiciones de campo en este caso focalizado contra una bacteria, concretamente contra Erwinia amylovora que causa el fuego bacteriano de las rosaceas. El ensayo se realizo en una parcela de peral de la variedad Conference situada en la Tallada d’Emporda dentro de la estacion experimental Mas Badia. Los tratamientos consistieron en la aplicacion por pulverization de la suspension de la cepa CECT8836 a una dosis de 10*8 UFC/mL diluida con agua o con el sobrenadante del cultivo (extracto) libre de celulas. En el ensayo se incorporo tambien un control tratado con estreptomicina (100 mg/L) y un control no tratado.

Todos los tratamientos se realizaron en condiciones de campo. Transcurridos dos dlas de los tratamientos, se recolectaron las flores tratadas en campo y se colocaron de forma individualizada dentro de tubos eppendorf para su inoculacion en condiciones controladas de laboratorio. Una vez colocadas todas las flores en gradillas se inocularon con la cepa EPS101 de E. amylovora por deposition de 10 mL de una suspension bacteriana ajustada a 10*7 UFC/mL. Las flores se cubrieron con bolsas de forma hermetica y se incubaron durante 7 dlas a 23 °C y humedad relativa del 100%.

Tras este perlodo de incubacion se determino la intensidad de las infecciones producidas por E. amylovora en las flores.

En los tres ensayos se observo que la cepa CECT8836 redujo significativamente la 5 intensidad de las infecciones producidas por los 3 patogenos (FIG. 11). En el caso de los hongos, concretamente H. brassicae y Cercospora beticola, el tratamiento con la cepa CECT8836, ademas de reducir significativamente la severidad de las infecciones, presento unos niveles de eficacia similares a los observados en los tratamientos con productos cupricos. En el caso del ensayo contra E. amylovora en peral, se observo 10 que los tratamientos basados en la cepa CECT8836 redujeron significativamente la severidad de las infecciones producidas por E. amylovora en las flores con respecto al control no tratado. Ademas ambos tratamientos basados en la cepa CECT8836 presentaron una eficacia similar o superior a la observada con el tratamiento de referencia realizado con estreptomicina. Cabe destacar que el tratamiento consistente 15 en la cepa CECT8836 diluida con el extracto del cultivo libre de celulas, presento una eficacia muy elevada, incluso superior a la presentada por el tratamiento con estreptomicina, poniendo de manifiesto la existencia de metabolitos con actividad antibacteriana en el extracto de crecimiento que mejoran la actividad de la cepa sola.

Claims (14)

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   REIVINDICACIONES

   1. Cepa de Bacillus amyloliquefaciens depositada en la Coleccion Espanola de Cultivos Tipo (CECT) con el numero de acceso CECT8836, o un mutante de la misma, donde dicho mutante se obtiene utilizando la cepa Bacillus amyloliquefaciens CECT8836 y ademas mantiene las siguientes caracterlsticas de la cepa de partida: (a) actividad antagonista frente a las bacterias Erwinia amylovora, Pseudomonas syringae pv syringae, P. syringae pv tomato, Xanthomonas axonopodis pv vesicatoria, X. arboricola pv fragariae, Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis, Ralstonia solanacearum, Rhizobium radiobacter, Pectobacterium carotovorum, y a los hongos Phytophthora cinnamomi, P. cactorum, Penicillium expansum, Botrytis cinerea, Fusarium oxysporum y Pytium ultimum; y (b) la capacidad de colonizar o sobrevivir en una parte aerea de una planta.
2. 2. Uso de la cepa Bacillus amyloliquefaciens CECT8836 o de un mutante de la misma segun se define en la reivindicacion 1, como plaguicida en plantas.
3. 3. Uso segun la reivindicacion 2, para la prevencion, curacion o erradicacion de una enfermedad causada por un patogeno fungico o bacteriano en una planta.
4. 4. Procedimiento de obtencion de una suspension de celulas viables derivadas de una cepa Bacillus amyloliquefaciens CECT8836 o de un mutante de la misma segun se define en la reivindicacion 1, comprendiendo el procedimiento: (i) inocular la cepa en un medio de cultivo y (ii) someter el medio de cultivo inoculado de la etapa (i) a condiciones adecuadas para el crecimiento de la cepa.
5. 5. Extracto libre de celulas derivado de una cepa de Bacillus amyloliquefaciens CECT8836 o de un mutante de la misma, segun se define en la reivindicacion 1, dicho extracto siendo obtenible mediante un procedimiento que comprende:

   (i) inocular la cepa en un medio de cultivo apropiado,

   (ii) someter el medio de cultivo inoculado a condiciones de crecimiento adecuadas,

   (iii) separar las celulas del medio de cultivo de la etapa (ii),

   (iv) recoger extracto libre de celulas; y

   (v) opcionalmente someter el extracto libre de celulas a un proceso de concentration.

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6. 6. Extracto de Bacillus amyloliquefaciens CECT8836 o de un mutante de la misma, segun la reivindicacion 5, donde el proceso de concentration de la etapa (v) se lleva a cabo mediante deshidratacion, filtration, ultrafiltracion, centrifugation, precipitation o cromatografla.
7. 7. Composition que comprende la cepa Bacillus amyloliquefaciens CECT8836 o un mutante de la misma segun se define en la reivindicacion 1, o un extracto segun se define en la reivindicacion 5, y uno o mas compuestos aceptables a nivel agricola.
8. 8. Composicion segun la reivindicacion 7, donde el uno o mas compuestos aceptables a nivel agricola se selecciona del grupo que consiste en fitofortificantes, nutrientes, humectantes, compuestos que mejoran la adherencia, compuestos tamponadores, estabilizantes, antioxidantes, osmoprotectores y protectores solares.
9. 9. Composicion segun cualquiera de las reivindicaciones 7-8 que comprende al menos un plaguicida adicional.
10. 10. Composicion segun la reivindicacion 9 donde el plaguicida adicional se selecciona del grupo que consiste en una cepa bacteriana con actividad antifungica y/o antibacteriana, un fungicida, un insecticida o un nematicida.
11. 11. Composicion segun la reivindicacion 9, en donde el plaguicida adicional es la cepa de Bacillus amyloliquefaciens CECT8837.
12. 12. Uso de la composicion segun cualquiera de las reivindicaciones 7-10 como plaguicida en una planta.
13. 13. Uso segun la reivindicacion 12 para el control de patogenos fungicos y bacterianos en una planta.
14. 14. Metodo para el control de una infection causada por un patogeno fungico o bacteriano en una planta que comprende la administration de la cepa o mutante de la

    misma segun se define en la reivindicacion 1, el extracto segun se define en cualquiera de las reivindicaciones 5-6, o la composition segun se define en cualquiera de las reivindicaciones 7-11, a la planta.