CN117778610A - 一种检测稻瘟病菌3个遗传类群的pcr检测引物组合及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，具体公开了一种检测稻瘟病菌3个遗传类群的PCR检测引物组合及其应用。本发明检测稻瘟病菌3个遗传类群的PCR检测引物组合包括5条引物，所述5条引物分别为Clade1‑44‑F、Clade‑44‑R、Clade23‑44‑F、Clade3‑45‑F和Clade‑45‑R，所述5条引物的核苷酸序列分别如SEQ ID No.1‑5所示。本发明可实现快速高效的稻瘟病菌群体结构组成分析，进而实现低成本、高频次和高覆盖率的时空动态监测，对水稻的安全生产具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及一种检测稻瘟病菌3个遗传类群的PCR检测引物组合及其应用。
背景技术
由丝状真菌稻瘟病菌Magnaporthe oryzae引起的稻瘟病是水稻最具毁灭性的病害之一，其发生和流行严重制约水稻的安全生产，可导致水稻叶片、茎秆和穗部的枯死，严重影响水稻的产量和品质。目前，利用抗病基因和种质资源培育并推广抗性品种是防治水稻稻瘟病最经济有效的措施。然而，水稻品种在生产上大面积推广3-5年后，抗性通常会出现下降甚至完全丧失的现象，这与稻瘟病菌群体遗传结构复杂以及频繁变异密切相关。从分子水平加强对稻瘟病菌群体结构的时空动态监测，对于揭示该病害流行与演化变异规律、抗病品种的选育、合理布局与轮换抗病品种、延长抗病品种的使用寿命，以及有效防治该病害均具有重要指导意义。已有研究证实中国南方稻区稻瘟病菌可划分为3个遗传类群(文献1：Zhong Z,Chen M,Lin L,et al.Population genomic analysis of the riceblast fungus reveals specific events associated with expansion of three mainclades[J].The ISME journal,2018,12(8):1867-1878；文献2：中国专利CN117004755A)，对稻瘟病菌遗传类群的时空动态监测，对病菌防治具有积极意义。
稻瘟病菌群体监测主要包括分别基于致病型、分子标记技术和测序技术的分析方法，但这些传统方法通常涉及病样的采集、单孢菌株的分离、保存与扩大培养、室内人工接种、菌株基因组DNA提取、分子标记检测或测序、生物信息学分析等繁琐过程，工作量大、耗时长且费用较高，难以实现大规模稻瘟病菌群体的时空动态监测。
实时荧光定量PCR(Real-time fluorescence quantitative polymerase chainreaction，qPCR)是指在PCR反应体系中加入荧光基团(染料和探针)，荧光信号的增加与PCR产物增加完全同步。通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而对起始模板定性及定量的分析。qPCR技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且整个PCR过程可实现自动化，且耗时短，操作方便，易于标准化和推广，在分子诊断、医药、检验检疫和农业等领域有广阔的应用场景。有望成为稻瘟病菌群体监测的有效手段。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种简便、有效检测稻瘟病菌3个遗传类群的引物组合及其应用。
为了实现该目的，本发明的技术方案如下：
第一方面，本发明提供检测稻瘟病菌3个遗传类群的PCR检测引物组合，所述引物组合包括5条引物，所述5条引物分别为Clade1-44-F、Clade-44-R、Clade23-44-F、Clade3-45-F和Clade-45-R，所述5条引物的核苷酸序列分别如SEQ ID No.1-5所示。
本发明研究发现，以Clade23-44-F/Clade-44-R，Clade1-44-F/Clade-44-R，Clade3-45-F/Clade-45-R 3组引物对进行检测，即可实现待测稻瘟病菌的分群。
本发明所指稻瘟病菌3个遗传类群是依据全基因组SNP标记基因分型和生物信息学分析进行划分的，具体方法可参见中国专利CN117004755A。
以引物对Clade1-44-F/Clade-44-R进行扩增后，可判断待测稻瘟病菌是否属于I群；以引物对Clade23-44-F/Clade-44-R进行扩增后，可判断待测稻瘟病菌是否属于II或III群；以引物对Clade3-45-F/Clade-45-R进行扩增后，可判断待测稻瘟病菌是否属于III群。
第二方面，本发明提供引物组合在制备检测稻瘟病菌3个遗传类群的检测试剂或试剂盒中的应用。
第三方面，本发明提供含有上述引物组合的试剂。
第四方面，本发明提供含有上述引物组合的试剂盒。
本发明的试剂盒可为基于SYBR染料法的荧光定量PCR试剂盒，其中包含荧光染料等本领域常规进行荧光定量PCR的组分。
第五方面，本发明提供上述引物组合或试剂或试剂盒在稻瘟病菌群体结构的时空动态监测中的应用。
本发明可通过对某一地区的稻瘟病菌群体的类型构成确认，针对性地种植相应的抗病水稻品种，从而实现稻瘟病菌的防治。
第六方面，本发明提供一种检测稻瘟病菌3个遗传类群的方法，以待测样品的DNA作为模板，利用上述引物组合进行普通PCR扩增或荧光定量PCR扩增。
本发明的方法中，在进行普通PCR扩增时，若以引物对Clade1-44-F/Clade-44-R进行扩增后出现50bp特异性目标条带，则判断所述待测样品属于I群；若以引物对Clade23-44-F/Clade-44-R进行扩增后出现50bp特异性目标条带，则判断所述待测样品属于II或III群；若以引物对Clade3-45-F/Clade-45-R进行扩增后出现126bp特异性目标条带，则判断所述待测样品属于III群。
本发明普通PCR扩增的反应体系，每10uL包括：DNA模板10～200ng，PCR Mix 5uL，浓度为10uM的正向和反向引物各0.2uL，余量为H2O；反应程序：95℃预变性10min；95℃变性30s，56℃退火30s,72℃延伸40s，扩增30个循环。
本发明的方法中，在进行荧光定量PCR扩增时，若以引物对Clade1-44-F/Clade-44-R进行扩增后出现荧光信号，则判断所述待测样品属于I群；若以引物对Clade23-44-F/Clade-44-R进行扩增后出现荧光信号，则判断所述待测样品属于II或III群；若以引物对Clade3-45-F/Clade-45-R进行扩增后出现荧光信号，则判断所述待测样品属于III群。
第七方面，本发明提供一种基于实时荧光定量PCR技术的稻瘟病菌群体结构组成的原位检测方法，其包括以下步骤：
1)建立标准曲线：取已知浓度的I群、II群和III群稻瘟病菌标准品DNA进行稀释，获得多个浓度梯度(如，可按10倍梯度稀释获得4个浓度梯度)的标准品，以所述标准品为模板，进行实时荧光定量PCR扩增，以模板浓度的对数值为横坐标，以每个反应孔的荧光值达到所设阈值(Ct值)经历的循环数为纵坐标，制作标准曲线，得到标准曲线公式；
2)采集目标区域待测的稻瘟病侵染的水稻(叶片或穗颈或谷粒)组织，提取基因组总DNA；
3)以步骤2)中的基因组总DNA为模板，进行实时荧光定量PCR扩增；同时，分别以稻瘟病菌标准品DNA和去离子水为阳性对照样本和阴性对照样本进行实时荧光定量PCR扩增；
4)扩增曲线分析：根据步骤3)收集得到的荧光信号及Ct值，与步骤1)获得标准曲线对比，进行线性拟合判断待测样品中稻瘟病菌I群、II群和III群的绝对含量，进而明确该目标区域稻瘟病菌群体的结构组成；
所述实时荧光定量PCR扩增时所用的引物如上所述。
优选，步骤1)中稻瘟病菌标准品来源于中国南方稻区；
优选，步骤1)中稻瘟病菌标准品DNA浓度为50ng.μl-1；
步骤1)中I群稻瘟病菌荧光定量PCR标准曲线公式为y＝-3.449x+28.073；II/III群稻瘟病菌荧光定量标准曲线公式为y＝-3.514x+28.925；III群稻瘟病菌荧光定量PCR标准曲线公式为y＝-3.126x+28.393。
步骤2)中待测样品的总DNA提取使用CTAB法。
优选，所述实时荧光定量PCR扩增的每20uL反应体系(更优选反应体系为20uL)，其中样品DNA添加10～200ng，qPCR Mix添加10uL，浓度为10uM的正向和反向引物分别添加0.4uL，添加ROX Dye(100×)0.2uL，余量为H2O。反应程序为：95℃预变性10min；95℃变性10s，60℃退火延伸30s并采集荧光，扩增40个循环。
本发明的有益效果至少在于：
本发明提供了一种用于检测I群、II/III群和III群的特异性上下游PCR引物序列，可以稻瘟病侵染的水稻组织为样本进行PCR检测，实现快速高效的稻瘟病菌群体结构组成分析，进而实现低成本、高频次和高覆盖率的时空动态监测，对水稻的安全生产具有重要意义。
本发明优选以荧光定量PCR方法进行检测，所设计的PCR检测引物经过多序列分析和多次实验验证，具有特异性好，灵敏度好，快速高效，成本低等特点。可有效检测稻瘟病菌I群、II/III群、III群；检测的最低值可达到0.05ng.μL-1；检测没有后处理，不用电泳、拍照，实时缩短了反应时间。
附图说明
图1为本发明实施例1中PCR凝胶电泳结果，图中1，2，3分别代表I，II，III群稻瘟病菌DNA样品；P1，P2，P3，P4分别代表以引物对Clade23-44-F/Clade-44-R，Clade1-44-F/Clade-44-R，Clade12-45-F/Clade-45-R，Clade3-45-F/Clade-45-R扩增的结果；各图中的第一泳道为天根生物100bp DNA分子量标准(MD109)。
图2为本发明实施例1中，引物对Clade1-44-F/Clade-44-R，Clade23-44-F/Clade-44-R和Clade3-45-F/Clade-45-R的熔解曲线分析结果。图中a-c分别为以引物对Clade1-44-F/Clade-44-R，Clade23-44-F/Clade-44-R和Clade3-45-F/Clade-45-R扩增I群、II和III群以及III群稻瘟病菌的荧光定量PCR后的熔解曲线。
图3为为本发明实施例2中的定量标准曲线，图中a，b，c分别为以引物对Clade1-44-F/Clade-44-R，Clade23-44-F/Clade-44-R和Clade3-45-F/Clade-45-R进行标准品扩增的标准曲线，图中曲线附近的“〇”代表标准品检测结果。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到或按本领域常规方法制备。
本发明中，I群和II群菌株来自湖南长沙浏阳，III群菌株来自贵州遵义湄潭，均可获得自袁隆平农业高科技股份有限公司。各菌株通过全基因组标记进行归属群确认，具体方法参见中国专利CN117004755A。
实施例1引物设计
一、基于SNP的引物设计
本实施例根据稻瘟病菌3个群的SNP位点差异，结合可区分稻瘟病菌3个群的SNP位点侧翼的核苷酸序列，基于等位基因特异性PCR引物设计原则，设计上下游引物，引物信息如下表1所示。
表1
| 引物名称 | 引物序列(SEQ ID No.1-6) |
| Clade1-44-F | CCTCGGAATGGACGTACTTTgT |
| Clade-44-R | TTACTCGCTTCATGTTCCGTCTTA |
| Clade23-44-F | CCTCGGAATGGACGTACTTTgG |
| Clade3-45-F | TCCAGTTGCCAAGGAACgAG |
| Clade-45-R | AGAGGTTATCAAGTCGTACAACGG |
| Clade12-45-F | TCCAGTTGCCAAGGAACgAC |
二、引物特异性检测
提取未发稻瘟病的水稻叶片组织以及I、II、III群稻瘟病菌分别侵染的水稻叶片组织的基因组总DNA，并以ddH2O为空白对照。
分别以上述提取的基因组DNA为模板，利用上述表1引物进行普通PCR扩增以及荧光定量PCR扩增，PCR结束后，分别对PCR产物进行PAGE凝胶电泳分型以及熔解曲线分析，其中熔解曲线分析从55～95℃按每0.5℃/10s测定吸光值，确定PCR是否为特异性扩增。
普通PCR扩增的10uL反应体系包括：DNA模板10～200ng，PCR Mix 5uL，浓度为10uM的正向和反向引物各0.2uL，余量为H2O；反应程序：95℃预变性10min；95℃变性30s，56℃退火30s,72℃延伸40s，扩增30个循环。
实时荧光定量PCR扩增的反应体系为20uL，其中样品DNA添加10～200ng，qPCR Mix添加10uL，浓度为10uM的正向和反向引物分别添加0.4uL，添加ROX Dye(100×)0.2uL，用H2O补足体系到20uL。反应程序为：95℃预变性10min；95℃变性10s，60℃退火延伸30s并采集荧光，扩增40个循环，采用伯乐CFX96荧光定量PCR仪进行扩增。
PCR凝胶电泳结果如图1所示，引物对Clade1-44-F/Clade-44-R(P2)可特异性扩增I群样品，而无法扩展II，III群样品，而引物对Clade23-44-F/Clade-44-R(P1)则特异性扩展II，III群样品，而无法扩增I群样品。引物对Clade3-45-F/Clade-45-R(P4)可特异性扩展III群样品，而无法扩增I，II群样品，而Clade12-45-F/Clade-45-R(P3)可特异性扩增I，II群样品，而无法扩增III群样品，说明本发明引物均能特异性扩增对应的稻瘟病菌群。
荧光定量PCR扩增结果如图2所示，图中，a-c分别为以引物对Clade1-44-F/Clade-44-R，Clade23-44-F/Clade-44-R和Clade3-45-F/Clade-45-R扩增I群、II/III群、III群稻瘟病菌的荧光定量PCR后的熔解曲线。针对每组引物对，均以20个菌株对其扩增效果进行验证，各图中每个峰均代表不同菌株的检测结果。从各图结果可知，每组引物对检测时均只形成一个特异峰，表明没有非特异性产物的扩增和引物二聚体。
实施例2检测病圃稻瘟病病原菌群体结构组成的定量体系建立
一、建立标准曲线
取已知浓度的I群、II群和III群稻瘟病菌将其浓度调整至50ng/ul，再按照10倍梯度稀释至5ng/ul，0.5ng/ul，0.05ng/ul作为标准品。以上述标准品(Standard)为模板，每个样品3个重复进行实时荧光定量PCR，以模板浓度的对数值为横坐标，以每个反应孔的荧光值达到所设阈值(Ct值)经历的循环数为纵坐标，制作标准曲线。分别以表1中各对引物按照实施例1中记载的PCR条件进行扩增，分别得到对应群体样品的定量标准曲线(图3)。上述梯度中，在线性关系中的最小浓度即为标准曲线分析的灵敏度。
二、稻瘟病菌样品的定量检测验证
分别取已知群体类型的I群、II群和III群的菌株DNA样品各1个，将样品DNA浓度定量至50ng/ul，按照不同体积比例对I群、II群和III群样品DNA进行混合，获得4个混合样品，样品体积配比如下表2所示。
表2
| 样品 | I群(ul) | II群(ul) | III群(ul) |
| S1 | 20 | 20 | 20 |
| S2 | 10 | 20 | 40 |
| S3 | 40 | 20 | 10 |
| S4 | 10 | 40 | 20 |
利用上述实施例1中记载的引物和荧光定量PCR方法分别对S1，S2，S3和S4样品进行定量检测，定量检测结果如下表3所示，其中定量浓度为利用标准曲线通过Ct值测定获得的浓度，实际浓度为根据样品混合比例计算的浓度值，结果的检测值和理论值不存在显著差异，表明本发明的定量体系可用于稻瘟病菌群体结构的定量分析。
表3
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.检测稻瘟病菌3个遗传类群的PCR检测引物组合，其特征在于，所述引物组合包括5条引物，所述5条引物分别为Clade1-44-F、Clade-44-R、Clade23-44-F、Clade3-45-F和Clade-45-R，所述5条引物的核苷酸序列分别如SEQ ID No.1-5所示。
2.权利要求1所述的引物组合在制备检测稻瘟病菌3个遗传类群的试剂或试剂盒中的应用。
3.含有权利要求1所述的引物组合的试剂。
4.含有权利要求1所述的引物组合的试剂盒。
5.权利要求1所述的引物组合或权利要求3所述的试剂或权利要求4所述的试剂盒在稻瘟病菌群体结构的时空动态监测中的应用。
6.一种检测稻瘟病菌3个遗传类群的方法，其特征在于，以待测样品的DNA作为模板，利用权利要求1所述的引物组合进行普通PCR扩增或荧光定量PCR扩增。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在进行普通PCR扩增时，若以引物对Clade1-44-F/Clade-44-R进行扩增后出现特异性目标条带，则判断所述待测样品属于I群；若以引物对Clade23-44-F/Clade-44-R进行扩增后出现特异性目标条带，则判断所述待测样品属于II或III群；若以引物对Clade3-45-F/Clade-45-R进行扩增后出现特异性目标条带，则判断所述待测样品属于III群。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在进行荧光定量PCR扩增时，若以引物对Clade1-44-F/Clade-44-R进行扩增后出现荧光信号，则判断所述待测样品属于I群；若以引物对Clade23-44-F/Clade-44-R进行扩增后出现荧光信号，则判断所述待测样品属于II或III群；若以引物对Clade3-45-F/Clade-45-R进行扩增后出现荧光信号，则判断所述待测样品属于III群。
9.一种基于实时荧光定量PCR技术的稻瘟病菌群体结构组成的原位检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)建立标准曲线：取已知浓度的I群、II群和III群稻瘟病菌标准品DNA进行稀释，获得多个浓度梯度的标准品，以所述标准品为模板，进行实时荧光定量PCR扩增，以模板浓度的对数值为横坐标，以每个反应孔的荧光值达到所设阈值经历的循环数为纵坐标，制作标准曲线，得到标准曲线公式；
2)采集目标区域待测的稻瘟病侵染的水稻组织，提取基因组总DNA；
3)以步骤2)中的基因组总DNA为模板，进行实时荧光定量PCR扩增；同时，分别以稻瘟病菌标准品DNA和去离子水为阳性对照样本和阴性对照样本进行实时荧光定量PCR扩增；
4)扩增曲线分析：根据步骤3)收集得到的荧光信号及Ct值，与步骤1)获得标准曲线对比，进行线性拟合判断待测样品中稻瘟病菌I群、II群和III群的绝对含量，进而明确该目标区域稻瘟病菌群体的结构组成；
所述实时荧光定量PCR扩增时所用的引物如权利要求1所述。
10.根据权利要求9所述的原位检测方法，其特征在于，所述实时荧光定量PCR扩增的每20uL反应体系包括：DNA模板10～200ng，qPCR Mix 10uL，浓度为10uM的正向和反向引物各0.4uL，ROX Dye(100×)0.2uL，余量为H2O；
所述实时荧光定量PCR的反应程序为：95℃预变性10min；95℃变性10s，60℃退火延伸30s并采集荧光，扩增40个循环。
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