CN110408575A - 一种解淀粉芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

一种解淀粉芽孢杆菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种解淀粉芽孢杆菌及其应用，涉及微生物领域。本发明公开的解淀粉芽孢杆菌，其保藏编号为GDMCC No：60368。该解淀粉芽孢杆菌具有产酸溶蛋白的特性，且产量较高，可以用于到液体发酵工艺中，提高产物的酸溶蛋白含量，该菌以及其产物可以用于制备成饲料或饲料添加剂，提高饲料利用率，有助于提高所饲养动物的成活率和增强机体的免疫力。

Description

一种解淀粉芽孢杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及微生物领域，具体而言，涉及一种解淀粉芽孢杆菌及其应用。
背景技术
以菌体作为饲料添加剂，在应用时要求其以活的形式进入动物肠道中，只有当芽孢杆菌在肠道中萌发、增殖及分泌代谢产物后，才可能真正起到益生效果，还需要一定时间的持续摄入才可达到益生效果。最终是以间接的方式促进动物生长和提高动物免疫力。且在动物体内的定植效果因动物个体区别而有较大差异。当动物受外界影响时，例如抗生素、抗菌药物、化学消毒药物等的使用能杀死或抑制有益菌群，造成肠道菌群的紊乱，降低微生态制剂的效果。
固体发酵过程中不易搅拌，物质无法达到均匀，因此不易得到高含量的产品；pH值、湿度、基质浓度不易调控，每批次发酵条件不易一致，再现性差，质量不稳定；通常采用开放式发酵池且培养时间较长，容易被杂菌污染。
现有菌种发酵产酸溶蛋白含量较低。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的之一在于提供了一种解淀粉芽孢杆菌，该解淀粉芽孢杆菌具有产酸溶蛋白的特性，且产量较高，可以用于到液体发酵工艺中，提高产物的酸溶蛋白含量，该菌以及其产物可以用于制备成饲料或饲料添加剂，提高饲料利用率，有助于增强机体的免疫力。
本发明是这样实现的：
一方面，本发明提供了一种解淀粉芽孢杆菌，其保藏编号为GDMCC No：60368。
本发明提供的解淀粉芽孢杆菌于2018年5月3日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址：广州市先烈路100号大院59号楼5楼，分类学命名为Bacillusamyloliquefaciens，保藏编号为GDMCC No：60368，菌株命名为：Bacillusamyloliquefaciens YN-Ba2014。
酸溶蛋白是指分子量较低的蛋白水解物，包括肽和游离氨基酸，主要是可溶于酸性(三氯乙酸)溶液的蛋白，故又名三氯乙酸可溶蛋白。酸溶蛋白可以被肠道直接吸收，有利于增强机体免疫力，是蛋白类饲料原料的重要指标之一，用于衡量蛋白类饲料原料的营养价值高低和品质好坏。
本发明的发明人首次发现，本发明提供的解淀粉芽孢杆菌具有高产酸溶蛋白的特征，经实验验证，采用该解淀粉芽孢杆菌发酵培养的发酵产物中酸溶蛋白含量在45％以上。
本发明提供的解淀粉芽孢杆菌发酵的发酵产物可以用于饲料领域，制备高含量酸溶蛋白的发酵型饲料，提高终产品中的酸溶蛋白含量，进而提高饲料品质，提高饲料利用率，有助于提高所饲养动物的成活率和增强机体的免疫力。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述解淀粉芽孢杆菌的16S rDNA的碱基序列如SEQ ID NO.1所示，具体如下所示：
TGCTATACATGCAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGCTTGTTTGAACCGCATGGTTCAGACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAATAGGGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTAGGAGCCAGCCGCCGAAGTGGACCAGATGT。
该解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens YN-Ba2014)的16S rDNA如SEQID NO.1所示，其与最接近的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的同源性为99.72％，采用特异性引物扩增产生唯一的扩增产物，条带大小与解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)相同。其形态特征以及生理生化特征特性与解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)相似。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述解淀粉芽孢杆菌具有如下形态特征：
芽孢偏端生或中生，芽孢呈椭圆形，菌体单个或成对排列。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述解淀粉芽孢杆菌还具有图1所示的生理生化特征。
可以看出，本发明提供的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens YN-Ba2014)可在最高40℃的环境下生长，可耐受pH5.7的酸性环境，盐浓度最高可耐受7％。
另一方面，本发明提供了如上所述的解淀粉芽孢杆菌在提高酸溶蛋白含量中的应用。
另一方面，本发明提供了如上所述的解淀粉芽孢杆菌在制备饲料或饲料添加剂中的应用。
另一方面，本发明提供了一种培养物，其由如上所述的解淀粉芽孢杆菌培养得到。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，培养物中的酸溶蛋白含量大于或等于45％。
另一方面，本发明提供了一种高含量酸溶蛋白培养物的制备方法，其包括：将如上所述的解淀粉芽孢杆菌接种至培养基中发酵培养。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，培养的条件如下：pH值6.5-7.5，温度34-38℃。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述培养基含有豆制品；所述豆制品为豆粕或者大豆浓缩蛋白或者大豆分离蛋白；
优选的，所述培养基还含有玉米粉。
另一方面，本发明提供了一种饲料添加剂，其含有如上所述的培养物。
另一方面，本发明提供了一种饲料，其含有如上所述的饲料添加剂。
另一方面，本发明提供了一种饲养方法，其包括：向目标动物饲喂如上所述的饲料。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述目标动物为猪、虾或鳗鱼。
另一方面，本发明提供了用于检测或鉴定如上所述的解淀粉芽孢杆菌的引物对。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述引物对为用于扩增SEQ ID NO.1所示的引物对。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述引物对包括SEQ ID NO.2所示的上游引物和SEQ ID NO.3所示的下游引物。具体如下所示：
上游引物27F(SEQ ID NO.2)：
5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；
下游引物1492R(SEQ ID NO.3)：
5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。
另一方面，本发明还提供鉴定上述解淀粉芽孢杆菌的方法，其包括：采用上述引物对对待测样品进行PCR扩增。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，PCR扩增的反应体系为25μL，包括：10×Taq Buffer 2.5μL，dNTPs(2.5mM)2μL，ExTaq(5U/μL)0.25μL，上游引物27F(10μM)0.5μL，下游引物1492R(10μM)0.5μL，ddH2O 16.25μL，3μL提取自待测样品的DNA模板。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，PCR扩增的程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火1min，72℃延伸90s，30个循环；72℃终延伸10min。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实施例提供的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens YN-Ba2014)的生理生化鉴定结果。
图2为本发明实施例提供的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens YN-Ba2014)的菌落形态图。
图3为本发明实施例提供的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens YN-Ba2014)的显微镜视野下的形态图。
图4为本发明实施例提供的解淀粉芽孢杆菌的16S rDNA的进化树图。
图5为试验例2中的各试验组中的保育猪平均日增重的检测结果。
图6为试验例2中的各试验组中的保育猪平均日采食量的检测结果。
图7为试验例2中的各试验组中的保育猪空肠炎症反应的检测结果。
图8为试验例2中的各试验组中的保育猪体内炎症反应的检测结果。
图9为试验例2中的各试验组中的保育猪肠道形态发育的检测结果。
图10为试验例2中的各试验组中的保育猪空肠食糜粘度的检测结果。
图11为试验例2中的各试验组中的保育猪空肠IgG浓度的检测结果。
图12为试验例6中的各试验组中的小于2厘米虾苗数量的统计结果。
图13为试验例6中的各试验组中的大于2厘米虾苗数量的统计结果。
图14为对比例1中的两种菌株的发酵液中的蛋白转化率趋势图。
图15为对比例1中的两种菌株的发酵液中的氨基酸含量变化趋势图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本发明的发明人从枯草分离出一株枯草芽孢杆菌样品，将该菌委托广东省微生物分析检测中心鉴定为解淀粉芽孢杆菌，结果如下：
(1)该解淀粉芽孢杆菌的16S rDNA序列(SEQ ID NO.1)与解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的同源性达99.72％，根据其16S rDNA序列所制作的进化树见图4，表面该菌具有独立的分类学地位，是一种新的解淀粉芽孢杆菌菌株；使用特异性引物对(SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3)扩增产出唯一的扩增产物，条带大小与解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)相同；该菌的形态特征以及生理生化特征与解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)相似，鉴定结果显示所分离的样品为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。
(2)该菌于2018年5月3日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址：广州市先烈路100号大院59号楼5楼，分类学命名为Bacillus amyloliquefaciens，保藏编号为GDMCC No：60368，菌株命名为：Bacillus amyloliquefaciens YN-Ba2014。
(3)该菌(Bacillus amyloliquefaciens YN-Ba2014)形态特征如下：
该菌为革兰氏阳性的杆状菌株，芽孢偏端生或中生，芽孢呈椭圆形，菌体单个或成对排列(见图3)。
(4)该菌(Bacillus amyloliquefaciens YN-Ba2014)的培养特征如下：
在营养琼脂平板上培养48h，菌落表面干燥，粗糙不透明，边缘不整齐(见图2)；在营养肉汤培养基中培养48h后呈沉淀性浑浊。
(5)该菌(Bacillus amyloliquefaciens YN-Ba2014)的生理生化特征如图1所示。
其可在最高为温度为40℃的环境下生长，可耐受pH5.7的酸性环境，盐浓度最高可耐受7％。
实施例2
本实施例提供了采用实施例1的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciensYN-Ba2014)进行发酵以制备高含量酸溶蛋白培养物的方法，操作步骤如下：
1、将豆粕粉用提升机送至操作平台，从发酵罐投料口投入罐内，搅匀后灭菌；
2、种子罐中的培养基总体积为0.3m3，为10％豆粕粉浆培养基(含质量比10％的豆粕，其余90％为水)，另加入消泡剂80mL，实消温度121℃保压30分钟灭菌，种子罐灭菌后待温度降至微生物适宜生长的范围内，根据罐内干物质投量接入实施例1的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens YN-Ba2014)种子液，pH值7.0，通风培养，风量15m3/h，搅拌转数35Hz，培养温度36℃，在培养过程中检测菌型；培养10小时后，转入扩大种子罐。
其中，所用种子液通过如下方法制得：
种子液培养基是10％的豆粕粉浆(其余90％为水)，每500mL三角瓶装入10％的豆粕粉浆100mL，共装60瓶，即6kg摇瓶种子，塞上棉塞或盖上六层纱布，用牛皮纸包扎棉塞后用胶皮筋扎好，蒸汽灭菌，灭菌温度121℃，灭菌时间20min，取出后自然降温，待温度回复到常温后，在无菌条件下，接入实施例1的解淀粉芽孢杆菌斜面菌种一环，塞上棉塞后，放入摇床上进行摇瓶培养，培养温度30℃，培养时间24小时。
3、扩大种子罐投料量为体积为3m3的10％豆粕粉浆培养基，加入消泡剂1L，pH值7.0，实消温度121℃保压30分钟灭菌，扩大种子罐灭菌后待温度降至微生物适宜生长的范围内，将步骤2中的种子罐中培养好的菌种转入到扩大种子罐中。风量76m3/h，搅拌转数35Hz，培养温度36℃，在培养过程中检测菌型。培养4小时。扩大培养后的种子液转入发酵罐内通风培养。
4、发酵罐投料量为含14％豆粕和1.5％玉米粉的培养基，培养基总体积为30m3，加入消泡剂11L，pH值7.0，实消温度121℃保压30分钟灭菌，发酵罐灭菌后待温度降至微生物适宜生长的范围内，将步骤3扩大种子罐中培养好的菌种转入到发酵罐中。风量720m3/h，搅拌转数30Hz，培养温度36℃，发酵过程中取样检测，发酵过程中每隔2小时记录控制参数；待转化率达到80％时，停止培养，灭酶条件为80℃30分钟，后放罐；取部分发酵液样品检测酸溶蛋白含量。
酸溶蛋白的检测方法如下：
(1)试剂
98％浓硫酸，化学纯，无氮；
35％氢氧化钠溶液(m/V)，化学纯；
2％硼酸溶液(m/V)，化学纯；
0.1N标准硫酸溶液，标定后使用；
10％三氯醋酸溶液；
双指示剂(甲基红0.1％乙醇溶液，溴甲酚绿0.5％乙醇溶液，两溶液等体积混合)；
混合催化剂(0.4g硫酸铜，含5个结晶水；6g硫酸钾，磨碎混匀)，化学纯；
(2)操作步骤
(a)样品前处理
液体样品：取20mL，加入等量10％TCA，摇匀静止30min。同时做平行样。
固体样品：2g粉末定容100mL，离心：5000转5min，取上清液20mL加等量10％TCA，沉降30min。同时做平行样。
(b)样品消解
5000r/min离心5min，取上清液5mL于凯式定氮管中消解，其中混合催化剂6.4g，浓硫酸10mL，双氧水5-10mL。消解全程至少2h，注意禁止产生泡沫。
(c)蒸馏：消解完毕后冷却至室温，蒸馏。
(d)用0.01N硫酸滴定至微红色为终点。
(e)同时做空白试验。
(3)计算
液体样品：酸溶蛋白(肽)g/100mL＝(V－V0)×c×0.014÷(5/2)×6.25×100；
固体样品：酸溶蛋白(肽)％＝(V－V0)×c×0.014÷(m/40)×6.25×100；
式中：V为滴定样品所需硫酸溶液体积(mL)，V0为滴定空白所需硫酸溶液体积(mL)，c为标定硫酸溶液浓度(mol/L)，m为称取固体样品的准确质量(g)。
结果：发酵液中的酸溶蛋白含量为：3.5g/100mL。
5、发酵液暂储于储液罐1中缓冲，以准备进入下一道分离工序。
6、将经过发酵的发酵液利用离心机进行分离，将发酵液中所含有的一些杂质分离出来，以保证产品质量及后续工序的顺利进行。分离后取上清离心液暂储于储液罐2中缓冲，准备进入下一道浓缩工序。
7、将经过分离的离心液利用三效降膜蒸发器进行浓缩，增大物料浓度，从而达到节能降耗的目的。一效加热器控制温度不得超过100℃；控制出料浓度，待出料浓度≥21％时，物料暂储于浓缩液储罐中缓冲，准备进入下一道喷雾干燥工序。
8、利用喷雾干燥系统将暂时储存的浓缩液进行喷雾干燥，生产出成品，经检测，酸溶蛋白含量45％(m/m，质量比)。取部分样品检测肽分子量分布，见下表1。该成品即高含量酸溶蛋白的培养物(在后文的实验例中该培养物简称为GDMCC60368培养物)，该培养物可以用作饲料添加剂，添加到饲料中，饲喂动物，提高饲料利用率，以及提高所饲养动物的成活率和增强机体的免疫力。喷雾干燥过程要有品管员全程监督并进行抽样检测，从而保证生产出合格的产品。进风温度180℃，出风温度90℃。
9、检测
成品的肽分子量分布检测由江南大学分析测试中心完成，结果如下表1所示。
表1 成品中肽分子量分布检测结果
试验例1
试验时间：2015年6月11-7月7日
试验地点：北卡罗来纳大学动物科技学院。
试验设计：挑选30头体况相近断奶仔猪，随机分成3组，每组10头，每头仔猪都单独饲喂。处理组日粮分别为基础日粮添加0、0.5％(即100g基础日粮添加0.5g GDMCC60368培养物)、或1％(即100g基础日粮添加1gGDMCC60368培养物)GDMCC60368培养物(由实施例2的制备方法中的步骤8制得的)。试验期为27天。比较各组的平均日增重、平均日采食量、空场炎症反应情况、体内炎症反应情况、肠道形态发育情况、空肠食糜粘度、空肠IgG浓度等。结果见图5-图11。
结果显示，GDMCC60368培养物可以增加断奶仔猪的平均日增重(见图5)和平均日采食量(见图6)，降低断奶仔猪的空肠炎症反应(见图7)和体内炎症反应(见图8)，促进肠道形态发育(见图9)，降低空肠食糜粘度(见图10)，增加空肠IgG浓度(见图11)，说明实施例2的高含量酸溶蛋白的培养物可以提高饲料利用率，有助于提高所饲养动物的成活率和增强机体的免疫力。
试验例2
试验时间：2016年7月20日-7月29日。
地点：深圳。
试验方案：选取体重约为11Kg的保育猪，随机分成对照组和试验组，每组30头。对照组饲喂基础日粮，试验组在饲喂基础日粮的基础上添加2％实施例2提供的GDMCC60368培养物。试验期为10天，试验期间仔猪无死亡。结果见下表2。
表2
分组 初重kg 末重kg 日均增重g 日均采食g 料肉比
对照 10.74 15.27 453 783 1.73
试验 11.28 18.4 712 800 1.12
改善％ +57.2 +2.2 -37.4
试验例3
试验时间：2016年8月20日-8月29日。
地点：深圳。
试验方案：选取体重约为13.6Kg左右的保育猪，随机分成对照组和试验组，每组30头。对照组饲喂基础日粮，试验组在饲喂基础日粮的基础上添加2％GDMCC60368培养物。试验期为10天，试验期间仔猪无死亡。结果见下表3。
表3
试验例4
试验时间：2016年8月22-31日。
地点：北京。
试验方案：选取体重约为7.6Kg的刚断奶仔猪，对照组21头和试验组24头。对照组喂基础日粮，试验组在饲喂基础日粮的基础上添加2％GDMCC60368培养物。试验期10天，试验期间对照组死亡1头。结果见下表4。
表4
分组 初重kg 末重kg 日均增重g 日均采食g 料肉比
对照 8 9.9 190 421.0 2.22
试验 7.8 10.3 250 471.7 1.89
改善％ +31.6 +12.0 -14.7
试验例5
试验时间：2014年3月10-26日(猪舍内白天平均气温18.4℃)。
试验地点：深圳。
试验方案：挑选18头体况相近哺乳母猪，随机分成对照组和试验组，每组9头。对照组饲喂基础日粮，试验组在饲喂基础日粮的基础上添加0.5％GDMCC60368培养物。试验期为产后3天到断奶(16天)。均产值数为10头。结果见表5。
表5
分组 母猪日均采食kg 3日龄窝重kg 断奶窝重kg 仔猪日增重g 料窝重比
对照 5.48 24.39 59.13 217 2.52
试验 5.51 24.08 63.32 245 2.25
改善％ +0.55 +7.1 +12.9 -10.7
从上表可以看出，实施例2提供的GDMCC60368培养物可以明显提高断奶仔猪日均采食量和日均增重，显著降低料肉比，提高哺乳母猪的断奶窝重、仔猪日增重以及降低料窝重比。
试验例6
GDMCC60368培养物对凡青虾成活率和产量的影响
试验时间：2016年7月6日-22日。
试验地点：山东泰安。
试验设计：青虾分成五组三个重复，在基础饵料的基础上，饵料1组和饵料2组添加实施例2的GDMCC60368培养物，饵料3组不加GDMCC60368培养物，饵料4组添加豆浆，5组为对照组。
每周测定水体上层小于2厘米虾苗数量，观察GDMCC60368培养物对成活率的影响；测定青虾的长度。结果见图12和图13。
图12结果显示，饵料1组和饵料2组的小于2CM的虾苗数量远高于其他3个组，经计算使用GDMCC60368培养物可以提高青虾苗成活率4.5倍。
图13结果显示，饵料1组和饵料2组的大于2CM的虾苗数量远高于其他3个组，经计算使用GDMCC60368培养物可以提高青虾产量26％。
试验例7
GDMCC60368培养物对凡纳滨对虾幼的影响
试验设计：在基础饲料的基础上，添加0、0.5％、1.0％、2.0％、4.0％和6.0％GDMCC60368培养物共6个试验组，各组分别命名为S、S0.5、S1.0、S2.0、S4.0、S6.0。选取初始体重为(0.19±0.001)g凡纳滨对虾幼虾，每试验组设置3个重复，每个重复30尾，养殖试验时间为56d。检测对实施例2中的GDMCC60368培养物对凡纳滨对虾幼虾生长性能、体成分、非特异性免疫力的影响。
结果见下表6-表8
表6 GDMCC60368培养物对凡纳滨对虾幼生长性能的影响(n＝3)
肩标小写字母表示差异极显著，P<0.01。
表7 GDMCC60368培养物对凡纳滨对虾幼虾体成分的影响(以干物质为基础，n＝3)
肩标小写字母表示差异极显著，P<0.01。
表8 GDMCC60368培养物对凡纳滨对虾幼虾血清免疫指标的影响(n＝3)
注：溶菌酶、酚氧化物酶、超氧化物歧化酶、酸性磷酸酶、碱性磷酸酶是衡量虾非特异性免疫水平标志物，因为虾是低等生物，无特异性免疫。肩标小写字母表示差异极显著，P<0.01。
从表6-8的结果可以看出，实施例2的GDMCC60368培养物显著提高凡纳滨对虾幼虾生长性能和非特异性免疫力。
对比例1
比较市面上购得的解淀粉芽孢杆菌(编号CICC1074，作为对比菌株)与本发明实施例的解淀粉芽孢杆菌(GDMCC No：60368)的产酸溶蛋白的能力。
材料：
1、发酵底物：
龙口香驰43豆粕(80目过筛率≥70％)。
2、种子液培养基：
葡萄糖：2％，蛋白胨：0.5％，无水硫酸镁：0.5％，磷酸氢二钾：0.1％，蒸馏水定容至100％，pH6.8-7.0。
3、发酵培养基：
豆粕粉(即龙口香驰43豆粕)：10％，蒸馏水定容至100％，pH6.8-7.0。
试验方法：
1、种子液的制备：
挑取实施例1的解淀粉芽孢杆菌(GDMCC No：60368)和对比解淀粉芽孢杆菌(CICC1074)，将其分别接在种子液培养基中，于32℃、160rpm培养12-16小时，将各种子液OD值调至0.6，备用。
2、试验设计：见下表9。
表9 试验设计
3、接种、培养：
将培养好的种子液按照5％(体积比)的接种量分别接种于发酵培养基中，将摇瓶置于32℃、160rpm的恒温培养箱中进行培养，并分别于24h和48h测定各处理组的发酵液中的酸溶蛋白含量、粗蛋白含量、氨基酸含量和挥发性盐基氮含量等。
4、结果分析
测得的结果见下表10。
表10
(1)从镜检结果可以看出，两株菌长势都较好。并且随着时间的延长菌种数量逐渐增多。
(2)蛋白转化率趋势：如图14所示并结合表10内容，可以看出，实施例1的解淀粉芽孢杆菌(GDMCC60368，即GDMCC NO.60368)的蛋白转化率要比对比解淀粉芽孢杆菌(CICC10074)的蛋白转化率要高。并且蛋白转化率在一定范围内随着时间的延长而不断升高。且实施例1的菌株(GDMCC NO.60368)的发酵液中的酸溶蛋白高于对比解淀粉芽孢杆菌(CICC10074)。
(3)氨基酸变化情况：如图15所示并结合表10内容，可以看出，相同时间点时实施例1的解淀粉芽孢杆菌(GDMCC NO.60368)产生的氨基酸含量要比对比解淀粉芽孢杆菌(CICC10074)的氨基酸含量要高。并且氨基酸含量在一定范围内随着时间的延长而不断升高。
以上实验充分说明，本发明实施例1提供的解淀粉芽孢杆菌(GDMCC NO.60368)在蛋白转化率、酸溶蛋白含量和氨基酸含量等各项指标上都优于对比解淀粉芽孢杆菌(CICC10074)，该菌株具有广阔的应用前景。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 泰安肽普德蛋白有限公司
<120> 一种解淀粉芽孢杆菌及其应用
<130> 250
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1442
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tgctatacat gcagtcgagc ggacagatgg gagcttgctc cctgatgtta gcggcggacg 60
ggtgagtaac acgtgggtaa cctgcctgta agactgggat aactccggga aaccggggct 120
aataccggat gcttgtttga accgcatggt tcagacataa aaggtggctt cggctaccac 180
ttacagatgg acccgcggcg cattagctag ttggtgaggt aacggctcac caaggcgacg 240
atgcgtagcc gacctgagag ggtgatcggc cacactggga ctgagacacg gcccagactc 300
ctacgggagg cagcagtagg gaatcttccg caatggacga aagtctgacg gagcaacgcc 360
gcgtgagtga tgaaggtttt cggatcgtaa agctctgttg ttagggaaga acaagtgccg 420
ttcaaatagg gcggcacctt gacggtacct aaccagaaag ccacggctaa ctacgtgcca 480
gcagccgcgg taatacgtag gtggcaagcg ttgtccggaa ttattgggcg taaagggctc 540
gcaggcggtt tcttaagtct gatgtgaaag cccccggctc aaccggggag ggtcattgga 600
aactggggaa cttgagtgca gaagaggaga gtggaattcc acgtgtagcg gtgaaatgcg 660
tagagatgtg gaggaacacc agtggcgaag gcgactctct ggtctgtaac tgacgctgag 720
gagcgaaagc gtggggagcg aacaggatta gataccctgg tagtccacgc cgtaaacgat 780
gagtgctaag tgttaggggg tttccgcccc ttagtgctgc agctaacgca ttaagcactc 840
cgcctgggga gtacggtcgc aagactgaaa ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag 900
cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcaa cgcgaagaac cttaccaggt cttgacatcc 960
tctgacaatc ctagagatag gacgtcccct tcgggggcag agtgacaggt ggtgcatggt 1020
tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aacccttgat 1080
cttagttgcc agcattcagt tgggcactct aaggtgactg ccggtgacaa accggaggaa 1140
ggtggggatg acgtcaaatc atcatgcccc ttatgacctg ggctacacac gtgctacaat 1200
ggacagaaca aagggcagcg aaaccgcgag gttaagccaa tcccacaaat ctgttctcag 1260
ttcggatcgc agtctgcaac tcgactgcgt gaagctggaa tcgctagtaa tcgcggatca 1320
gcatgccgcg gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca ccacgagagt 1380
ttgtaacacc cgaagtcggt gaggtaacct ttaggagcca gccgccgaag tggaccagat 1440
gt 1442
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ggttaccttg ttacgactt 19

Claims (10)

1.一种解淀粉芽孢杆菌，其特征在于，其保藏编号为GDMCC No：60368。
2.根据权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌，其特征在于，所述解淀粉芽孢杆菌的16SrDNA的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。
3.根据权利要求2所述的解淀粉芽孢杆菌，其特征在于，所述解淀粉芽孢杆菌具有如下形态特征：
芽孢偏端生或中生，芽孢呈椭圆形，菌体单个或成对排列。
4.权利要求1-3任一项所述的解淀粉芽孢杆菌在提高酸溶蛋白含量中的应用。
5.权利要求1-3任一项所述的解淀粉芽孢杆菌在制备饲料或饲料添加剂中的应用。
6.一种高含量酸溶蛋白培养物的制备方法，其特征在于，其包括：将权利要求1-3任一项所述的解淀粉芽孢杆菌接种至培养基中发酵培养。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，培养的条件如下：pH值6.5-7.5，温度34-38℃。
8.根据权利要求6或7所述的制备方法，其特征在于，所述培养基含有豆制品；所述豆制品为豆粕或者大豆浓缩蛋白或者大豆分离蛋白；
优选的，所述培养基还含有玉米粉。
9.用于检测或鉴定如权利要求1-3任一项所述的解淀粉芽孢杆菌的引物对；
优选地，所述引物对为用于扩增SEQ ID NO.1所示的引物对；
优选地，所述引物对包括SEQ ID NO.2所示的上游引物和SEQ ID NO.3所示的下游引物。
10.一种检测或鉴定权利要求1-3任一项所述的解淀粉芽孢杆菌的方法，其特征在于，其包括：采用权利要求9所述的引物对对待测样品进行PCR扩增。
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Denomination of invention: A Bacillus amyloliquefaciens and its application

Granted publication date: 20200428

Pledgee: China Postal Savings Bank Co.,Ltd. Xintai City sub branch

Pledgor: Taian peptide protein Co.,Ltd.

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