CN112126694A

CN112126694A - V5v6区引物解析植物内生细菌菌群的方法

Info

Publication number: CN112126694A
Application number: CN201910552031.0A
Authority: CN
Inventors: 张莉莉; 陈丽莹; 张玉满; 方荣祥
Original assignee: Institute of Microbiology of CAS
Current assignee: Institute of Microbiology of CAS
Priority date: 2019-06-24
Filing date: 2019-06-24
Publication date: 2020-12-25
Anticipated expiration: 2039-06-24
Also published as: CN112126694B

Abstract

本发明公开了V5V6区引物解析植物内生细菌菌群的方法。本发明提供用于解析植物内生细菌菌群的引物对，由引物甲和引物乙组成，靶序列为细菌16S rDNA的V5‑V6区的全长或部分；所述引物甲是核苷酸序列如序列表中序列1所示的单链DNA分子，所述引物乙与植物线粒体18S rDNA对应，且引物乙的3’末端与植物线粒体18S rDNA有3个连续的差异核苷酸，且引物乙全长与植物线粒体18S rDNA的差异核苷酸大于等于4个。本发明利用上述引物对及具有热启动活性且没有3’→5’外切酶校正活性的DNA聚合酶，获得了纯的植物内生细菌菌群16S扩增子；并结合二代测序平台建立了无污染扩增内生细菌菌群的测序实验平台。

Description

V5V6区引物解析植物内生细菌菌群的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种用于解析植物内生细菌菌群的试剂和方法，特别涉及一种V5V6区引物解析植物内生细菌菌群的方法。

背景技术

植物的体表和体内定殖着种类繁多的微小生物，包括细菌、真菌、古菌、线虫、原生动物等等，统称为植物微生物群落。植物微生物群落与宿主植物共栖，在营养生长、发育和抗胁迫三个方面影响着宿主植物。植物微生物群落中数量最多的是细菌，按照细菌定殖在植物组织的表面或者内部，它们分别被定义为植物表面菌群和植物内生菌群。

植物微生物群落的研究方法有培养法和非培养法两大类，借助于16S rDNA扩增子测序的二代高通量测序是非培养法研究的经典方法，相比于培养法，该方法具有方便快捷、对菌群解析全面的优点。因此，16S扩增子测序是目前植物微生物群落研究应用最普遍的一种方法。16S rDNA是原核生物中保守的序列，被称为细菌分类鉴定的分子钟。16S rDNA由10个序列保守区和9个序列高变区交替排列组成，保守区序列在不同的细菌中具有很高的序列同源性，而高变区序列则具有物种特异性，由此，可以在16S rDNA的两个序列保守区设计一对引物，扩增出含有一个或几个高变区的序列片段，然后根据高变区的序列特异性对菌种进行分类鉴定。

采用16S扩增子测序研究植物细菌菌群研究最多的是植物根际菌群，而对于植物内生细菌菌群的解析，由于植物的叶绿体16S rDNA和线粒体18S rDNA与细菌的16S rDNA有很高的同源性，导致一般的16S扩增子引物会同时扩增叶绿体16S rDNA和线粒体18S rDNA，而这两种细胞器在数量上通常远远多于植物内生细菌，因此，扩增产物中往往伴随极高比例的宿主DNA污染，严重干扰后续的菌群分析。目前已发表的研究中，799F是唯一能够避开植物叶绿体污染的引物，但是仍没有能够避开植物线粒体污染的引物，使用799F与其它16S扩增子引物组合，其扩增产物伴有高比例的线粒体序列污染。

因此，急需设计菌群16S的特异性扩增引物来避开植物源DNA的污染从而获得只含有菌群16S扩增子的测序文库，为植物内生菌群的高效解析提供实验平台。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何实现对植物内生细菌菌群的16S扩增子进行无污染扩增，具体为如何避开植物线粒体污染实现对植物内生细菌菌群的16S扩增子扩增，进而准确解析植物内生细菌菌群。

为解决上述技术问题，本发明提供了用于解析植物内生细菌菌群的引物对，所述引物对的靶序列为细菌16S rDNA的V5-V6区的全长或部分；所述引物对由引物甲和引物乙组成，所述引物甲是核苷酸序列如序列表中序列1所示的单链DNA分子，所述引物乙与植物线粒体18S rDNA对应，且所述引物乙的3’末端与所述植物线粒体18S rDNA有3个连续的差异核苷酸，且所述引物乙全长与所述植物线粒体18S rDNA的差异核苷酸大于等于4个，所述引物乙除所述差异核苷酸外，其它核苷酸与所述植物线粒体18S rDNA的相应核苷酸相同或互补。

上述引物对中，所述对应是指引物乙可与植物线粒体18S rDNA的任一部分除差异核苷酸外相同或互补。所述植物线粒体18S rDNA的任一部分与引物乙长度相同。

上述引物对中，所述引物乙是核苷酸序列如序列表中序列2所示的单链DNA分子。

上述引物对中引物甲和引物乙的一端均可添加区分不同样本的Barcode序列。

在本发明中PCR扩增体系中，所述引物甲和所述引物乙的摩尔比为1∶1。

本发明还提供了用于解析植物内生细菌菌群的试剂。

上述用于解析植物内生细菌菌群的试剂包括上述所述引物对和具有热启动活性且没有3’→5’外切酶校正活性的DNA聚合酶。

在本发明中PCR扩增体系中，所述DNA聚合酶为Platinum Taq DNA polymerase(Invitrogen，USA)。

进一步，包含上述引物对或上述试剂的试剂盒也在本发明的保护范围之内。

上述引物对或上述的试剂或上述试剂盒在解析植物内生细菌菌群中的应用也是本发明保护的范围；

或，上述引物对或上述的试剂或上述试剂盒在制备解析植物内生细菌菌群产品中的应用也是本发明保护的范围；

上述引物对或上述的试剂或上述试剂盒在避开植物宿主DNA污染且获得植物内生细菌菌群16S扩增子中的应用也是本发明保护的范围；

或，上述引物对或上述的试剂或上述试剂盒在构建植物内生细菌菌群测序文库中的应用也是本发明保护的范围；

或，上述引物对或上述的试剂或上述试剂盒在植物内生细菌菌群测序中的应用也是本发明保护的范围。

本发明上述植物宿主DNA包括植物源线粒体DNA和植物源叶绿体DNA，具体为植物源线粒体18S rDNA和植物源叶绿体16S rDNA。

本发明进一步提供了用于解析植物内生细菌菌群的方法。

上述方法，包括如下步骤：

1)提取待测植物组织总DNA，用上述引物对和具有热启动活性且没有3’→5’外切酶校正活性的DNA聚合酶扩增，得到PCR扩增产物；

2)对所述PCR扩增产物进行测序，根据测序结果鉴定待测植物组织内生细菌菌群，从而解析植物组织内生细菌菌群结构。

上述中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物；

所述单子叶植物为水稻、玉米、小麦、大麦；

所述双子叶植物为柑橘、番茄、拟南芥、大豆、花生。

本发明设计了避开植物源线粒体18S rDNA的细菌16S扩增子特异性引物1107R，并与避开植物源植物叶绿体16S rDNA的细菌16S扩增子特异性引物799F组成引物对，选择了具有热启动活性且没有3’→5’外切酶校正活性的DNA聚合酶进行PCR扩增，该方法同时避开宿主植物叶绿体16S rDNA和线粒体18S rDNA两种序列污染，获得了纯的植物内生细菌菌群16S扩增子；结合Illumina二代测序平台建立了适用于多种植物的无污染扩增内生菌群的测序实验平台。

附图说明

图1为实施例2中的PCR扩增产物1％琼脂糖凝胶电泳图，其中，Marker为DNAMarker II(TIANGEN)；1-5为5个重复样品；6为负对照(PCR体系加与模板等体积的ddH₂O)。

图2为实施例3中PCR扩增产物1％琼脂糖凝胶电泳图，其中，Marker为DNA MarkerII(TIANGEN)，1-3为柑橘(Cr)，4-6为番茄(Le)，7-9为拟南芥(At)，10-12为水稻(Os)，13-15为为负对照(PCR体系加与模板等体积的ddH₂O)。

图3为实施例3高通量测序实验中所有样品稀释曲线图。

图4为实施例3高通量测序实验中4种植物的属水平相对丰度柱形图。

图5为实施例3高通量测序实验中4种植物12个样品的OTU聚类统计表；每行代表一个OTU在不同样品中的序列数，每列代表一个样品中各个OTU的丰度。

图6为实施例3高通量测序实验中4种植物的门水平相对丰度柱形图。

图7为引物1107 R的反向互补序列与多种植物线粒体18S rDNA的比对结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、解析植物内生细菌菌群的引物设计及合成

现有研究中799F是唯一能够避开植物叶绿体污染的引物，所述799F是核苷酸序列如序列表中序列1所示的单链DNA分子。

本发明为了避开宿主植物线粒体18S rDNA，根据细菌16S rDNA的V5-V6区设计引物乙如下：

所述引物乙与植物线粒体18S rDNA对应，且所述引物乙的3’末端与所述植物线粒体18S rDNA有3个连续的差异核苷酸，且所述引物乙全长与所述植物线粒体18S rDNA的差异核苷酸大于等于4个，所述引物乙除所述差异核苷酸外，其它核苷酸与所述植物线粒体18S rDNA的相应核苷酸相同或互补。

根据上述设计原则得到如下引物对：

799F：5’-AACMGGATTAGATACCCKG-3’(序列1)

1107R：5’-GGGTTGCGCTCGTTGCG-3’(序列2)

其中，K为g或t，M为a或c。

实施例2、解析植物内生细菌菌群的扩增方法的建立

以水稻叶片的总DNA为模板，以实施例1中所述的引物799F和1107R(浓度10μM)为引物，以有热启动活性，没有3’→5’外切酶校正活性的Platinum Taq DNA polymerase(Invitrogen，USA)为酶，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

上述PCR扩增的反应体系如下：

上述PCR扩增的流程如下：

PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示，得到长度为350bp左右的扩增产物，为细菌菌群16S rDNA的V5-V6区。

实施例3、高通量测序解析植物内生细菌菌群的方法

1、PCR扩增：

以四种植物：柑橘(Citrus sinensis，Cr)、番茄(Lycopersicon esculentum，Le)、拟南芥(Arabidopsis thaliana，At)、水稻(Oryza sativa，Os)的叶部的总DNA为模板，每种植物设置3个样品，将实施例l合成的引物799F和1107R的5’端均加上6个碱基长度用于区分不同样品的Barcode，每个样品的引物Barcode组合均不同，用于后续高通量测序的样品标识；利用实施例2的扩增方法进行PCR扩增，每个样品获得150μl的扩增产物，扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳，结果如图2所示。

2、Illumina测序结果

利用广东美格基因科技有限公司的Illumina Hiseq 2500测序平台，对扩增产物16S rDNA的V5-V6区进行高通量(每个样品数据量≥3万条)测序。

结果显示：

(1)如图3所示，所有样品的稀释曲线基本都趋于平缓，且每个样品的测序数据量都在3万条以上，说明本次测序数据量充足，可以进行后续数据分析。Alpha多样性指数表(表1)显示，所有样品的chaol指数基本都在300-500之间，说明柑橘(Cr)、番茄(Le)、拟南芥(At)、水稻(Os)四种不同的植物其叶部内生菌群的物种丰度相近；而柑橘(Cr)的observedspecies和shannon指数均明显高于其它植物，说明柑橘的叶部内生菌群多样性更高，具有更加复杂的菌群结构。

表1 Alpha多样性指数

(2)属水平相对丰度柱形图，如图4所示，展示了相对丰度高于1％的物种，其余物种全部聚为“others”，其中，每种植物为组内3个样品取平均值后的结果。从图中可以看出，本次测序的4种植物共12个样品在物种组成上，相对丰度高于1％的物种全部为细菌，没有植物序列；图5给出了4种植物共12个样品的OTU聚类统计表，从该表中检索不到植物线粒体和叶绿体的信息，因此全部样品均没有任何植物序列。以上结果说明，引物对799F/1107R采用实施例2中的扩增方法后实现了特异性扩增植物内生细菌菌群而不会引入任何植物线粒体或叶绿体序列的污染。

门水平相对丰度柱形图，如图6所示，展示了相对丰度高于1％的物种，其余物种全部聚为“others”，其中，每种植物为组内3个样品取平均值后的结果。从图中可以看出，柑橘(图中以“Cr”表示)、番茄(图中以“Le”表示)、拟南芥(图中以“At”表示)、水稻(图中以“Os”表示)四种植物其叶部内生菌群在门水平上的组成基本相似，主要由Proteobacteria、Deinococcus-Thermus、Firmicutes和Actinobacteria组成。

本次测序从大数据的统计结果上说明，本发明所设计的引物及扩增方法实现了完全避开植物源DNA污染从而获得纯的菌群16S扩增子文库的目的，并结合Illumina二代测序建立了特异性高效扩增植物内生细菌菌群的测序实验平台。

实施例4、本发明在植物内生菌领域的应用范围

实施例3中已经通过证明本发明可以应用于柑橘、番茄、拟南芥、水稻四种植物。此外，我们还挑选了几种常见的植物，玉米(Z.mays)、小麦(T.aestivum)、大麦(H.vulgare)、大豆(G.max)、花生(A.hypogaea)，获得这些植物(包括实施例3中的拟南芥(A.thaliana)、水稻(O.sativa))的线粒体18S rDNA序列(简记为Mt18S)(从NCBI(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库中下载得到)利用软件Vector NTI(Invitrogen)对引物1107R的反向互补序列和Mt18S的单链序列进行序列比对，结果如图7所示，可以看出，引物1107R的反向互补序列与所有这些植物的线粒体18S rDNA序列均在3’末端有三个连续的碱基差异，说明引物1107R可以避开所有这些植物的线粒体18S rDNA序列。

上述结果表明，本发明所设计的引物及扩增方法可以适用于上述所有植物物种的内生细菌菌群的特异性扩增，并且根据序列同源性推断，本发明还可以适用于上述植物之外的多种植物物种。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 中国科学院微生物研究所

<120> V5V6区引物解析植物内生细菌菌群的方法

<130> GNCFY191307

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aacmggatta gataccckg 19

<210> 2

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gggttgcgct cgttgcg 17

Claims

1.用于解析植物内生细菌菌群的引物对，其特征在于：

所述引物对的靶序列为细菌16S rDNA的V5-V6区的全长或部分；

所述引物对由引物甲和引物乙组成，所述引物甲是核苷酸序列如序列表中序列1所示的单链DNA分子，所述引物乙与植物线粒体18S rDNA对应，且所述引物乙的3’末端与所述植物线粒体18S rDNA有3个连续的差异核苷酸，且所述引物乙全长与所述植物线粒体18SrDNA的差异核苷酸大于等于4个，所述引物乙除所述差异核苷酸外，其它核苷酸与所述植物线粒体18S rDNA的相应核苷酸相同或互补。

2.根据权利要求1所述的引物对，其特征在于：

所述引物乙是核苷酸序列如序列表中序列2所示的单链DNA分子。

3.根据权利要求2所述的引物对，其特征在于：所述引物甲和所述引物乙的摩尔比为1∶1。

4.用于解析植物内生细菌菌群的试剂，其特征在于：包括权利要求1-3中任一所述引物对和具有热启动活性且没有3’→5’外切酶校正活性的DNA聚合酶。

5.用于解析植物内生细菌菌群的试剂盒，其特征在于：包括权利要求1-3中任一所述引物对或权利要求4所述的试剂。

6.权利要求1-3中任一所述引物对或权利要求4所述的试剂或权利要求5所述试剂盒在解析植物内生细菌菌群中的应用；

或权利要求1-3中任一所述引物对或权利要求4所述的试剂或权利要求5所述试剂盒在制备解析植物内生细菌菌群产品中的应用。

7.权利要求1-3中任一所述引物对或权利要求4所述的试剂或权利要求5所述试剂盒在避开植物宿主DNA污染且获得植物内生细菌菌群16S扩增子中的应用；

权利要求1-3中任一所述引物对或权利要求4所述的试剂或权利要求5所述试剂盒在构建植物内生细菌菌群测序文库中的应用；

或权利要求1-3中任一所述引物对或权利要求4所述的试剂或权利要求5所述试剂盒在植物内生细菌菌群测序中的应用。

8.一种解析植物内生细菌菌群的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)提取待测植物组织总DNA，用权利要求1-3中任一所述引物对和具有热启动活性且没有3’→5’外切酶校正活性的DNA聚合酶扩增，得到PCR扩增产物；

9.权利要求1-3中任一所述引物对或权利要求4所述的试剂或权利要求5所述试剂盒或权利要求6或7所述应用或者权利要求8所述方法，其特征在于：所述植物为单子叶植物或双子叶植物。

10.权利要求1-3中任一所述引物对或权利要求4所述的试剂或权利要求5所述试剂盒或权利要求6或7所述应用或者权利要求8所述方法，其特征在于：

所述单子叶植物为水稻、玉米、小麦、大麦；

所述双子叶植物为柑橘、番茄、拟南芥、大豆、花生。