CN104560982A - 不同种属微生物间种类和丰度比较的人工外源性参照分子 - Google Patents

不同种属微生物间种类和丰度比较的人工外源性参照分子 Download PDF

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Abstract

不同种属微生物间种类和丰度比较的人工外源性参照分子，包括：若干物种检测区及若干连接序列区，所述物种检测区与连接序列区相间排列交替出现；所述物种检测区的个数至少为两个，且为同种属物种检测区；所述连接序列区为与待检测物种序列同的随机序列。所述物种检测区包括引物序列区与特异识别区，所述特异识别区的序列长度模拟相应待检测物种的特征检测序列长度，所述特异识别区的序列与待检测物种中的基因组DNA序列无同源性，存在明显特异区别。本发明提供的人工外源性参照分子，可以同时含有两种或两种以上同微生物的通用引物序列区域，并且含有可以人为识别的特异序列，用于同种属微生物间种类和丰度比较。

Description

不同种属微生物间种类和丰度比较的人工外源性参照分子
技术领域
本发明涉及微生物检测和分析技术领域，尤其涉及一类用于不同种属微生物间种类和丰度比较的人工外源性参照分子。
背景技术
微生物涉及到病毒、细菌、真菌等，种类繁多并且无处不在，环境中、人体表面、人体各内部腔体表面甚至器官内都存在大量的微生物。相对于人类健康来说，微生物可以分为有害微生物、有益微生物。多数微生物的感染在一定条件下会导致疾病，但也有一些有益的微生物是人体维持健康平衡必不可少的因素。随着生命科学研究进步，研究者发现人体特定部位混杂伴随群居的微生物之间有相对稳定的种类，并且呈一定的相对比例。微生物间种类和相对丰度的改变可以影响人体健康，在某些情况下甚至是主要致病因素；同时，微生物间的相互影响，也并非只有同属种的微生物相互影响，越来越多的研究结果表明，不同属种的微生物间（比如细菌与病毒之间、细菌与真菌之间、病毒与真菌之间等）也存在相互影响，某些条件下，正是导致疾病发生的原因。因此，近些年科学家越来越重视将微生物群体作为一个相互影响的机体进行系统研究，被称为微生物组学研究（Microbiom）。
在大规模测序技术产生之前，微生物之间的鉴定分类主要依赖传统的形态、表型、生理生化分类，这些技术难以批量规模化检测，并且费时、费力，分型、量化不准确。随着分子生物学的迅速发展，目前大规模测序很好的解决了这方面问题。大规模测序的原理主要是基于微生物的基因序列特点实现的。
同种属的微生物间的基因序列既有在进化过程中基本不变化或变异程度很小的保守序列区域，又有种类之间差异表达的可变序列区域。在有核生物中，核糖体RNA（rRNA）及对应的编码基因核糖体DNA（rDNA）成为很好的区域，同时包含两种序列区域，并且长度大小合适，适合现有技术框架下的序列分析。目前使用较多的有5SrRNA/rDNA、5.8SrRNA/rDNA、16SrRNA/rDNA、18SrRNA/rDNA、23SrRNA/rDNA、ITS（Internal transcribed space，内转录间隔区）等区的序列。具体原理为根据这些保守区设计出通用引物，从而扩增出采集的样本中的所有同一个种属的微生物片段，对这些片段进行测序，就可以检测到两个保守的通用引物之间的可变区的基因序列，分析这些可变区的序列差异就可以实现对微生物的分类。检测不同种类微生物的测序条数（reads）就可以知道微生物间的相对丰度。
不同种属的微生物间的基因序列差异比较大，适合用以测序检测的保守区域及其序列也往往不同。而不同的基因序列以及扩增片段的长度是制约扩增反应条件。因此，目前比较普遍的做法是针对有相同通用引物的同一种属的微生物，设计扩增试剂盒，进行扩增及测序检测。通用引物不同的微生物，各自单独扩增和测序，但不同批次的扩增反应和测序存在批次间扩增效率以及其他影响因素的差异，这就造成微生物种类和丰度的检测只能在同种属之间进行，而同时定居在同一空间区域的不同属的微生物间则不能进行比较。
发明内容
针对上述问题，本发明提供一类人工外源性参照分子，该序列可以同时含有两种或两种以上不同微生物的通用引物序列区域，并且含有可以人为识别的特异序列，用于不同种属微生物间种类和丰度比较。
为实现本发明的上述目的，本发明提供一类用于不同种属微生物间种类和丰度比较的人工外源性参照分子，包括：若干物种检测区及若干连接序列区，所述物种检测区与连接序列区相间排列交替出现；所述物种检测区的个数至少为两个，且为不同种属物种检测区；所述连接序列区为与待检测物种序列不同的随机序列。
所述物种检测区包括引物序列区与特异识别区，位于特异识别区上游的为上游引物序列区，位于特异识别区下游的为下游引物序列区。
所述引物序列区具有序列表所示序列，所述序列表中引物序列的书写均为从5’端起始，3’结束。
所述特异识别区为人为设计合成的一组序列，设计者明确知道该序列的排列信息，该序列的长度模拟相应待检测物种的特征检测序列长度；所述特异识别区的序列与待检测物种中的基因组DNA序列无同源性，存在明显特异区别。
所述物种检测区的个数可以增加，不同种属物种检测区相互之间的位置可以互相调换，该物种检测区的种属也可以根据需要加以更换。
本发明还提供不同种属微生物间种类和丰度比较的人工外源性参照分子的制备方法，具体步骤为。
步骤一、选取序列表所附各区的代表性上下游引物序列，上下游序列之间设计随机排列的AGCT碱基序列，所得片段（包括上下游引物在内）的长度为待检测的物种的序列的平均长度，模拟待检测的物种的序列，但是除上下游引物外，其序列的排列组合不能与待检测的物种的序列同源。
步骤二、该片段之后设计连接序列区，连接序列区可以为任意长度序列片段，其特点是不能与待检测的物种的序列同源。
步骤三、再次按照上述步骤一与步骤二的方法，在序列表所附各区选取另一组代表性上下游引物序列，上下游序列之间设计序列片段，该片段不能与人工外源性参照分子的其他部分序列同源。
步骤四、根据设计好的序列，采用长片段DNA合成方法进行全序列合成：以合成基因的核苷酸AGCT为原料，采用亚磷酰胺法合成寡核苷酸链，继续采用全片段酶促连接法或酶促填充法，将寡核苷酸链的片段连接组装，即可得到所设计的整个人工外源性参照分子。
本发明用于不同种属微生物间种类和丰度比较的人工外源性参照分子的使用方法，具体步骤为。
步骤1、合成人工外源性参照分子，纯化提取待检测样本核酸，将已知量的外源性参照分子加入待测样本核酸。
步骤2、充分混匀后按照所需要检测的种属的数量，均等分成相应的份数，每一份分别使用试剂盒进行PCR扩增，并进行后续测序、酶切或其他DNA序列分析。
步骤3、每个物种的定量或相对定量分析结果，以人工外源性参照分子的检测量为基准，求得各种类的微生物相对于该人工外源性参照分子的相对量，进行数据标准化。
步骤4、物种间标准化后的数据可以进一步相互比较，以得到物种间的相对种类和丰度的数据。
与现有技术相比本发明的有益效果。
本发明提供的不同种属微生物间种类和丰度比较的人工外源性参照分子，是人工合成的序列，该序列可以同时含有两种或两种以上不同种属微生物的通用引物序列区域，并且含有可以人为识别的特异序列。将此外源性人工合成的基因分子片段，以已知并且特定的量加入到样本核酸样本中，按照所需要检测的种属的数量，分成相应的份数，每一份分别进行后续特定的扩增。所述人工外源性参照分子可以在每一个不同种属的试剂盒中得到扩增，并参与每个扩增反应中的不同种属微生物之间种类和相对丰度的比较。以此人工外源性参照分子的检测量为参照，可以进一步比较不同种属的微生物之间的相对丰度。
附图说明
图1为本发明不同种属微生物间种类和丰度比较的人工外源性参照分子的结构示意图。
图2为本发明第三实施例中细菌与真菌间种类和丰度比较的人工外源性参照分子的结构示意图。
图3为本发明第三实施例中细菌种类和相对丰度的检测结果。
图4为本发明第三实施例中真菌种类和相对丰度的检测结果。
图5为本发明第三实施例中数据标准化后的检测结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步详细说明本发明。
实施例1。
请参阅图1，本发明提供一类用于不同种属微生物间种类和丰度比较的人工外源性参照分子，包括：若干物种检测区及若干连接序列区，所述物种检测区与连接序列区相间排列交替出现；所述物种检测区的个数为三个，且为不同物种检测区，分别为第一物种检测区Ⅰ、第二物种检测区Ⅱ、及第三物种检测区Ⅲ；位于第一物种检测区Ⅰ与第二物种检测区Ⅱ之间的连接序列区为第一连接序列区a，位于第二物种检测区Ⅱ与第三物种检测区Ⅲ之间的连接序列区为第二连接序列区b，所述第一连接序列区a与第二连接序列区b为与待检测物种序列不同的随机序列。
所述第一物种检测区Ⅰ包括16S rDNA引物序列区与第一特异识别区D，位于第一特异识别区D上游的为16S rDNA上游引物序列区A1，位于第一特异识别区D下游的为16S rDNA下游引物序列区A2。
所述第二物种检测区Ⅱ包括18S rDNA引物序列区与第二特异识别区E，位于第二特异识别区E上游的为18S rDNA上游引物序列区B1，位于第二特异识别区E下游的为18S rDNA下游引物序列区B2。
所述第三物种检测区Ⅲ为扩展备选区，包括除细菌、真菌之外的引物序列区与第三特异识别区F，位于第三特异识别区F上游的为除细菌、真菌之外的上游引物序列区C1，位于第三特异识别区F下游的为除细菌、真菌之外的下游引物序列区C2。
所述16S rDNA引物序列区、18S rDNA引物序列区及除细菌、真菌之外的引物序列区具有序列表所示序列。
所述第一特异识别区D、第二特异识别区E及第三特异识别区F分别为人为设计合成的一组序列，设计者明确知道该序列的排列信息，该序列的长度模拟相应待检测物种的特征检测序列长度，具体地，16S rDNA大约包含1500个核苷酸，其中分为几个可变区段，每个区段大约300bp；18S rDNA大约包含1900个核苷酸，同样也可以分为几个可变区段，每个区段大约300bp；所述第一特异识别区D、第二特异识别区E及第三特异识别区F的序列与待检测物种中的基因组DNA序列无同源性，存在明显特异区别。
本发明用于不同种属微生物间种类和丰度比较的人工外源性参照分子的制备方法，具体步骤为。
步骤一、选取序列表所附各区的代表性上下游引物序列，上下游序列之间设计随机排列的AGCT碱基序列，所得片段（包括上下游引物在内）的长度为待检测的物种的序列的平均长度，模拟待检测物种的序列，但是除上下游引物外，其序列的排列组合不能与待检测物种的序列同源。
步骤二、该片段之后设计连接序列区，连接序列区可以为任意长度序列片段，其特点是不能与待检测物种的序列同源。
步骤三、再次按照上述步骤一与步骤二的方法，在序列表所附各区选取另一组代表性上下游引物序列，上下游序列之间设计序列片段，该片段不能与人工外源性参照分子的其他部分序列同源。
步骤四、根据设计好的序列，采用长片段DNA合成方法进行全序列合成：以合成基因的核苷酸AGCT为原料，采用亚磷酰胺法合成寡核苷酸链，继续采用全片段酶促连接法或酶促填充法，将寡核苷酸链的片段连接组装，即可得到所设计的整个人工外源性参照分子。
现有的制备合成方法很多，不局限于上述一种制备方法，但凡能够制备成本发明人工外源性参照分子的方法均可。
所述不同种属微生物间种类和丰度比较的人工外源性参照分子的使用方法，具体步骤为。
步骤1、制备合成人工外源性参照分子，采用现有DNA纯化试剂盒纯化提取待检测样本核酸，将已知量的外源性参照分子（比如5nM，只要知道确切的量即可）加入待测样本核酸。
步骤2、充分混匀后按照所需要检测的种属的数量，均等分成相应的份数，每一份分别使用专用试剂盒（现有商业试剂），按照各自固定的反应步骤进行PCR扩增，并进行后续测序、酶切序列位点分析。所述人工外源性参照分子可以在每一份不同种属的试剂盒中得到扩增，并参与每个扩增反应中的不同种属微生物之间种类和相对丰度的比较。
步骤3、每个物种的定量或相对定量分析结果，以人工外源性参照分子的检测量为基准，求得各种类的微生物相对于该人工外源性参照分子的相对量，进行数据标准化。
步骤4、物种间标准化后的数据可以进一步相互比较，以得到物种间的相对种类和丰度的数据。
细菌、真菌为两大类常见微生物，进化上有比较一致的保守序列。相对细菌、真菌，病毒的序列种类较为复杂，有RNA病毒和DNA病毒。在同种属病毒之间，有的具备细菌和真菌一样类似的保守区-可变区-保守区的结构，有的不具备这种高度保守的序列；使用本发明中所设计的人工外源性参照分子，前者具有理想基因组成结构的病毒样本可以使用大规模测序，像检测细菌、真菌种类与丰度一样来检测病毒的亚型与丰度，而后者不具有理想结构的则只能检测特定种类病毒的相对丰度。除序列表中HEV（人肠道病毒）外，HPV（人乳头瘤病毒）、单纯疱疹病毒等其他病毒均可以做相应设计应用。
所述序列表中引物序列的书写均为从5’端起始，3’结束。简并混合碱基使用IUB标准代码，M=C:A，Y=C:T，K=G:T，R=A:G，S=G:C，W=A:T，I：次黄嘌呤碱基。混合比例视具体情况调整。
实施例2。
本实施例提供的用于不同种属微生物间种类和丰度比较的人工外源性参照分子，与实施例1的不同之处在于：所述第二物种检测区Ⅱ中引物序列区根据专业内公知的识别区更换为ITS区rDNA引物序列区，位于第二特异识别区E上游的为ITS区rDNA上游引物序列区B1，位于第二特异识别区E下游的为ITS区rDNA下游引物序列区B2；所述第二特异识别区E为人为设计合成的一组序列，设计者明确知道该序列的排列信息；该序列的长度模拟相应待检测生物的特征检测序列长度，具体地，ITS区大小约为300个核苷酸。其他均与实施例1相同。
实施例3。
为分析同一样本中细菌与真菌的相对比例，人工合成如图2所示的外源性参照分子序列，图2中…为随机序列。该人工外源性参照分子的序列中连接序列区左侧设置有用于检测细菌的物种检测区，其引物序列区模拟细菌的16S V4区正向、反向引物，其中上游引物序列区具有SEQIDNO:6所示序列，下游引物序列区具有SEQIDNO:9所示序列；模拟细菌第四可变区约300bp序列长度的基因片段，中间的特异识别区D1为人工设置的用于识别外源性掺入片段数量的特异序列。连接序列区右侧设置有用于检测真菌的物种检测区，其引物序列区模拟真菌第二ITS区的正向、反向引物，其中上游引物序列区具有SEQIDNO:22所示序列，下游引物序列区具有SEQIDNO:23所示序列；模拟第四可变区约300bp序列长度的基因片段，中间为特异识别区E1。所述特异识别区D1、特异识别区E1的序列与待检测样本中的基因组DNA序列无同源性，存在明显特异区别。
每个反应中均加入等量或者已知量的人工外源性参照分子，各自扩增之后，并参与每个扩增反应中种类和相对丰度的比较，求得各种类的微生物相对于该人工外源性参照分子的相对量，结果如图3、图4所示。均以外源性参照分子为基准，进行数据标准化，使得不同种属的物种之间可以相互比较，结果如图5所示，因而有效解决了不同种属的微生物间不能使用同样的通用引物扩增，分子生物学反应以及后续分析必须分开进行，物种之间的相对丰度或相互影响的数据无法获得的问题。
以上所述，对于本领域的普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案和技术构思做出其他各种相应的改变和变形，而所有这些改变和变形都应属于本发明权利要求的保护范围。
<110>中国医科大学附属第一医院
<120>不同种属微生物间种类和丰度比较的人工外源性参照分子
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<212>DNA
<213>真菌
<220>
<223>18S NS4引物
<400>17
cttccgtcaa ttcctttaag 20
<210>18
<211>24
<212>DNA
<213>真菌
<220>
<221>misc_feature
<222>(16,17)
<223>r=g或a；18S nu-SSU-0817引物
<400>18
ttagcatgga ataatrraat agga 24
<210>19
<211>20
<212>DNA
<213>真菌
<220>
<221>misc_feature
<222>(11)…(11)
<223>y=t或c；18S nu-SSU-1536引物
<400>19
attgcaatgc yctatcccca 20
<210>20
<211>19
<212>DNA
<213>真菌
<220>
<223> ITS1引物
<400>20
tccgtaggtg aacctgcgg 19
<210>21
<211>20
<212>DNA
<213>真菌
<220>
<223> ITS2引物
<400>21
gctgcgttct tcatcgatgc 20
<210>22
<211>20
<212>DNA
<213>真菌
<220>
<223> ITS2F引物
<400>22
gcatcgatga agaacgcagc 20
<210>23
<211>20
<212>DNA
<213>真菌
<220>
<223> ITS2R引物
<400>23
tcctccgctt attgatatgc 20
<210>24
<211>18
<212>DNA
<213>真菌
<220>
<223> ITS5引物
<400>24
ggaaggtaaa agtcaagg 18
<210>25
<211>23
<212>DNA
<213>真菌
<220>
<223> ITS12F引物
<400>25
cttggtcatt ttagaggaag taa 23
<210>26
<211>27
<212>DNA
<213>真菌
<220>
<223> ITS12R引物
<400>26
(ta)tggt(ct)(agt)(tc)(tc)tagaggaagtaa 27
<210>27
<211>23
<212>DNA
<213>真菌
<220>
<223> ITS42F 引物
<400>27
caggagactt gtacacggtc cag 23
<210>28
<211>22
<212>DNA
<213>真菌
<220>
<223> ITS42R引物
<400>28
cagactt(ga)ta(ct)atggtccag 22
<210>29
<211>22
<212>DNA
<213>真菌
<220>
<223> ITS86引物
<400>29
gtgaatcatc gaatctttga ac 22
<210>30
<211>20
<212>DNA
<213>真菌
<220>
<223> 5S 26SF引物
<400>30
atcctttgca gacgacttga 20
<210>31
<211>20
<212>DNA
<213>真菌
<220>
<223> 5S 5SR引物
<400>31
agcttgactt cgcagatcgg 20
<210>32
<211>19
<212>DNA
<213>真菌
<220>
<223> 5S CNL12引物
<400>32
ctgaacgcct ctaagtcag 19
<210>33
<211>21
<212>DNA
<213>真菌
<220>
<223> 5S CNS1引物
<400>33
gagacaagca tatgactact g 21
<210>34
<211>25
<212>DNA
<213>肝炎病毒
<220>
<223> HEV NTR EV1-446引物
<400>34
tccggcccct gaatgcggct aatcc 25
<210>35
<211>26
<212>DNA
<213>肝炎病毒
<220>
<223> HEV NTR EV2-559引物
<400>35
acacggacac ccaaagtagt cggtcc 26
<210>36
<211>20
<212>DNA
<213>肝炎病毒
<220>
<221>modified_base
<222>(3,6,12,15)
<223> i；HEV 2A及VP1 P1-3408引物
<220>
<221>misc_feature
<222>(9)…(9)
<223>y=t或c；HEV 2A及VP1 P1-3408引物
<220>
<221>misc_feature
<222>(18)…(18)
<223>r=g或a；HEV 2A及VP1 P1-3408引物
<400>36
gcnccngayt gntgnccraa 20
<210>37
<211>20
<212>DNA
<213>肝炎病毒
<220>
<221>misc_feature
<222>(6)…(6)
<223>y=t或c；HEV 2A及VP1 P2-2951引物
<220>
<221>modified_base
<222>(9,12,15,18)
<223> i；HEV 2A及VP1 P2-2951引物
<400>37
atgtaygtnc cnccnggngg 20
<210>38
<211>20
<212>DNA
<213>肝炎病毒
<220>
<221>misc_feature
<222>(6)…(6)
<223>y=t或c；HEV 2A及VP1 P3-2951引物
<220>
<221>misc_feature
<222>(7)…(7)
<223>r=g或a；HEV 2A及VP1 P3-2951引物
<220>
<221>modified_base
<222>(9,12,15,18)
<223> i；HEV 2A及VP1 P3-2951引物
<220>
<221>misc_feature
<222>(13)…(13)
<223>m=a或c；HEV 2A及VP1 P3-2951引物
<400>38
atgtayrtnc cnmcnggngc 20
<210>39
<211>20
<212>DNA
<213>肝炎病毒
<220>
<221>modified_base
<222>(3,6,9,15)
<223> i；HEV 2A及VP1 P4-2612引物
<220>
<221>misc_feature
<222>(8)…(8)
<223>y=t或c；HEV 2A及VP1 P4-2612引物
<220>
<221>misc_feature
<222>(12)…(12)
<223>r=g或a；HEV 2A及VP1 P4-2612引物
<220>
<221>misc_feature
<222>(18)…(18)
<223> n=a或g或c或t， HEV 2A及VP1 P4-2612引物
<400>39
acngcngyng aracnggnca 20
<210>40
<211>19
<212>DNA
<213>肝炎病毒
<220>
<221>modified_base
<222>(3,6,9,15)
<223> i；HEV 2A及VP1 P5-2612引物
<220>
<221>misc_feature
<222>(12)…(12)
<223>r=g或a；HEV 2A及VP1 P5-2612引物
<220>
<221>misc_feature
<222>(18)…(18)
<223> n=a或g或c或t，HEV 2A及VP1 P5-2612引物
<400>40
acngcngtng aracnggng 19
<210>41
<211>20
<212>DNA
<213>肝炎病毒
<220>
<221>misc_feature
<222>(3,12)
<223>r=g或a；HEV 2A及VP1 P6-2612引物
<220>
<221>modified_base
<222>(6,9,15)
<223> i；HEV 2A及VP1 P6-2612引物
<220>
<221>misc_feature
<222>(18)…(18)
<223> n=a或g或c或t ，HEV 2A及VP1 P6-2612引物
<400>41
cargcngcng aracnggngc 20
<210>42
<211>19
<212>DNA
<213>肝炎病毒
<220>
<221>modified_base
<222>(2,5,8,11)
<223> i；HEV 2A及VP1 P7-2969引物
<220>
<221>misc_feature
<222>(13)…(13)
<223>y=t或c；HEV 2A及VP1 P7-2969引物
<220>
<221>misc_feature
<222>(14)…(14)
<223>r=g或a；HEV 2A及VP1 P7-2969引物
<220>
<221>misc_feature
<222>(15)…(15)
<223>w=a或t；HEV 2A及VP1 P7-2969引物
<400>42
cnccnggngg nayrwacat 19

Claims (7)

1.不同种属微生物间种类和丰度比较的人工外源性参照分子，包括：若干物种检测区及若干连接序列区，所述物种检测区与连接序列区相间排列交替出现；所述物种检测区的个数至少为两个，且为不同种属物种检测区；所述连接序列区为与待检测物种不同的随机序列。
2.如权利要求1所述的不同种属微生物间种类和丰度比较的人工外源性参照分子，其特征在于，所述物种检测区包括引物序列区与特异识别区，位于特异识别区上游的为上游引物序列区，位于特异识别区下游的为下游引物序列区。
3.如权利要求1所述的不同种属微生物间种类和丰度比较的人工外源性参照分子，其特征在于，所述引物序列区具有序列表所示序列，所述序列表中引物序列的书写均为从5’端起始，3’结束。
4.如权利要求1所述的不同种属微生物间种类和丰度比较的人工外源性参照分子，其特征在于，所述特异识别区为人为设计合成的一组序列，设计者明确知道该序列的排列信息，该序列的长度模拟相应待检测物种的特征检测序列长度。
5.如权利要求1所述的不同种属微生物间种类和丰度比较的人工外源性参照分子，其特征在于，所述特异识别区的序列与待检测物种中的基因组DNA序列无同源性，存在明显特异区别。
6.如权利要求1所述的不同种属微生物间种类和丰度比较的人工外源性参照分子，其特征在于，所述物种检测区的个数可以增加，不同种属物种检测区相互之间的位置可以互相调换。
7.如权利要求1所述的不同种属微生物间种类和丰度比较的人工外源性参照分子的使用方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1、合成人工外源性参照分子，纯化提取待检测样本核酸，将已知量的外源性参照分子加入待测样本核酸；
步骤2、充分混匀后按照所需要检测的种属的数量，均等分成相应的份数，每一份分别使用试剂盒进行PCR扩增，并进行后续测序、酶切或其他DNA序列分析；
步骤3、每个物种的定量或相对定量分析结果，以人工外源性参照分子的检测量为基准，求得各种类的微生物相对于该人工外源性参照分子的相对量，进行数据标准化；
步骤4、物种间标准化后的数据可以进一步相互比较，以得到物种间的相对种类和丰度的数据。
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