JP2017528136A - 異なる種属の微生物間の種類と存在比を比較するための人工外来性参照分子 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明が提供する、異なる種属の微生物間の種類と存在比を比較するための人工外来性参照分子は、人工的に合成した配列であり、該配列は、2種又は2種以上の異なる種属の微生物のコンセンサスプライマー配列領域を同時に含むことができ、且つ人為的に認識可能な特異的配列を含む。この外来性の人工的に合成された遺伝子分子断片を、既知且つ特定の量でサンプル核酸サンプルに加え、検出を要する種属の数に応じて相応の数に分け、各々について、後続の特定の増幅をそれぞれ行う。前記人工外来性参照分子は、各々の異なる種属の試薬キットにおいて増幅され、個々の増幅反応における異なる種属の微生物の間の種類と相対存在比の比較に関与することができる。この人工外来性参照分子の検出量を参照とすれば、異なる種属の微生物の間の相対存在比を更に比較することができる。
図1を参照すると、本発明は、交互に配置及び出現するいくつかの種検出領域及びいくつかの結合配列領域を含み、前記種検出領域は3個であり、且つ異なる種検出領域であり、それぞれ第1種検出領域I、第2種検出領域II、及び第3種検出領域IIIであり、第1種検出領域Iと第2種検出領域IIとの間に位置する結合配列領域は、第1の結合配列領域aであり、第2種検出領域IIと第3種検出領域IIIとの間に位置する結合配列領域は、第2の結合配列領域bであり、前記第1の結合配列領域aと第2の結合配列領域bは、検出すべき種配列とは異なる任意の配列である、異なる種属の微生物間の種類と存在比を比較するための人工外来性参照分子を提供する。
本実施例が提供する、異なる種属の微生物間の種類と存在比を比較するための人工外来性参照分子の、実施例1と異なるのは次の点にある:前記第2種検出領域II中のプライマー配列領域は、専門家の間で公知の認識領域に基づいてITS領域rDNAプライマー配列領域に変換され、第2の特異的認識領域Eの上流に位置するのはITS領域rDNA上流プライマー配列領域B1であり、第2の特異的認識領域Eの下流に位置するのはITS領域rDNA下流プライマー配列領域B2である。前記第2の特異的認識領域Eは、人為的に設計され合成された1組の配列であり、設計者は該配列の配列情報を明確に知っており、該配列の長さは、対応する検出すべき生物の特徴検出配列長さを模倣し、具体的には、ITS領域の大きは約300個のヌクレオチドである。その他はいずれも実施例1と同じである。
同一サンプル中の細菌と真菌の相対的比率を解析するため、図2に示す外来性参照分子配列を人工的に合成した。図2中の・・・は任意の配列である。該人工外来性参照分子の配列中の結合配列領域の左側に、細菌を検出するための種検出領域が設けられており、そのプライマー配列領域は細菌の16S V4領域の順方向、逆方向プライマーを模倣し、そのうち上流プライマー配列領域は、SEQ ID NO:6に示す配列を有し、下流プライマー配列領域は、SEQ ID NO:9に示す配列を有し、細菌の第4の可変領域の約300bpの配列長さを模倣する遺伝子断片は、中間の特異的認識領域D1が、人工的に設けられた、外来性組み込み断片の数を認識するための特異的配列である。結合配列領域の右側に、真菌を検出するための種検出領域が設けられており、そのプライマー配列領域は、真菌の第2のITS領域の順方向、逆方向プライマーを模倣し、そのうち上流プライマー配列領域は、SEQ ID NO:22に示す配列を有し、下流プライマー配列領域は、SEQ ID NO:23に示す配列を有し、第4の可変領域の約300bpの配列長さを模倣する遺伝子断片は、中間が特異的認識領域E1である。前記特異的認識領域D1、特異的認識領域E1の配列は、検出すべきサンプル中のゲノムDNA配列と相同性がなく、顕著な特異的差異が存在する。
Claims (7)
- 交互に配置及び出現するいくつかの種検出領域及びいくつかの結合配列領域を含み、前記種検出領域は、その個数が少なくとも2つであり、且つ異なる種属を検出するためのものであり、前記結合配列領域は、検出すべき種配列とは異なる任意の配列である、異なる種属の微生物間の種類と存在比を比較するための人工外来性参照分子。
- 前記種検出領域はプライマー配列領域と特異的認識領域とを含み、前記特異的認識領域の上流に位置するのは上流プライマー配列領域であり、前記特異的認識領域の下流に位置するのは下流プライマー配列領域である、請求項1に記載の、異なる種属の微生物間の種類と存在比を比較するための人工外来性参照分子。
- 前記プライマー配列領域は、配列表に示す配列を有し、前記配列表中のプライマー配列の記載は、いずれも5’末端から始まり、3’末端で終わる、請求項2に記載の、異なる種属の微生物間の種類と存在比を比較するための人工外来性参照分子。
- 前記特異的認識領域は、人為的に設計され合成された1組の配列であり、設計者は該配列の配列情報を明確に知っており、該配列の長さは、検出すべき種の対応する特徴検出配列の長さを模倣したものである、請求項2に記載の、異なる種属の微生物間の種類と存在比を比較するための人工外来性参照分子。
- 前記特異的認識領域の配列は、検出すべき種の中のゲノムDNA配列と相同性がなく、顕著な特異的差異が存在する、請求項4に記載の、異なる種属の微生物間の種類と存在比を比較するための人工外来性参照分子。
- 前記種検出領域の個数は増やすことができ、異なる種属の種検出領域相互間の位置は互いに入れ替え可能である、請求項1に記載の、異なる種属の微生物間の種類と存在比を比較するための人工外来性参照分子。
- 人工外来性参照分子を合成し、検出すべきサンプル核酸を精製抽出し、既知量の外来性参照分子を、検出すべきサンプル核酸に加える工程1、
十分に混和した後、検出を要する種属の数に応じて相応の数に等分し、各々に試薬キットをそれぞれ使用してPCR増幅を行うとともに、後続の塩基配列解析、酵素切断又は他のDNA配列解析を行う工程2、
個々の種の、定量又は相対定量した解析結果は、人工外来性参照分子の検出量を基準とし、各種類の微生物の、該人工外来性参照分子に対する相対量を求め、データの標準化を行う工程3、
種間の標準化されたデータを更に互いに比較することにより、種間の相対的種類及び存在比のデータを得ることができる工程4、
を備える、請求項1に記載の、異なる種属の微生物間の種類と存在比を比較するための人工外来性参照分子の使用方法。
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