CN109777866A - 一种用于二代测序技术检测dna低频变异的分子标签及其应用 - Google Patents

一种用于二代测序技术检测dna低频变异的分子标签及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种适用于二代测序技术检测DNA低频变异的分子标签及其应用。包括如下步骤：该分子标签包括两个“Y”型DNA分子，“Y”型DNA分子包括可变区、第一反向互补区、随机碱基区、第二反向互补区，所述可变区、第一反向互补区、随机碱基区、第二反向互补区依次通过磷酸二酯键连接。

Description

一种用于二代测序技术检测DNA低频变异的分子标签及其 应用
技术领域
本发明属于基因检测技术领域，具体涉及一种用于二代测序技术检测DNA低频变异的分子标签及其应用。
背景技术
肿瘤分子诊断技术按照样本的来源不同，分为传统的“组织活检”和新型的“液态活检”。组织活检需要通过手术或者穿刺获取肿瘤最有代表性部位组织部位，但是在实际临床中，患者往往无法取得实体组织。同时肿瘤组织存在异质性，同一肿瘤病灶不同，不同的病灶之间突变可能会存在差异，对于已经转移或者复发的患者，更加的难以取得实体组织。作为非侵入性的液体活检，取样便捷，能克服异质性，同时可以实现动态监测，近年来逐渐从科研研究走向临床检测，在肿瘤的诊断和治疗中大放异彩。
血浆游离DNA(Cell-Free Circulating Tumor DNA，ctDNA)是由肿瘤细胞释放到血浆中单链或者双链DNA，携带有与原发肿瘤组织相一致的分子遗传学改变。ctDNA是片段化的肿瘤DNA片段，通常是指肿瘤细胞凋亡/坏死后释放到血液中的游离DNA片段。ctDNA片段大小通常在150-180bp，在血液中的半衰期为2小时，携带有点突变、插入缺失、拷贝数变异、基因融合等变异信息。通过检测ctDNA进行肿瘤的靶向用药检测、疗效监测、耐药突变检测，不仅取样简单，还能更全面的掌握肿瘤的信息，尤其是结合高通量测序技术(NGS)，近年来研究进展迅速，加之很多较大规模的临床验证，让ctDNA的大规模临床应用变得可能。
ctDNA在样本中的占比在5％-0.1％不等，大量存在的野生型基因组DNA，导致高通量测序的背景很高，常规的高通量测序技术，无法有效的区分低频的ctDNA变异；另外，建库过程中PCR引入的错误，以及测序产生的错误，同样会影响对ctDNA微量突变的识别。
目前，一种称为UMI的分子标签技术，被广泛用于高通量测序的错误纠正。该技术是在文库构建时，将待测核酸分子标记一个唯一可识别的序列编码(Barcode)，通过该唯一序列编码来区分真正的变异与实验错误，提高测序准确性，提高检出低频突变的能力。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种用于二代测序检测DNA低频变异的分子标签，设计合成一种分子标签接头，在文库构建PCR扩增前，在双链DNA上引入一个唯一可标识的编码，提高检测DNA变异的准确性。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种用于二代测序技术检测DNA低频变异的分子标签，其特征在于，该分子标签包括两个“Y”型DNA分子，“Y”型DNA分子包括可变区、第一反向互补区、随机碱基区、第二反向互补区，所述可变区、第一反向互补区、随机碱基区、第二反向互补区依次通过磷酸二酯键连接。
作为优选：所述分子标签包括核酸单链A、核酸单链B、核酸单链C、核酸单链D，
所述核酸单链A包括可变区A1、第一反向互补区A2、随机碱基区A3、第二反向互补区A4，
所述核酸单链B包括可变区B1、第一反向互补区B2、随机碱基区B3、第二反向互补区B4，
所述第一反向互补区A2的核苷酸序列与第一反向互补区B2的核苷酸序列反向互补，所述第二反向互补区A4的核苷酸序列与第二反向互补区B4的核苷酸序列反向互补；
所述核酸单链C包括可变区C1、第一反向互补区C2、随机碱基区C3、第二反向互补区C4，
所述核酸单链D包括可变区D1、第一反向互补区D2、随机碱基区D3、第二反向互补区D4，
所述第一反向互补区C2的核苷酸序列与第一反向互补区D2的核苷酸序列反向互补，所述第二反向互补区C4的核苷酸序列与第二反向互补区D4的核苷酸序列反向互补；
核酸单链B和核酸单链D的5’末端进行磷酸化修饰；
随机碱基区A3与随机碱基区B3中随机碱基的数值为n，随机碱基区C3与随机碱基区 D3中随机碱基的数值为n+1，其中n为自然数，且2≤n≤15，错开一个碱基，可以保证引物区之间错开一位，增加测序是碱基的平衡度。
上述用于二代测序技术检测DNA低频变异的分子标签的制备方法，将核酸单链A和核酸单链B等摩尔退火，将核酸单链C和核酸单链D等摩尔退火，然后将两者等摩尔混合，得到所述分子标签；所述退火采用的程序如下：94℃5分钟；92～16℃2分钟，每个循环降2℃，降温速率为0.1℃/秒。
上述用于二代测序技术检测DNA低频变异的分子标签，所述可变区A1、第一反向互补区A2的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，第二反向互补区A4的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示；
所述可变区B1、第一反向互补区B2的核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示，第二反向互补区B4的核苷酸序列为SEQ ID NO.4所示；
所述可变区C1、第一反向互补区C2的核苷酸序列为SEQ ID NO.5所示，第二反向互补区C4的核苷酸序列为SEQ ID NO.6所示；
所述可变区D1、第一反向互补区D2的核苷酸序列为SEQ ID NO.7所示，第二反向互补区D4的核苷酸序列为SEQ ID NO.8所示。
一种用于二代测序技术检测DNA低频变异的方法，包括如下步骤：
(1)提取样品中的ctDNA；
(2)对ctDNA进行末端修复、加A，并与权利要求3所述分子标签进行连接，然后进行PCR扩增，得到扩增产物，末端修复酶为T4 DNA聚合酶、Klenow exo-、T4 DNA 磷酸激酶中的一种或者多种。；
(3)将步骤(2)中得到的扩增产物，与捕获探针进行杂交，得到捕获产物，经 PCR扩增富集后，得到测序文库；
(4)对测序文库进行高通量测序，得到测序后的数据；
(5)数据分析：通过与人染色体基因组进行比对(hg19版本)，可测得插入片段的起始位置，综合分子标签和DNA片段的起始位置，进行双重校正，校正方法如下：
(a)标签序列一致，DNA起始位置一致，来源于同一个原始DNA分子；
(b)标签一致，起始位置不一致，为不同来源的DNA分子；
(c)标签不一致，起始位置一致，为不同来源的DNA分子；
(d)标签不一致，起始位置不一致，为不同来源的DNA分子。
有益效果：
本发明公开了一种用于二代测序技术检测DNA低频变异的分子标签设计方法，发明了一种新型分子标签的设计方法，设计方法简单，可靠，成本低，为高通量测序技术检测低频突变提供了技术保障。相比于传统的设计在INDEX位置UMI分子标签，本发明开发了一种利用高通量测序技术检测DNA低频变异的新型分子标签设计方法，合成原理简单可靠，重复性高，稳定性好，方便实现双INDEX分样的需求。
附图说明
图1本发明分子标签的结构方法示意图。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
一种用于二代测序技术检测DNA低频变异的新型分子标签设计方法，设计原理如下：
(1)核酸单链A由A1，A2，A3，A4四部分组成，其核苷酸序列如下：TCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT(N)2-15TGAGTCT；
核酸单链B由B1，B2，B3，B4四部分组成，其核苷酸序列如下： GACTCA(N)2- 15AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCA；
核酸单链C由C1，C2，C3，C4四部分组成，其核苷酸序列如下：TCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT(N)2-15TGAGTCAT；
核酸单链D由D1，D2，D3，D4四部分组成，其核苷酸序列如下： TGACTCA(N)2- 15AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCA；
其中，核酸单链B和D的5’末端进行磷酸化修饰。
(2)以上核酸序列中，A3、B3、C3、D3部分，分别由随机碱基N组成，长度为 2-15bp，其中，A3和B3比C3和D3多一个N碱基。
(3)以上核酸序列中，A2和B2，C2和D2分别为反向互补序列；
(4)以上核酸序列中，A4和B4，C4和D4分别为反向互补序列，长度可以在4-10bp；
(5)将步骤(1)中，分别将核酸单链A和核酸单链B、核酸单链C和核酸单链D 等摩尔混合后发生退火反应，形成“Y”型DNA分子；退火后的“Y”型分子再按照等摩尔混合，即得到分子标签接头。
实施例1：
步骤1：ctDNA提取
取10mL肿瘤病人外周血，经离心后，分离出血浆4mL，按照QIAamp CirculatingNucleic Acid试剂盒进行核酸提取。提取到的ctDNA可以直接用于后续实验或者冻存于 -80℃。
步骤2：分子标签制作
1)合成好的单链A、单链B、单链C、单链D分别稀释至100uM；
2)将核酸单链A和B进行等摩尔退火，C和D进行等摩尔退火；
3)将混合后的A和B，C和D再次进行等摩尔混合，得到分子标签接头浓度为25uM；
步骤3：在PCR反应管中配制如下体系：End Prep Reaction Buffer(10X)6.5uL，T4DNA Polymerase 2.25uL，T4 Polynucleotide Kinase 3.25uL，DNA Polymerase I Klenowfragment 0.65uL，dNTP 2.6uL，ctDNA x uL，加水补足至65uL。运行如下反应：热盖 105℃，20℃，30分钟，65℃，30分钟，4℃终止程序。
步骤4：反应结束后，在以上反应体系中加入如下成分：dA Tail Addition Buffer(10X) 10uL，dATP Solution(10mM)2uL，DNA Polymerase I Klenow Fragment exo-3uL，水20uL。运行如下程序：热盖105℃，37℃，30分钟，4℃终止程序。
步骤5：按照如下步骤进行连接产物的纯化：
1)将末端修复产物转移至1.5mL低吸附EP管中。
2)将AMPure XP Beads平衡至室温，再涡旋振荡混匀。
3)吸取180μL(1.8X)AMPure XP Beads至“步骤4”产物中，使用移液器轻轻吹打10次充分混匀。
4)室温孵育5分钟。
5)将反应管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体。待溶液澄清后(大约5分钟)，小心移除上清。
6)保持EP管始终处于磁力架中，加入300μL新鲜配制的80％乙醇漂洗磁珠。室温孵育30秒，小心移除上清。
7)重复步骤“6”一次，总计漂洗两次。
8)保持EP管始终处于磁力架中，开盖空气干燥磁珠10分钟。
9)将EP管从磁力架中取出，加入33μL灭菌超纯水进行DNA洗脱。涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打充分混匀。室温孵育2分钟。
10)将反应管短暂离心后置于磁力架中分离磁珠和液体。待溶液澄清后(大约5分钟)，小心吸取30μL上清至灭菌PCR管中。
步骤6：配制如下组分，并加入至“步骤4”中得到的产物中：Rapid T4 DNA LigaseBuffer(2X)50uL，T4 DNA ligase 5uL，“步骤2”中制备的分子标签接头1uL，水14uL。运行如下程序：热盖105℃，20℃，15分钟，4℃终止程序。
步骤7：按照“步骤5”流程进行产物纯化，最终洗脱体积为23uL。
步骤8：文库预扩增
配制如下PCR反应液：High-Fidelity 2X PCR Master Mix 25uL，Universal PCRPrimer 1uL，Index Primer 1uL，“步骤7”中产物23uL。运行如下程序：热盖105℃，98℃， 30秒，98℃，10秒，65℃，30秒，72℃，30秒，10-15个循环，72℃，5分钟，4℃终止程序。按照“步骤5”流程进行产物纯化，最终洗脱体积为15uL。
步骤9：将“步骤8”文库产物与安捷伦SureSelect靶向捕获探针进行杂交，杂交产物进行PCR扩增富集，采用Illumina NextSeq500测序仪进行测序，测序策略为PE150。然后经BWA比对软件将测序所得序列与人类参考基因组hg19进行比对，采用本专利中的聚类分析方法，进行变异分析。
实施例2：
步骤1：采用Horizon公司DNA标准品，制作不同突变频率的阳性标准品，阳性标准品的信息如下：
基因 位点 标准品1 标准品2 标准品3
Gene Expected Allelic 0.50％ 0.30％ 0.10％
EGFR L858R 0.50％ 0.30％ 0.10％
EGFR E746-A750DEL 0.50％ 0.30％ 0.10％
EGFR T790M 0.50％ 0.30％ 0.10％
EGFR V769_D770insASV 0.50％ 0.30％ 0.10％
KRAS G12D 0.50％ 0.30％ 0.10％
NRAS Q61K 0.50％ 0.30％ 0.10％
NRAS A59T 0.50％ 0.30％ 0.10％
PIK3CA E545K 0.50％ 0.30％ 0.10％
步骤2：分子标签制作
1)合成好的单链A、单链B、单链C、单链D分别稀释至100uM；
2)将核酸单链A和B进行等摩尔退火，C和D进行等摩尔退火；
3)将混合后的A和B，C和D再次进行等摩尔混合，得到分子标签接头浓度为25uM；
步骤3：在PCR反应管中配制如下体系：End Prep Reaction Buffer(10X)6.5uL，T4DNA Polymerase 2.25uL，T4 Polynucleotide Kinase 3.25uL，DNA Polymerase I Klenowfragment 0.65uL，dNTP 2.6uL，标准品50ng，加水补足至65uL。运行如下反应：热盖 105℃，20℃，30分钟，65℃，30分钟，4℃终止程序。
步骤4：反应结束后，在以上反应体系中加入如下成分：dA Tail Addition Buffer(10X) 10uL，dATP Solution(10mM)2uL，DNA Polymerase I Klenow Fragment exo-3uL，水20uL。运行如下程序：热盖105℃，37℃，30分钟，4℃终止程序。
步骤5：按照如下步骤进行连接产物的纯化：
1)将末端修复产物转移至1.5mL低吸附EP管中。
2)将AMPure XP Beads平衡至室温，再涡旋振荡混匀。
3)吸取180μL(1.8X)AMPure XP Beads至“步骤4”产物中，使用移液器轻轻吹打10次充分混匀。
4)室温孵育5分钟。
5)将反应管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体。待溶液澄清后(大约5分钟)，小心移除上清。
6)保持EP管始终处于磁力架中，加入300μL新鲜配制的80％乙醇漂洗磁珠。室温孵育30秒，小心移除上清。
7)重复步骤“6”一次，总计漂洗两次。
8)保持EP管始终处于磁力架中，开盖空气干燥磁珠10分钟。
9)将EP管从磁力架中取出，加入33μL灭菌超纯水进行DNA洗脱。涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打充分混匀。室温孵育2分钟。
10)将反应管短暂离心后置于磁力架中分离磁珠和液体。待溶液澄清后(大约5分钟)，小心吸取30μL上清至灭菌PCR管中。
步骤6：配制如下组分，并加入至“步骤4”中得到的产物中：Rapid T4 DNA LigaseBuffer(2X)50uL，T4 DNA ligase 5uL，“步骤2”中制备的分子标签接头1uL，水14uL。运行如下程序：热盖105℃，20℃，15分钟，4℃终止程序。
步骤7：按照“步骤5”流程进行产物纯化，最终洗脱体积为23uL。
步骤8：文库预扩增
配制如下PCR反应液：High-Fidelity 2X PCR Master Mix 25uL，Universal PCRPrimer 1uL，Index Primer 1uL，“步骤7”中产物23uL。运行如下程序：热盖105℃，98℃， 30秒，98℃，10秒，65℃，30秒，72℃，30秒，10-15个循环，72℃，5分钟，4℃终止程序。按照“步骤5”流程进行产物纯化，最终洗脱体积为15uL。
步骤9：将“步骤8”文库产物与安捷伦SureSelect靶向捕获探针进行杂交，杂交产物进行PCR扩增富集，采用Illumina NextSeq500测序仪进行测序，测序策略为PE150。然后经BWA比对软件将测序所得序列与人类参考基因组hg19进行比对，采用本专利中的聚类分析方法，进行变异分析。三个标准品以及野生型标本中检出的突变结果如下：
基因 位点 标准品1 标准品2 标准品3 野生型
Gene Expected Allelic 0.54％ 0.24％ 0.11％ 未检出
EGFR L858R 0.49％ 0.34％ 0.10％ 未检出
EGFR E746-A750DEL 0.49％ 0.31％ 0.08％ 未检出
EGFR T790M 0.40％ 0.24％ 0.05％ 未检出
EGFR V769_D770insASV 0.58％ 0.30％ 0.10％ 未检出
KRAS G12D 0.42％ 0.19％ 0.10％ 未检出
NRAS Q61K 0.37％ 0.25％ 未检出 未检出
NRAS A59T 0.54％ 0.31％ 0.12％ 未检出
PIK3CA E545K 0.28％ 0.15％ 未检出 未检出
本专利中发明的分子标签设计方法中制备的分子标签，可以用于识别原始的DNA分子，起到溯源原始分子的作用，显著提高基因变异检测的准确性，经分子标签校正后， 2个及以上DNA模板共同支持的变异即为真实变异。
以上所述，是本发明较佳的实施例，并非本发明任何形式上或实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的技术人员，在不脱离本发明的范围前提下，还可以对之做一些修改和改进，这些改进和补充也应该视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 杭州迪安医学检验中心有限公司
<120> 一种用于二代测序技术检测DNA低频变异的分子标签及其应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tctttcccta cacgacgctc ttccgatct 29
<210> 2
<211> 7
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tgagtct 7
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agatcggaag agcacacgtc tgaactcca 29
<210> 5
<211> 6
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gactca 6
<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tctttcccta cacgacgctc ttccgatct 29
<210> 6
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tgagtcat 8
<210> 7
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
agatcggaag agcacacgtc tgaactcca 29
<210> 8
<211> 7
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tgactca 7

Claims (6)

1.一种用于二代测序技术检测DNA低频变异的分子标签，其特征在于，该分子标签包括两个“Y”型DNA分子，“Y”型DNA分子包括可变区、第一反向互补区、随机碱基区、第二反向互补区，所述可变区、第一反向互补区、随机碱基区、第二反向互补区依次通过磷酸二酯键连接。
2.根据权利要求1所述用于二代测序技术检测DNA低频变异的分子标签，其特征在于，所述分子标签包括核酸单链A、核酸单链B、核酸单链C、核酸单链D，
所述核酸单链A包括可变区A1、第一反向互补区A2、随机碱基区A3、第二反向互补区A4，
所述核酸单链B包括可变区B1、第一反向互补区B2、随机碱基区B3、第二反向互补区B4，
所述第一反向互补区A2的核苷酸序列与第一反向互补区B2的核苷酸序列反向互补，所述第二反向互补区A4的核苷酸序列与第二反向互补区B4的核苷酸序列反向互补；
所述核酸单链C包括可变区C1、第一反向互补区C2、随机碱基区C3、第二反向互补区C4，
所述核酸单链D包括可变区D1、第一反向互补区D2、随机碱基区D3、第二反向互补区D4，
所述第一反向互补区C2的核苷酸序列与第一反向互补区D2的核苷酸序列反向互补，所述第二反向互补区C4的核苷酸序列与第二反向互补区D4的核苷酸序列反向互补；
核酸单链B和核酸单链D的5’末端进行磷酸化修饰；
随机碱基区A3与随机碱基区B3中随机碱基的数值为n，随机碱基区C3与随机碱基区D3中随机碱基的数值为n+1，其中n为自然数，且2≤n≤15。
3.根据权利要求2所述用于二代测序技术检测DNA低频变异的分子标签，其特征在于，所述可变区A1、第一反向互补区A2的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，第二反向互补区A4的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示；
所述可变区B1、第一反向互补区B2的核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示，第二反向互补区B4的核苷酸序列为SEQ ID NO.4所示；
所述可变区C1、第一反向互补区C2的核苷酸序列为SEQ ID NO.5所示，第二反向互补区C4的核苷酸序列为SEQ ID NO.6所示；
所述可变区D1、第一反向互补区D2的核苷酸序列为SEQ ID NO.7所示，第二反向互补区D4的核苷酸序列为SEQ ID NO.8所示。
4.权利要求2或3所述用于二代测序技术检测DNA低频变异的分子标签的制备方法，其特征在于，将核酸单链A和核酸单链B等摩尔退火，将核酸单链C和核酸单链D等摩尔退火，然后将两者等摩尔混合，得到所述分子标签。
5.根据权利要求4所述用于二代测序技术检测DNA低频变异的分子标签的制备方法，其特征在于，所述退火采用的程序如下：94℃5分钟；92～16℃2分钟，每个循环降2℃，降温速率为0.1℃/秒。
6.一种用于二代测序技术检测DNA低频变异的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)提取样品中的ctDNA；
(2)对ctDNA进行末端修复、加A，并与权利要求3所述分子标签进行连接，然后进行PCR扩增，得到扩增产物；
(3)将步骤(2)中得到的扩增产物，与捕获探针进行杂交，得到捕获产物，经PCR扩增富集后，得到测序文库；
(4)对测序文库进行高通量测序，得到测序后的数据；
(5)数据分析：通过与人染色体基因组进行比对，可测得插入片段的起始位置，综合分子标签和DNA片段的起始位置，进行双重校正，校正方法如下：
a)标签序列一致，DNA起始位置一致，来源于同一个原始DNA分子；
b)标签一致，起始位置不一致，为不同来源的DNA分子；
c)标签不一致，起始位置一致，为不同来源的DNA分子；
d)标签不一致，起始位置不一致，为不同来源的DNA分子。
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