CN103627800A - 环境微生物快速检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种环境微生物的检测方法。１）微生物收集，微生物收集自空气滤网，２）微生物基因组提取，３）细菌16SrDNA扩增，真菌18SrDNA扩增，４）rDNA测序，５）数据分析，包括去污染序列、低质量序列，归并高相似度序列，序列注释；６）建立该环境细菌数据库，包含种类信息、序列信息和丰度信息；和该环境真菌数据库，包含种类信息、序列信息和丰度信息。本发明尤其适于对洁净区环境微生物进行普查，较常规基于培养的检测技术更加快捷、准确、灵敏，检测成本和时间大幅度降低，显著提高微生物污染监测和控制能力。另一方面，基因测序数据还提供了微生物分子水平的标记，对于追溯和判断微生物来源，准确识别污染源具有重要价值。

Description

环境微生物快速检测方法
技术领域
本发明涉及一种环境微生物的检测方法，可提高微生物的检测范围、节省检测费用、大幅度缩短检测时间。
背景技术
  微生物是自然界分布最广泛、数量最大的一类生物。它们个体微小、繁殖速度快、适应能力强。一些微生物经消化道入侵人体，比如说沙门氏菌、副溶血性弧菌、单增李斯特菌等，它们可造成胃肠道疾病，严重时会造成肝、脑、肾脏器损害，甚至死亡。而霉菌的危害在于它所产生的毒素，比如黄曲霉毒素、伏马菌素等，它们的毒性很强，具有很强的致癌性。另外，微生物及热原若通过粘膜或血管直接侵入人体，将对人体健康造成更严重、更直接的危害。因此，在食品及药品制造过程中，防范微生物污染至关重要。
目前，食品和制药工业普遍采用洁净技术对生产环境中的悬浮微粒、微生物、有毒有害气体进行控制。为同时确保洁净区人员的正常活动，亦须使空气温度、湿度及压力在适宜范围内。洁净厂房及设施的建造不但要采用不易产尘、便于清洁的建筑材料和结构，而且需对空气进行调温、调湿和净化处理，以满足规定净化级别要求。在这种条件下，生产环境中最大的产尘源和微生物污染源通常是操作人员、设备和物料。因此必须使洁净区空气往复循环、动态更新。在洁净区，净化空气一般来自房间顶部的送风口，流经操作区后，携带着人员、设备、设施和物料脱落的微粒（包括微生物）流向低压区域，最后进入回风口，补充新空气后，再次进入空调及过滤系统获得再生。这种有组织的、无紊流的空气流动方式被称为“单向流”。在回风口设置的滤网，可以拦截室内“脏”空气中悬浮的微生物，真实完整地反映洁净区微生物生态特征。洁净技术不但用于生产活动，在食品药品的检验，医疗服务、科学研究领域都有广泛应用。
洁净技术虽然能极大地降低食品药品受到微生物污染的风险，但并不是绝对的无菌环境，也不能杜绝外来微生物侵入被加工物料和产品。实际上，食品和口服药品均允许一定数量的非致病微生物残留。即便是无菌药品，在包装完成后，通常还要接受灭菌处理。只有非最终灭菌的无菌制品，才要求局部环境满足“绝对无菌”的要求。对洁净区或洁净室环境微生物进行监测不但是保证产品质量的要求，也是国家有关强制性法规的要求。洁净区实际上是一个特殊的生态环境，由于人员、设备、物料和大环境相对固定，微生物种群分布相对稳定，但也会随季节、房间消毒措施有规律地变化。了解微生物的种类及数量分布信息，掌握其变化规律，对于针对性地防范微生物污染具有重要意义。如生产环境中是否存在病原微生物；又如在处理淀粉和蛋白质含量较高的物料时，需关注是否存在某些霉菌；又如在生产热消毒产品时，需关注是否存在耐热微生物。此外，当发现产品受到特定微生物污染时，生产环境微生物监测数据将帮助技术人员找到潜在的污染源，进而采取有效的预防措施。另外在微生物检验时，环境而非样品中的微生物会造成检验结果的失真，如果有检验环境背景微生物信息（且具有分子水平的特征信息），就能对检验结果进行甄别。
然而，我国绝大多数的食品、药品生产企业的微生物检验能力还停留在细胞水平。这些检验方法是为适应产品放行检验而建立起来的，在开展微生物污染过程控制的检验方面普遍存在能力不足的情况。同时，传统的微生物学方法只能培养环境中不超过10%的微生物，不仅检测时间长，结果准确率差，而且效率低，工作量大。虽然业界已经开发了一些全自动微生物鉴定仪器，但是它们的鉴定范围受限于已知的微生物数据库。因此传统方法不能真实揭示微生物群落的多样性。总体上看，食品药品工业对于微生物污染处于相对被动的地位，不但缺乏对微生物侵染模式（如微生物种类、数量和途径）进行调查的手段，也缺乏量化的风险评价指标。实际生产中一味采用过度消毒（灭菌）措施，不但盲目低效，而且增加了环境污染和人员安全风险。对超标产品除了报废销毁，别无它途，也难以对后续生产起到指导作用。
发明内容
为监测洁净区微生物的种类和数量分布情况，提供背景环境的微生物信息，本发明提供了一种基于大规模基因测序技术的环境微生物快速检测方法。
     环境微生物检测方法，所述的环境为一个单向空气流向的环境，步骤如下：
１）微生物收集，所述的微生物收集自空气滤网，
２）微生物基因组提取，
３）细菌16S rDNA扩增，真菌18S rDNA扩增，
４）rDNA测序，
５）数据分析，包括去污染序列、低质量序列，归并高相似度序列，序列注释；
６）建立该环境细菌数据库，包含种类信息、序列信息和丰度信息；和该环境真菌数据库，包含种类信息、序列信息和丰度信息。
     优选地，所述的环境为需控制空气微粒和微生物污染的洁净区。
     优选地，步骤１）微生物收集的方法如下：定期收取单向流空气回风口的滤网，对在空气滤网上的微生物进行洗脱后，洗脱液先经过纱布进行初级过滤，去除大颗粒干扰物，过滤液再通过0.22μm滤膜，最终收集滤膜及其拦截的微生物作为待检测样本。
     优选地，步骤２）微生物基因组提取的方法如下：样本按照下列方法提取微生物基因组，将收集的微生物离心沉淀后，重悬于无菌PBS中，加入50μL溶菌酶(10 mg/mL), 6μL变溶菌素（25000 U/mL), 3μL溶葡球菌酶(4000 U/mL), 和41μL TE50溶液(10 mM Tris·HCL和50 mM EDTA, pH 8.0)，37°C消化一小时；然后加入0.1-mm-直径的石英砂，在振荡仪上2100 转，振荡5分钟，振荡后提取DNA。
     优选地，步骤３）中，对于细菌扩增V1到V3区域，正向引物序列AGAGTTTGATCCTGGCTCAG(SEQ ID NO 1)，反向引物序列：TTACCGCGGCTGCTGGCAC (SEQ ID NO 2),
对于真菌扩V4区域，正向引物序列GGCAAGTCTGGTGCCAG(SEQ ID NO３)，反向引物序列：ACGGTATCTRATCRTCTTCG (SEQ ID NO４)。
    优选地，步骤４）中，rDNA测序，测序仪优先采用Roche454、Illumina的Miseq，Hiseq二代测序仪。
   优选地，步骤５）中，对于拼接完的序列分别提交到greengenes.lbl.gov上的NAST和Bellerophon 3比对程序，和www.ncbi.nlm.nih.gov上的Nt/Nr库比对，过滤掉比对污染序列，剩余的序列利用BLAST软件和Greengenes数据库中已知的16S/18S序列数据库进行比对，一致性在95%以上的序列注释为相应的系统群，不满足的则为新的系统群；BLAST序列比对的具体判断标准为（a）与某种系的代表参照序列相比，未知菌株序列的相似性≥99％，未知菌株鉴定为该种；（b）与某种系的代表参照序列相比，未知菌株序列的相似性≥97％，但<99％，未知菌株鉴定为该属；（c）如未知菌株序列相似性≤97％，未知菌株不能鉴定为该种或属；（d）如存在两个或两个种系以上参照菌株与未知菌株序列相似性≥99％，且两者相似性相差≤0.5％，则暂将未知菌株归为其中相似性较高种系，但不排除未知菌株为另一种的可能性。
 优选地，相对于所述步骤１）搜集的微生物的对照样本的收集方法，利用细菌、真菌培养基，收集了该环境各个角落的微生物，包括沉降菌和悬浮菌，将所有的培养基的微生物混合后作为对照样本；同时，平板收集的微生物样本既可以作为对滤网收集的微生物进行有效性评估，还可以增加微生物的检测范围；滤网收集可以在72小时内得到结果，包括可培养和不可培养的微生物，平板收集晚于滤网收集但得到的菌种可以做进一步分析和保藏。
本发明的有益效果：在食品和药品制造行业，目前仍采用传统的基于培养的微生物监测方法。菌物采集主要依靠定量空气浮游菌采样法、沉降菌法和表面取样法，需要在洁净区多个位点及多个时间采样。然后分别用适于细菌和真菌生长的培养基进行培养，要经历7~14天的时间，才能通过菌落数量评价环境质量。这样的监测方式不但繁琐、复杂，而且对正常生产会产生影响，检验结果也显著滞后，且不能精确提供微生物种类信息。
本发明提出的基于大规模基因测序技术的环境微生物集群分析方法，尤其适于对洁净区环境微生物进行普查，如用于药品及食品生产和检验的洁净厂房或洁净室、或手术室。较常规基于培养的检测技术更加快捷、准确、灵敏，检测成本和时间大幅度降低，将帮助制药企业占据微生物污染攻防斗争的主动地位，显著提高微生物污染监测和控制能力。另一方面，基因测序数据还提供了微生物分子水平的标记，对于追溯和判断微生物来源，准确识别污染源具有重要价值。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
图1是：工作流程图。
图2是：滤网中微生物计数结果。将滤网中收集的微生物涂布在马铃薯平板，在48小时后观察发现有较多酵母，未见霉菌。总菌数105 cfu /ml。
图3是：可培养微生物计数结果。将平板微生物挑取混匀后，涂布在马铃薯平板，在48小时后观察发现有较多酵母，未见霉菌，基本与所挑菌落种类一致。
图4是：真菌分析维恩图。表示滤网中的真菌种类完全覆盖培养皿中的真菌种类。
图5是：细菌分析维恩图。表示滤网中的细菌种类能覆盖绝大多数完全覆盖培养皿中的真菌种类。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。
如图１所示，本发明的流程如下：
（1）微生物收集
收取回风口的空气滤网，利用无菌PBS对在滤网上的微生物进行洗脱后，洗脱液先经过纱布进行初级过滤，去除大颗粒的纤维等干扰物。过滤液再通过0.22μm滤膜，最终收集滤膜。作为待检测样本。
（2）微生物基因组提取
两组样本，分别按照下列方法提取微生物基因组。将收集的微生物离心沉淀后，重悬于0.5mL无菌PBS中，加入50μL溶菌酶(lyzosyme, 10 mg/mL), 6μL变溶菌素（mutanolysin, 25000 U/mL; Sigma- Aldrich), 3μL溶葡球菌酶(lysostaphin, 4000 U/mL; Sigma- Aldrich), 和41 μL TE50溶液(10 mM Tris·HCL和50 mM EDTA, pH 8.0)，37°C消化一小时。然后加入0.1-mm-直径的石英砂，在振荡仪上2100 转，振荡5分钟。振荡后的容易利用QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen) 提取DNA。
（3）细菌16S rDNA扩增，真菌18S rDNA扩增， 扩增得到不同来源的微生物群落16S/18S rRNA序列 
细菌检测V1到V3区域。正向引物序列AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，反向引物序列：TTACCGCGGCTGCTGGCAC；
真菌扩增引物X区域。正向引物序列GGCAAGTCTGGTGCCAG，反向引物序列：ACGGTATCTRATCRTCTTCG。
对于不同来源的样本，我们用带有不同Barcode的引物扩增，如，对于某一样本，我们的扩增引物将为：Bact-8F ACAGACAAGAGTTTGATCCTGGCTCAG 和Bact-533R ACAGACAGACGGGCGGTGTGTRCA，ACAGACA就为标记物，在最终得到的测序产物中，用于识别不同来源的样本。
（4）rDNA测序：增产物纯化，定量后，可采用454高通量测序仪或者其他类似的二代测序仪。
（5）对于测序结果进行数据分析，包括去污染序列、低质量序列，归并高相似度序列，序列注释以及菌种鉴定。
测序所得到的结果将低质量的结果去除后，根据不同的Barcode对序列的来源进行分类，然后拼接。对于拼接完的序列分别提交到greengenes.lbl.gov上的NAST和Bellerophon 3比对程序，和www.ncbi.nlm.nih.gov上的Nt/Nr库比对，过滤掉比对污染序列。剩余的序列利用BLAST软件和Greengenes数据库中已知的16S/18S序列数据库进行比对，一致性在95%以上的序列注释为相应的系统群，不满足的则为新的系统群。BLAST序列比对的具体判断标准为（a）与某种系的代表参照序列相比，未知菌株序列的相似性≥99％，未知菌株鉴定为该种；（b）与某种系的代表参照序列相比，未知菌株序列的相似性≥97％，但<99％，未知菌株鉴定为该属；（c）如未知菌株序列相似性≤97％，未知菌株不能鉴定为该种或属；（d）如存在两个或两个种系以上参照菌株与未知菌株序列相似性≥99％，且两者相似性相差≤0．5％，则暂将未知菌株归为其中相似性较高种系，但不排除未知菌株为另一种的可能性。（e）建立所测到的微生物的DNA指纹文库，用于今后的溯源等分析。
６）建立该环境细菌数据库，包含种类信息、序列信息和丰度信息；和该环境真菌数据库，包含种类信息、序列信息和丰度信息。
 
实施例1用测序方法进行空气滤网微生物鉴定
    a、在生物安全柜内，用无菌剪刀把每块滤膜剪成1.8—2.5×4.0-4.5cm，放入无菌大口玻璃瓶内，加入约500ml无菌的0.85%生理盐水，收集洗涤滤膜的菌液。并先用滤布粗过滤，收集的粗滤液。
b、收集的粗滤液，用0.22μm的细菌滤膜抽气过滤，去滤液，收集滤膜（一旦滤液流出速度慢，就得换过滤膜），到无菌试剂瓶内，加入约100ml无菌的 0.85%生理盐水，用力震荡洗涤滤膜。
c、收集滤膜洗脱液，按常规方法取样，10倍稀释法进行细菌，真菌的培养计数，并进行培养。霉菌未检出；酵母较多，未计数；总菌数105 cfu /ml。培养结果如图2所示：
d、其余的滤膜洗脱液经11000转离心10分钟，去掉上清液，用少量0.85%生理盐水洗下沉淀的菌体，装入1.5ml无菌的离心管内，贴上2013-05-q2,放入-20℃冰箱。
e、将收集的微生物离心沉淀后，重悬于0.5mL无菌PBS中，加入50μL溶菌酶(lyzosyme, 10 mg/mL), 6μL变溶菌素（mutanolysin, 25000 U/mL; Sigma- Aldrich), 3μL溶葡球菌酶(lysostaphin, 4000 U/mL; Sigma- Aldrich), 和41 μL TE50溶液(10 mM Tris·HCL和50 mM EDTA, pH 8.0)，37°C消化一小时。然后加入0.1-mm-直径的石英砂，在振荡仪上2100 转，振荡5分钟。振荡后的容易利用QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen) 提取DNA。
f、扩增得到不同来源的微生物群落16S/18S rRNA序列，采用454高通量测序仪。
g、对于测序结果进行数据分析、菌种鉴定，结果如下表1（真菌，由于18S rDNA鉴定除真菌外，还有动物、植物等，但在此不做表述）和表2（细菌，主要鉴定到属，但其序列特征可以保证其很好的溯源性）。
 
表1空气滤网微生物鉴定真菌鉴定结果
OTU 英文名 相对丰度（%）
1 Wickerhamomyces anomalus 67.47361
2 Torulaspora delbrueckii 18.1703
3 Saccharomycopsis fibuligera 6.530612
4 Meyerozyma guilliermondii 1.590429
5 Undaria pinnatifida 1.125968
6 Fusarium solani 0.872625
7 Aspergillus niger 0.830401
8 Rhodotorula mucilaginosa 0.717804
9 Candida parapsilosis 0.619282
10 Clathrospora diplospora 0.422238
11 fungal sp. FCAS89 0.267417
12 Sarocladium strictum 0.197044
13 Saccharomyces cerevisiae (baker's yeast) 0.197044
14 Monilinia fructicola 0.168895
15 Lodderomyces elongisporus 0.126671
16 uncultured Eleutherascus 0.084448
17 Knufia chersonesos 0.070373
18 uncultured eukaryote 0.070373
19 Aureobasidium pullulans 0.056298
20 Phoma sp. ZHA 0.056298
21 Eurotium amstelodami 0.056298
22 Pichia kudriavzevii 0.056298
23 Capnobotryella sp. MA 3619 0.028149
24 Exophiala nigra 0.028149
25 Peziza lobulata 0.028149
26 Ceratosphaeria lampadophora 0.028149
27 Myceliophthora fergusii 0.028149
28 Catenulostroma microsporum 0.014075
29 Opuntia sp. MCCPL-2012 0.014075
30 ultured fungus 0.014075
31 Cryptosphaeria sp. ATCC MYA-4414 0.014075
32 uncultured marine fungus 0.014075
33 uncultured organism 0.014075
34 Lichtheimia corymbifera 0.014075
表2空气滤网微生物鉴定细菌鉴定结果
OTU 英文名 相对丰度(%)
1 Pseudomonas 26.06152336
2 Staphylococcus 22.03632496
3 Lactococcus 7.841773705
4 Acinetobacter 4.24609343
5 Kocuria 2.290763315
6 Sphingomonas 1.979874008
7 Delftia 1.816248057
8 Pseudomonas 1.726253784
9 Sphingobacterium 1.668984701
10 Micrococcus 1.40309253
11 Ochrobactrum 1.059478033
12 Microbacterium 1.051296736
13 Neisseria 1.00220895
14 Lactococcus 0.93675857
15 Enhydrobacter 0.859036243
16 Acidovorax 0.809948458
17 Staphylococcus 0.719954185
18 Acinetobacter 0.715863536
19 Arthrobacter 0.691319643
20 Brachybacterium 0.683138346
21 Bacillus 0.662685102
22 Pseudomonadaceae 0.593144073
23 Gammaproteobacteria 0.43360877
24 Sphingomonas 0.421336824
25 Staphylococcus 0.40088358
26 Enterococcus 0.364067741
27 Pseudomonas 0.364067741
28 Microbacterium 0.359977092
29 Stenotrophomonas 0.347705146
30 Staphylococcus 0.3354332
31 Acinetobacter 0.3354332
32 Pseudomonadaceae 0.314979956
33 Pseudomonadales 0.306798658
34 Pseudoclavibacter 0.302708009
35 Paenibacillus 0.294526712
36 Staphylococcus 0.290436063
37 Streptococcus 0.290436063
38 Gammaproteobacteria 0.249529575
39 Enhydrobacter 0.212713736
40 Neisseriaceae 0.208623088
41 Rothia 0.196351141
42 Delftia 0.196351141
43 Pseudomonas 0.184079195
44 Sphingomonadales 0.179988546
45 Pseudomonas 0.175897897
46 Kytococcus 0.171807249
47 Staphylococcus 0.171807249
48 Alphaproteobacteria 0.163625951
49 Kocuria 0.159535302
50 Paenibacillus 0.159535302
51 Proteobacteria 0.155444654
52 Staphylococcus 0.151354005
53 Staphylococcus 0.151354005
54 Staphylococcus 0.151354005
55 Neisseria 0.151354005
56 Kocuria 0.147263356
57 Delftia 0.147263356
58 Bacilli 0.143172707
59 Staphylococcus 0.143172707
60 Acinetobacter 0.143172707
61 Aerococcus 0.139082058
62 Defluvibacter 0.139082058
63 Microbacterium 0.13499141
64 Brevundimonas 0.13499141
65 Defluvibacter 0.130900761
66 Delftia 0.126810112
67 Pseudomonadaceae 0.126810112
68 Bacillus 0.122719463
69 Neisseriaceae 0.122719463
70 Micrococcaceae 0.118628815
71 Bacillus 0.118628815
72 Moraxellaceae 0.118628815
73 Pseudomonadaceae 0.114538166
74 Comamonadaceae 0.110447517
75 Pseudomonas 0.110447517
76 Leuconostoc 0.106356868
77 Proteobacteria 0.106356868
78 Delftia 0.106356868
79 Enhydrobacter 0.106356868
80 Alphaproteobacteria 0.098175571
81 Neisseriaceae 0.098175571
82 Corynebacterium 0.094084922
83 Gammaproteobacteria 0.094084922
84 Tsukamurella 0.089994273
85 Bacillus 0.089994273
86 Proteobacteria 0.089994273
87 Lactococcus 0.085903624
88 Gammaproteobacteria 0.085903624
89 Acinetobacter 0.085903624
90 Xanthomonadaceae 0.085903624
91 Staphylococcus 0.081812976
92 Enterococcaceae 0.081812976
93 Bacteria 0.077722327
94 Lactococcus 0.077722327
95 Proteobacteria 0.077722327
96 Comamonadaceae 0.077722327
97 Gammaproteobacteria 0.077722327
98 Pseudomonadaceae 0.077722327
99 Bacteria 0.073631678
100 Bacteria 0.073631678
101 Corynebacterium 0.073631678
102 Bacillus 0.073631678
103 Defluvibacter 0.069541029
104 Pseudomonadales 0.069541029
105 Pseudomonadaceae 0.069541029
106 Bacteria 0.06545038
107 Staphylococcus 0.06545038
108 Staphylococcus 0.06545038
109 Lactococcus 0.06545038
110 Alphaproteobacteria 0.06545038
111 Delftia 0.06545038
112 Brevibacterium 0.061359732
113 Proteobacteria 0.061359732
114 Proteobacteria 0.061359732
115 Pseudomonas 0.061359732
116 Stenotrophomonas 0.061359732
117 Stenotrophomonas 0.061359732
118 Bacteria 0.057269083
119 Bacteria 0.057269083
120 Staphylococcus 0.057269083
121 Staphylococcus 0.057269083
122 Streptococcus 0.057269083
123 Bacteria 0.053178434
124 Micrococcus 0.053178434
125 Bacillales 0.053178434
126 Staphylococcus 0.053178434
127 Staphylococcus 0.053178434
128 Delftia 0.053178434
129 Microbacterium 0.049087785
130 Bacillus 0.049087785
131 Staphylococcus 0.049087785
132 Enterococcus 0.049087785
133 Proteobacteria 0.049087785
134 Proteobacteria 0.049087785
135 Enhydrobacter 0.049087785
136 Actinomycetales 0.044997137
137 Actinomycetales 0.044997137
138 Flavobacteriaceae 0.044997137
139 Elizabethkingia 0.044997137
140 Bacillus 0.044997137
141 Staphylococcus 0.044997137
142 Aerococcus 0.044997137
143 Leuconostoc 0.044997137
144 Proteobacteria 0.044997137
145 Defluvibacter 0.044997137
146 Comamonadaceae 0.044997137
147 Neisseriaceae 0.044997137
148 Moraxellaceae 0.044997137
149 Bacteria 0.040906488
150 Bacteria 0.040906488
151 Paenibacillus 0.040906488
152 Jeotgalicoccus 0.040906488
153 Staphylococcus 0.040906488
154 Lactobacillales 0.040906488
155 Proteobacteria 0.040906488
156 Alphaproteobacteria 0.040906488
157 Comamonadaceae 0.040906488
158 Comamonadaceae 0.040906488
159 Comamonadaceae 0.040906488
160 Delftia 0.040906488
161 Pseudomonadales 0.040906488
162 Moraxellaceae 0.040906488
163 Kocuria 0.036815839
164 Micrococcus 0.036815839
165 Staphylococcus 0.036815839
166 Staphylococcus 0.036815839
167 Lactobacillales 0.036815839
168 Lactococcus 0.036815839
169 Lactococcus 0.036815839
170 Streptococcus 0.036815839
171 Alphaproteobacteria 0.036815839
172 Caulobacteraceae 0.036815839
173 Defluvibacter 0.036815839
174 Moraxellaceae 0.036815839
175 Bacteria 0.03272519
176 Gp3 0.03272519
177 Actinomycetales 0.03272519
178 Chryseobacterium 0.03272519
179 Bacilli 0.03272519
180 Bacillales 0.03272519
181 Bacillaceae 0.03272519
182 Staphylococcus 0.03272519
183 Sphingomonadaceae 0.03272519
184 Comamonadaceae 0.03272519
185 Enhydrobacter 0.03272519
186 Pseudomonadaceae 0.03272519
187 Pseudomonadaceae 0.03272519
188 Pseudomonas 0.03272519
189 Bacteria 0.028634541
190 Corynebacterium 0.028634541
191 Kocuria 0.028634541
192 Kocuria 0.028634541
193 Micrococcus 0.028634541
194 Rothia 0.028634541
195 Elizabethkingia 0.028634541
196 Bacillales 0.028634541
197 Staphylococcus 0.028634541
198 Staphylococcus 0.028634541
199 Aerococcus 0.028634541
200 Lactococcus 0.028634541
201 Proteobacteria 0.028634541
202 Sphingomonadales 0.028634541
203 Neisseriaceae 0.028634541
204 Bacteria 0.024543893
205 Bacteria 0.024543893
206 Bacteria 0.024543893
207 Bacteria 0.024543893
208 Bacteria 0.024543893
209 Bacteria 0.024543893
210 Bacteria 0.024543893
211 Actinomycetales 0.024543893
212 Micrococcus 0.024543893
213 Rothia 0.024543893
214 Cellulosimicrobium 0.024543893
215 Planomicrobium 0.024543893
216 Staphylococcus 0.024543893
217 Aerococcus 0.024543893
218 Lactococcus 0.024543893
219 Proteobacteria 0.024543893
220 Proteobacteria 0.024543893
221 Proteobacteria 0.024543893
222 Rhizobiales 0.024543893
223 Defluvibacter 0.024543893
224 Defluvibacter 0.024543893
225 Defluvibacter 0.024543893
226 Delftia 0.024543893
227 Pseudomonadales 0.024543893
228 Enhydrobacter 0.024543893
229 Pseudomonadaceae 0.024543893
230 Stenotrophomonas 0.024543893
231 Bacteria 0.020453244
232 Bacteria 0.020453244
233 Bacteria 0.020453244
234 Bacteria 0.020453244
235 Bacteria 0.020453244
236 Bacteria 0.020453244
237 Bacteria 0.020453244
238 Actinomycetales 0.020453244
239 Actinomycetales 0.020453244
240 Actinomycetales 0.020453244
241 Actinomycetales 0.020453244
242 Kytococcus 0.020453244
243 Sphingobacterium 0.020453244
244 Sphingobacterium 0.020453244
245 Sphingobacterium 0.020453244
246 Bacilli 0.020453244
247 Bacillales 0.020453244
248 Bacillales 0.020453244
249 Bacillus 0.020453244
250 Ornithinibacillus 0.020453244
251 Staphylococcus 0.020453244
252 Staphylococcus 0.020453244
253 Staphylococcus 0.020453244
254 Enterococcus 0.020453244
255 Proteobacteria 0.020453244
256 Proteobacteria 0.020453244
257 Proteobacteria 0.020453244
258 omamonadaceae 0.020453244
259 Neisseria 0.020453244
260 Gammaproteobacteria 0.020453244
261 Gammaproteobacteria 0.020453244
262 Pseudomonadales 0.020453244
263 Moraxellaceae 0.020453244
264 Acinetobacter 0.020453244
265 Acinetobacter 0.020453244
266 Enhydrobacter 0.020453244
267 Enhydrobacter 0.020453244
268 Xanthomonadaceae 0.020453244
269 Bacteria 0.004090649
实施例2用测序方法进行平板收集微生物鉴定：
对同一环境的平板收集的微生物进行测序鉴定。与此同时，为证明回风口的滤膜中的微生物对洁净区环境微生物的代表性，采用常规定量空气浮游菌采样法、沉降菌采样法（在人员和物料进出口、操作区域没歌4h放置和更换平皿）和表面取样法（手套、房间壁面和设备表面）取样，并分别采用细菌和真菌培养基按规定培养。将培养获得的微生物混合后，作为对照样本。
a、用无菌牙签挑取不同颜色、不同形状、不同类的菌落，洗入到40ml的无菌生理盐水中，制成混合菌液（在挑取菌落时，肉眼观察发现细菌的种类大约十来种，优势菌六七种；真菌酵母菌优势菌两三种，还有两三个霉菌菌落。真菌的观察结果与滤网中的检测结果基本一致，细菌需要深入分析）。
b、取少量混合菌液稀释涂布于马铃薯培养基或细菌肉胨培养基。经48hr马铃薯平板涂布后观察，有较多酵母，但未见霉菌，基本与所挑菌落种类一致，这可能与霉菌数量少有关。结果如图3所示：
c、混合母液倒入无菌50ml离心管，经11000转离心10分钟，去掉上清液，收集沉淀，用少量0.85%生理盐水洗下，装入1.5ml无菌的离心管内；
d、将收集的微生物离心沉淀后，重悬于0.5mL无菌PBS中，加入50μL溶菌酶(lyzosyme, 10 mg/mL), 6μL变溶菌素（mutanolysin, 25000 U/mL; Sigma- Aldrich), 3μL溶葡球菌酶(lysostaphin, 4000 U/mL; Sigma- Aldrich), 和41 μL TE50溶液(10 mM Tris·HCL和50 mM EDTA, pH 8.0)，37°C消化一小时。然后加入0.1-mm-直径的石英砂，在振荡仪上2100 转，振荡5分钟。振荡后的容易利用QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen) 提取DNA。
e、扩增得到不同来源的微生物群落16S/18S rRNA序列，采用454高通量测序仪。
f、对于测序结果进行数据分析、菌种鉴定，结果表3（真菌），表4（细菌）。
表3真菌结果
OTU 英文名 相对丰度（%）
1 Wickerhamomyces anomalus 77.9
9 Candida parapsilosis 13
4 Meyerozyma guilliermondii 2.3
2 Torulaspora delbrueckii 2.2
27 Myceliophthora fergusii 1.4
10 Clathrospora diplospora 1.4
8 Rhodotorula mucilaginosa 0.89
15 Lodderomyces elongisporus 0.67
7 Aspergillus niger 0.064
表4 细菌结果
OTU 英文名 相对丰度(平板)
1 Pseudomonas 93.01211
88 Gammaproteobacteria 1.631273
27 Pseudomonas 1.522959
6 Sphingomonas 1.053599
73 Pseudomonadaceae 0.256015
8 Pseudomonas 0.236321
115 Pseudomonas 0.236321
75 Pseudomonas 0.200217
76 Leuconostoc 0.173959
3 Lactococcus 0.128007
32 Pseudomonadaceae 0.108314
188 Pseudomonas 0.105032
278 Enterobacteriaceae 0.085338
269 Bacteria 0.072209
38 Gammaproteobacteria 0.068927
277 Enterobacteriaceae 0.065645
187 Pseudomonadaceae 0.05908
276 Enterobacteriaceae 0.052516
43 Pseudomonas 0.049234
80 Alphaproteobacteria 0.049234
2 Staphylococcus 0.042669
9 Sphingobacterium 0.042669
44 Sphingomonadales 0.042669
12 Microbacterium 0.02954
29 Stenotrophomonas 0.02954
11 Ochrobactrum 0.026258
16 Acidovorax 0.026258
105 Pseudomonadaceae 0.026258
221 Proteobacteria 0.026258
273 Lactobacillus 0.026258
10 Micrococcus 0.022976
26 Enterococcus 0.022976
271 Bacteroides 0.022976
281 Bacteria 0.022976
4 Acinetobacter 0.019693
270 Bacteria 0.019693
272 Streptophyta 0.019693
275 Enterobacteriaceae 0.019693
21 Bacillus 0.016411
23 Gammaproteobacteria 0.016411
28 Microbacterium 0.016411
95 Proteobacteria 0.016411
274 Leptotrichia 0.016411
279 Pseudomonas 0.016411
280 Bacteria 0.016411
5 Kocuria 0.013129
13 Neisseria 0.013129
17 Staphylococcus 0.013129
20 Brachybacterium 0.013129
65 Defluvibacter 0.013129
121 Staphylococcus 0.013129
186 Pseudomonadaceae 0.013129
24 Sphingomonas 0.009847
155 Proteobacteria 0.009847
18 Acinetobacter 0.006564
48 Alphaproteobacteria 0.006564
63 Microbacterium 0.006564
64 Brevundimonas 0.006564
67 Pseudomonadaceae 0.006564
143 Leuconostoc 0.006564
220 Proteobacteria 0.006564
240 Actinomycetales 0.006564
241 Actinomycetales 0.006564
19 Arthrobacter 0.003282
35 Paenibacillus 0.003282
45 Pseudomonas 0.003282
49 Kocuria 0.003282
54 Staphylococcus 0.003282
61 Aerococcus 0.003282
83 Gammaproteobacteria 0.003282
97 Gammaproteobacteria 0.003282
106 Bacteria 0.003282
123 Bacteria 0.003282
141 Staphylococcus 0.003282
194 Rothia 0.003282
211 Actinomycetales 0.003282
214 Cellulosimicrobium 0.003282
218 Lactococcus 0.003282
227 Pseudomonadales 0.003282
250 Ornithinibacillus 0.003282
253 Staphylococcus 0.003282
g、 将培养皿收集和空气滤网收集的真菌进行比较，获得以下Venn图（如图4所示），我们发现在滤网中的真菌覆盖了所有培养皿中的真菌，同时相对优势的菌在培养皿中也成相对优势的菌，但不完全线性相关。
将培养皿收集和空气滤网收集的细菌进行比较，获得以下Venn图（如图5所示），我们发现在滤网中的细菌覆盖了大部分培养皿中的细菌菌，同时相对优势的菌在培养皿中也成相对优势的菌，但不完全线性相关。
丰度非线性相关主要由于以下两个原因造成：（1）由于培养皿中都为可培养菌，而滤网中含有不可培养的菌，还有一些培养皿中未能采集到的菌，因此相对的丰度可能与培养皿中的结果有一定变化；（2）培养基中的菌进行检测是根据人工挑取的，所以认为因素会干扰真实的丰度。
结论：利用16S/18S rDNA测序能很好的反映真实的微生物的组成，同时采用对滤网中菌的检测，可以很好的表明此环境中的菌的分布情况。
                         SEQUENCE LISTING
 
<110>  浙江天科高新技术发展有限公司
 
<120>  环境微生物快速检测方法
 
<160>  4    
 
<170>  PatentIn version 3.5
 
<210>  1
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  对于细菌扩增V1到V3区域，正向引物序列
 
<400>  1
agagtttgat cctggctcag                                                   20
 
 
<210>  2
<211>  19
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223> 对于细菌扩增V1到V3区域，反向引物序列
 
<400>  2
ttaccgcggc tgctggcac                                                    19
 
 
<210>  3
<211>  17
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  对于真菌扩增V4区域，正向引物序列
 
<400>  3
ggcaagtctg gtgccag                                                      17
 
 
<210>  4
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  对于真菌扩增V4区域，反向引物序列
 
<400>  4
acggtatctr atcrtcttcg                                                   20
 
 

Claims (8)

1.一种环境微生物检测方法，其特征在于，所述的环境为一个单向空气流向的环境，步骤如下：
１）微生物收集，所述的微生物收集自空气滤网，
２）微生物基因组提取，
３）细菌16S rDNA扩增，真菌18S rDNA扩增，
４）rDNA测序，
５）数据分析，包括去污染序列、低质量序列，归并高相似度序列，序列注释；
６）建立该环境细菌数据库，包含种类信息、序列信息和丰度信息；和该环境真菌数据库，包含种类信息、序列信息和丰度信息。
2.根据权利要求１所述的方法，所述的环境为需控制空气微粒和微生物污染的洁净区。
3.根据权利要求１所述的方法，其特征在于，步骤１）微生物收集的方法如下：定期收取单向流空气回风口的滤网，对在空气滤网上的微生物进行洗脱后，洗脱液先经过纱布进行初级过滤，去除大颗粒干扰物，过滤液再通过0.22μm滤膜，最终收集滤膜及其拦截的微生物作为待检测样本。
4.根据权利要求１所述的方法，其特征在于，步骤２）微生物基因组提取的方法如下：样本按照下列方法提取微生物基因组，将收集的微生物离心沉淀后，重悬于无菌PBS中，加入50μL溶菌酶(10 mg/mL), 6μL变溶菌素（25000 U/mL), 3μL溶葡球菌酶(4000 U/mL), 和41μL TE50溶液(10 mM Tris·HCL和50 mM EDTA, pH 8.0)，37°C消化一小时；然后加入0.1-mm-直径的石英砂，在振荡仪上2100 转，振荡5分钟，振荡后提取DNA。
5.根据权利要求１所述的方法，其特征在于，步骤３）中，对于细菌扩增V1到V3区域，正向引物序列AGAGTTTGATCCTGGCTCAG (SEQ ID NO 1)，反向引物序列：TTACCGCGGCTGCTGGCAC (SEQ ID NO 2),
对于真菌扩增V4区域，正向引物序列GGCAAGTCTGGTGCCAG (SEQ ID NO３)，反向引物序列：ACGGTATCTRATCRTCTTCG (SEQ ID NO４)。
6.根据权利要求１所述的方法，其特征在于，步骤４）中，rDNA测序，测序仪优先采用Roche454、Illumina的Miseq，Hiseq二代测序仪。
7.根据权利要求１所述的方法，其特征在于，步骤５）中，对于拼接完的序列分别提交到greengenes.lbl.gov上的NAST和Bellerophon 3比对程序，和www.ncbi.nlm.nih.gov上的Nt/Nr库比对，过滤掉比对污染序列，剩余的序列利用BLAST软件和Greengenes数据库中已知的16S/18S序列数据库进行比对，一致性在95%以上的序列注释为相应的系统群，不满足的则为新的系统群；BLAST序列比对的具体判断标准为（a）与某种系的代表参照序列相比，未知菌株序列的相似性≥99％，未知菌株鉴定为该种；（b）与某种系的代表参照序列相比，未知菌株序列的相似性≥97％，但<99％，未知菌株鉴定为该属；（c）如未知菌株序列相似性≤97％，未知菌株不能鉴定为该种或属；（d）如存在两个或两个种系以上参照菌株与未知菌株序列相似性≥99％，且两者相似性相差≤0.5％，则暂将未知菌株归为其中相似性较高种系，但不排除未知菌株为另一种的可能性。
8.根据权利要求１所述的方法，其特征在于，相对于所述步骤１）搜集的微生物的对照样本的收集方法，利用细菌、真菌培养基，收集了该环境各个角落的微生物，包括沉降菌和悬浮菌，将所有的培养基的微生物混合后作为对照样本；同时，平板收集的微生物样本既可以作为对滤网收集的微生物进行有效性评估，还可以增加微生物的检测范围；滤网收集可以在72小时内得到结果，包括可培养和不可培养的微生物，平板收集晚于滤网收集但得到的菌种可以做进一步分析和保藏。
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