CN102559862A

CN102559862A - 普洱茶微生物菌群中的优势真菌及其谱图

Info

Publication number: CN102559862A
Application number: CN2010106227699A
Authority: CN
Inventors: 闫希军; 李长文; 梁慧珍; 李巍; 李季; 张长霞; 刘冰
Original assignee: YUNNAN TASLY DEEPURE BIOLOGICAL TEA GROUP CO Ltd
Current assignee: YUNNAN TASLY DEEPURE BIOLOGICAL TEA GROUP CO Ltd
Priority date: 2010-12-24
Filing date: 2010-12-24
Publication date: 2012-07-11
Anticipated expiration: 2030-12-24
Also published as: CN102559862B

Abstract

本发明涉及普洱茶渥堆发酵过程中优势真菌菌群的鉴定方法及其专用引物。其中，所述鉴定方法包括以下步骤：1)取不同发酵过程中的普洱茶待测样品；2)提取待测样品的总DNA；3)以待测样品的总DNA为模板，在专用引物的引导下进行PCR扩增；4)对目的片段进行变性梯度凝胶电泳，sybrgreen染色后得到DGGE指纹图谱；5)回收优势条带，并以此为模板，在专用引物的引导下进行PCR扩增，对目的片段进行测序；6)对测序结果进行序列比对分析，确定普洱茶渥堆发酵优势真菌菌群结构。

Description

普洱茶微生物菌群中的优势真菌及其谱图

技术领域

本发明涉及普洱茶渥堆发酵过程中优势真菌菌群的鉴定方法及其专用引物。

背景技术

普洱熟茶是以云南特有大叶茶[Camellia sinensis(Linn)var.assamica(Masters)Kitamura]的晒青毛茶为原料，在微生物的作用下，经快速的人工渥堆后发酵而成的后发酵茶类。微生物在普洱茶的渥堆发酵生产过程中起着重要的作用，离开了微生物，普洱茶的品质和风味将得不到保证，本发明研究了渥堆发酵普洱茶中的优势微生物菌群，并提供了鉴定方法，如果将这些优势菌群用于普洱茶的渥堆发酵生产过程，将有利于普洱茶的生产和提高质量。

目前渥堆发酵普洱茶中微生物的研究，主要是应用传统微生物分离、纯化、鉴定等方法。传统的研究方法是首先从特定样品中取样，采用模拟自然环境的各种培养基和条件进行分离培养，通过纯培养获得菌株后，再对其表型特征、细胞的性质(形态学、生理生化反应和细胞组成成分结构的观察)进行观察收集，同时进行一系列繁杂的形态特征和生理生化实验，才能对其特性进行描述，这种方法又被称作经典方法。

应用传统方法可以分离培养的微生物不一定是优势菌群，只是它们适合并能够在人工培养条件下被分离纯化，不能动态反映大曲微生物菌群的生长状态。在实验技术上，普洱茶微生物研究仍停留在细胞水平，主要研究细菌、霉菌、酵母和放线菌单一的菌落形态和纯种的生长特性。在实验结果上，不能反映分离物间的系统发育关系，不能获得微生物多样性的真正概貌。因此传统的依靠培养的方法制约了人们对微生物生态的客观认识，对于人们正确认识微生物群落结构与功能，正确认识微生物资源，正确开发并利用这些资源造成了严重的障碍。

变性梯度凝胶电泳(DGGE)最初被用于基因的突变检测，任意位点的单碱基突变的DNA片段和原始的DNA片段能被分开，经过序列测定和比较就可以找出突变的位点。变性梯度凝胶电泳对不同DNA片段的分离原理是变性梯度凝胶电泳(DGGE)中同样长度但具有不同序列的DNA片段能够被分离，因为在含有呈线形增加梯度变性剂(尿素和甲酞胺)的混合物的聚丙烯酰胺凝胶电泳中部分解链的双链DNA分子的电泳迁移率降低。具有不同序列的DNA分子有不同的解链行为，将在凝胶的不同位置停止迁移。变性梯度凝胶电泳(DGGE)自1993年以来被用于环境微生物领域来研究环境样品中微生物的群落结构，它是建立在PCR反应对环境样品中的所有微生物的16SrRNA(原核生物)和18S rRNA(真核生物)等保守基因区间的DNA片断的扩增的基础上，这些被扩增出的DNA片断可以代表所有不同微生物的信息，这些使用同一引物对扩增出的不同微生物的DNA片断具有相同的碱基数，因此一般的电泳无法将它们分离开，这就为后续的进一步研究提出了新的问题。由于变性梯度凝胶电泳(DGGE)可以将不同碱基顺序的相同大小的DNA片段予以分离，所以PCR-DGGE可以对环境样品中的微生物群落进行研究。

然而渥堆发酵普洱茶与城市污水厂污泥和农田土壤的化学、物理性质高度异质，微生物数量和种群分布也明显不同，这就决定了不同环境下的样品在进行微生物群落构成分析时存在差异。目前国内外尚无关于运用PCR-DGGE技术进行渥堆发酵普洱茶微生物群落构成研究的相关报道。

发明内容

为提高普洱茶质量和提高普洱茶产量，本发明研究了普洱茶渥堆发酵过程中优势真菌菌群的鉴定方法，本发明通过提取全部真菌菌群中的DNA并从中分离出优势真菌菌群的DNA，测定优势真菌菌群的DNA结构，和标准真菌菌群比较，得到详细的优势真菌菌群的种类和名称。

本发明的另一个目的在于提供普洱茶渥堆发酵过程中优势真菌菌群的鉴定方法。

所述鉴定方法，包括以下步骤：

1)取渥堆发酵过程中不同翻堆次数和位置的普洱茶作为待测样品；

2)提取待测样品的总DNA，并对其进行纯化；

3)以待测样品的总DNA为模板，在专用引物的引导下进行PCR扩增，扩增结束后，对目的片段进行回收及纯化；

4)对纯化的目的片段进行变性梯度凝胶电泳，染色后得到DGGE指纹图谱；

5)从凝胶中回收优势条带，并以此为模板，在上游引物GeoA2：5′-CCAGTAGTCATATGCTTGTCTC-3′和；下游引物Geo11：5′-ACCTTGTTACGACTTTTACTTCC-3′，引导下进行PCR扩增，扩增结束后，对目的片段进行回收、纯化及测序；

6)步骤5的测序结果和标准菌群的序列进行比对，确定渥堆发酵普洱茶的优势真菌菌群。

其中，所述步骤2)的DNA提取采用试剂盒法，具体的操作步骤为：取5g茶叶样品，使用液氮冷冻研磨3次，转移到2ml离心管中，加入200mg玻璃珠。使用Omegasoil DNA提取试剂盒对处理好的茶叶样品进行提取，加入600ul SLX溶液，高速振荡10min混合均匀，70度水浴10min，期间混合样品数次，加入200ul SP2溶液，混合均匀，冰浴5min，13000g离心5min。上清转移到一个新的离心管中，加入0.7倍异丙醇，颠倒混匀，13000g离心10min，弃去上清，倒置于吸水纸上干燥，加入200ul elution buffer到离心管中，混匀，65度水浴20min溶解DNA。加入50ul HTR溶液，混合均匀，室温放置2min，13000g离心2min，将上清转移到一个新的离心管中，如果上清依旧带有深色物质重复加入HTR溶液处理。加入等体积的XP2溶液，充分混合均匀，之后将所有溶液转移到HiBind DNA柱子中，10000g离心1min，弃去流出液重新使用收集管。加入300ul XP2溶液，10000g离心1min，弃去流出液和收集管，把柱子放入一个新的收集管中，加入700ul经无水乙醇稀释过的SPW wash溶液，10000g离心1min，弃去流出液重新使用收集管，再用700ul SPW wash溶液洗一次，弃去液体，把柱子插入空的收集管中，13000g离心2min，将柱子放入50度烘箱30min。把柱子放到一个新的离心管中，加入50ul elution buffer到柱子中心，65度水浴10min，13000g离心1min。将离心洗脱液重新加入柱子中，65度水浴10min，13000g离心2min，所得洗脱液取5ul电泳检测。

所述步骤3)中的专用引物，第一步扩增采用的引物为GeoA2：5′-CCAGTAGTCATATGCTTGTCTC-3′和Geo11：5′-ACCTTGTTACGACTTTTACTTCC-3′；第二步扩增采用的引物为：NS31-GC：5’-CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGTTGGAGGGCAAGTCTGGTGCC-3’和Glol：5’-GCCTGCTTTAAACACTCTA-3’。

所述步骤3)中的PCR扩增条件为巢式PCR扩增：先加入扩增18S rDNA全长的引物和反应体系进行第一步扩增，PCR反应条件为：94℃预变性4min，然后在94℃变性45s，50℃-55℃引物复性45s，72℃引物延伸1.5min，循环30次，72℃终延伸10min；取其产物进行100倍稀释后作为模板，以18S rDNA为目标进行扩增，PCR反应条件为：94℃预变性4min，然后在94℃变性45s，50-55℃引物复性45s，72℃引物延伸1min，循环30-35次，72℃终延伸10min。

所述步骤4)中可先通过预试得到DGGE适宜的丙烯酰胺浓度梯度范围及所用时间。

所述步骤5)中在紫外灯下将优势条带用无菌手术刀小心割下，并在银染图谱中标记相应位置，经无菌水冲洗3遍后放入1.5mLEP管中，用灭菌枪头捣碎，加入30ul ddH₂O浸泡5小时。将EP管12000rpm离心5min，取上清作为PCR模板，在不带GC夹子的针对18S rDNA片段设计的特异引物NS31：5’-TTGGAGGGCAAGTCTGGTGCC-3’Glol：5’-GCCTGCTTTAAACACTCTA-3’的引导下，进行PCR扩增，50ul PCR反应体系为：10ng的DNA模板(一般用1μl)、50pmol每种引物、1μl dNTPs、5μl的10×PCRbuffer、2.5mmol/L的MgCl₂、3U的Taq DNA聚合酶，适量的双蒸水补足50μl。采用巢式PCR反应程序：94℃预变性4min，然后在94℃变性45s，50℃引物复性45s，72℃引物延伸1.5min，循环30次，72℃终延伸10min；反应结束后取3pl反应产物进行2％琼脂糖凝胶电泳检测，用CyC le-Pure DNA试剂盒对目的片段进行回收及纯化，并进行测序。测序由上海英骏生物技术公司进行。

所述步骤6)中可采用Blast程序在线(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)对测序结果进行序列比对分析，确定渥堆发酵普洱茶优势菌群结构。

本发明步骤3和步骤5中所述的引物为现有技术，可以买到，也可以通过现有技术合成。

本发明还提供了普洱茶渥堆发酵过程中优势真菌菌群及其DGGE谱图。

本发明所述的鉴定方法具有以下优点：

1、免培养高效提取微生物总DNA；

2、结合Bio-ID++软件对优势菌群进行半定量分析，以及通过测序比对完成的菌群定性分析，结果准确、可靠，逐步克服了常规的人工培养法对普洱茶菌群结构进行分析的不足。

3、从DGGE谱图上可以直观地看到优势真菌菌群条带，具体代表性。

基于上述优点，本发明将在普洱茶优势菌群结构的分析中发挥巨大作用

附图说明

图1、普洱茶渥堆发酵过程中真菌的PCR-DGGE谱图

具体实施方式

通过以下具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为对本发明的限制。

实施例1、本发明的鉴定方法

一、准备样品

对发酵普洱茶进行取样，按照不同翻堆次数以及在堆中的不同位置点取样，本实验用的是在取样。

二、总DNA的提取及纯化

取5g茶叶样品，使用液氮冷冻研磨3次，转移到2ml离心管中，加入200mg玻璃珠。使用Omega soil DNA提取试剂盒对处理好的茶叶样品进行提取，加入600ul SLX溶液，高速振荡10min混合均匀，70度水浴10min，期间混合样品数次，加入200ul SP2溶液，混合均匀，冰浴5min，13000g离心5min。上清转移到一个新的离心管中，加入0.7倍异丙醇，颠倒混匀，13000g离心10min，弃去上清，倒置于吸水纸上干燥，加入200ul elutionbuffer到离心管中，混匀，65度水浴20min溶解DNA。加入50ul HTR溶液，混合均匀，室温放置2min，13000g离心2min，将上清转移到一个新的离心管中，如果上清依旧带有深色物质重复加入HTR溶液处理。加入等体积的XP2溶液，充分混合均匀，之后将所有溶液转移到HiBind DNA柱子中，10000g离心1min，弃去流出液重新使用收集管。加入300ul XP2溶液，10000g离心1min，弃去流出液和收集管，把柱子放入一个新的收集管中，加入700ul经无水乙醇稀释过的SPW wash溶液，10000g离心1min，弃去流出液重新使用收集管，再用700ul SPW wash溶液洗一次，弃去液体，把柱子插入空的收集管中，13000g离心2min，将柱子放入50度烘箱30min。把柱子放到一个新的离心管中，加入50ul elution buffer到柱子中心，65度水浴10min，13000g离心1min。将离心洗脱液重新加入柱子中，65度水浴10min，13000g离心2min，所得洗脱液取5ul电泳检测

三、PCR扩增及产物回收、纯化

对纯化后的DNA进行PCR扩增，第一步扩增采用的引物为GeoA2：5′-CCAGTAGTCATATGCTTGTCTC-3′和Geo11：5′-ACCTTGTTACGACTTTTACTTCC-3′。第二步扩增采用的引物为：NS31-GC：5’-CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGTTGGAGGGCAAGTCTGGTGCC-3’和Glol：5’-GCCTGCTTTAAACACTCTA-3’。，以上引物全部由上海英骏生物技术公司合成。先加入扩增18S rDNA全长的引物和反应体系进行第一步扩增，50μl的PCR反应体系组成如下：10ng的DNA模板(一般用1μl)、50pmol每种引物、1μl dNTPs、5μl的10×PCR buffer、2.5mmol/L的MgCl₂、5U的Taq DNA聚合酶，适量的双蒸水补足50μl。PCR反应条件为：94℃预变性4min，然后在94℃变性45s，50℃引物复性45s，72℃引物延伸1.5min，循环30次，72℃终延伸10min；取其产物进行100倍稀释后作为模板，以18S rDNA为目标进行扩增，PCR反应条件为：94℃预变性4min，然后在94℃变性45s，55℃引物复性45s，72℃引物延伸1min，循环35次，72℃终延伸10min，目的产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测。电泳缓冲液为1×TAE缓冲液。

四、变性梯度凝胶电泳(DGGE)及凝胶成像扫描与分析

采用DCODE^TM系统(BIO-RAD)构建DGGE指纹图谱，具体方法为：，将各样品18S rDNA扩增纯化产物在10％聚丙烯变性胶中分离(丙烯酞胺浓度35％-60％，电泳缓冲液0.5-1x TAE)，100V，12h，样品点样量1000ng DNA。

五、优势条带的回收、测序与序列比对分析

在紫外灯下将优势条带用无菌手术刀小心割下，并在银染图谱中标记相应位置，经无菌水冲洗3遍后放入1.5mLEP管中，用灭菌枪头捣碎，加入30ul dd H₂O浸泡5小时。将EP管12000rpm离心5min，取上清作为PCR模板，在不带GC夹子的针对18S rDNA片段设计的特异引物NS31：5’-TTGGAGGGCAAGTCTGGTGCC-3’Glol：5’-GCCTGCTTTAAACACTCTA-3’的引导下，进行PCR扩增，50ul PCR反应体系为：10ng的DNA模板(一般用1μl)、50pmol每种引物、1μl dNTPs、5μl的10×PCRbuffer、2.5mmol/L的MgCl₂、3U的Taq DNA聚合酶，适量的双蒸水补足50μl。采用巢式PCR反应程序：94℃预变性4min，然后在94℃变性45s，50℃引物复性45s，72℃引物延伸1.5min，循环30次，72℃终延伸10min；反应结束后取3pl反应产物进行2％琼脂糖凝胶电泳检测，用CyC le-Pure DNA试剂盒对目的片段进行回收及纯化，并进行测序。测序由上海英骏生物技术公司进行。

采用Blast程序在线(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)进行序列比对分析，分析结果见表1

表1 普洱茶渥堆发酵过程中DGGE指纹图谱对应单个条带的序列比对分析

2-10	DQ345283.3	Arxula adeninivorans	100
				2-11	DQ345283.2	Debaryomyces hansenii	99
2-12	EU057520.1	Debaryomyces hansenii	100

表1中可以看出，在普洱茶渥堆发酵过程中有2个优势真菌，分别是Arxulaadeninivorans，Debaryomyces hansenii，生产过程中的不同阶段的优势真菌是不同的。

Claims

1.一种普洱茶渥堆发酵过程中优势真菌菌群的分子鉴定方法，包括以下步骤：

2)提取待测样品的总DNA，并对其进行纯化；

3)以待测样品的总DNA为模板，在专用引物——第一步扩增采用的引物为GeoA2：5′CCAGTAGTCATATGCTTGTCTC-3′和Geo11：5′-ACCTTGTTACGACTTTTACTTCC-3′；第二步扩增采用的引物为：NS31-GC：5’-CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGTTGGAGGGCAAGTCTGGTGCC-3’和Glol：5’GCCTGCTTTAAACACTCTA-3’的引导下进行PCR扩增，扩增结束后，对目的片段进行回收及纯化；

5)从凝胶中回收优势条带，并以此为模板，用上游引物GeoA2：5′-CCAGTAGTCATATGCTTGTCTC-3′和；下游引物Geo11：5′-ACCTTGTTACGACTTTTACTTCC-3′，组成的专用引物的引导下进行PCR扩增，扩增结束后，对目的片段进行回收、纯化及测序；

2.根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于，所述步骤2)的DNA提取采用试剂盒法，具体的操作步骤为：取5g茶叶样品，使用液氮冷冻研磨3次，转移到2ml离心管中，加入200mg玻璃珠，使用Omega soil DNA提取试剂盒对处理好的茶叶样品进行提取，加入600ul SLX溶液，高速振荡10min混合均匀，70度水浴10min，期间混合样品数次，加入200ul SP2溶液，混合均匀，冰浴5min，13000g离心5min，上清转移到一个新的离心管中，加入0.7倍异丙醇，颠倒混匀，13000g离心10min，弃去上清，倒置于吸水纸上干燥，加入200ul elution buffer到离心管中，混匀，65度水浴20min溶解DNA，加入50ul HTR溶液，混合均匀，室温放置2min，13000g离心2min，将上清转移到一个新的离心管中，如果上清依旧带有深色物质重复加入HTR溶液处理，加入等体积的XP2溶液，充分混合均匀，之后将所有溶液转移到HiBindDNA柱子中，10000g离心1min，弃去流出液重新使用收集管，加入300ul XP2溶液，10000g离心1min，弃去流出液和收集管，把柱子放入一个新的收集管中，加入700ul经无水乙醇稀释过的SPW wash溶液，10000g离心1min，弃去流出液重新使用收集管，再用700ul SPW wash溶液洗一次，弃去液体，把柱子插入空的收集管中，13000g离心2min，将柱子放入50度烘箱30min，把柱子放到一个新的离心管中，加入50ul elution buffer到柱子中心，65度水浴10min，13000g离心1min，将离心洗脱液重新加入柱子中，65度水浴10min，13000g离心2min，所得洗脱液取5ul电泳检测。

3.根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于，所述步骤3)中的PCR扩增条件为巢式PCR扩增：先加入扩增18S rDNA全长的引物和反应体系进行第一步扩增，PCR反应条件为：94℃预变性4min，然后在94℃变性45s，50℃-55℃引物复性45s，72℃引物延伸1.5min，循环30次，72℃终延伸10min，取其产物进行100倍稀释后作为模板，以18S rDNA为目标进行扩增，PCR反应条件为：94℃预变性4min，然后在94℃变性45s，50-55℃引物复性45s，72℃引物延伸1min，循环30-35次，72℃终延伸10min。

4.根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于，所述步骤4)中的染色液为sybrgreen，浓度为1∶10000稀释原液，1×TAE缓冲液，染色时间为20-40min，得DGGE图谱。

5.根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于，所述步骤4)中的DGGE电泳分离，电泳条件为：使用Bio-Rad公司的Dcode基因突变检测系统在80-120V，60℃下电泳8-14h，变性胶为聚丙烯酰胺凝胶，含有尿素和甲酰胺等变性剂，变性剂浓度范围为从35％到60％，胶浓度为8-10％。

6.根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于，所述步骤6)中采用Blast程序在线对测序结果进行序列比对分析，确定渥堆发酵普洱茶优势菌群结构。

7.根据权利要求3所述的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)对的发酵普洱茶进行取样，按照不同翻堆次数以及在堆中的不同位置点取样；

2)取5g茶叶样品，使用液氮冷冻研磨3次，转移到2ml离心管中，加入200mg玻璃珠，使用Omega soil DNA提取试剂盒对处理好的茶叶样品进行提取，加入600ul SLX溶液，高速振荡10min混合均匀，70度水浴10min，期间混合样品数次，加入200ul SP2溶液，混合均匀，冰浴5min，13000g离心5min，上清转移到一个新的离心管中，加入0.7倍异丙醇，颠倒混匀，13000g离心10min，弃去上清，倒置于吸水纸上干燥，加入200ul elution buffer到离心管中，混匀，65度水浴20min溶解DNA，加入50ul HTR溶液，混合均匀，室温放置2min，13000g离心2min，将上清转移到一个新的离心管中，如果上清依旧带有深色物质重复加入HTR溶液处理，加入等体积的XP2溶液，充分混合均匀，之后将所有溶液转移到HiBind DNA柱子中，10000g离心1min，弃去流出液重新使用收集管，加入300ul XP2溶液，10000g离心1min，弃去流出液和收集管，把柱子放入一个新的收集管中，加入700ul经无水乙醇稀释过的SPW wash溶液，10000g离心1min，弃去流出液重新使用收集管，再用700ul SPW wash溶液洗一次，弃去液体，把柱子插入空的收集管中，13000g离心2min，将柱子放入50度烘箱30min，把柱子放到一个新的离心管中，加入50ul elution buffer到柱子中心，65度水浴10min，13000g离心1min，将离心洗脱液重新加入柱子中，65度水浴10min，13000g离心2min，所得洗脱液取5ul电泳检测；

3)对纯化后的DNA进行PCR扩增，第一步扩增采用的引物为GeoA2：5’-CCAGTAGTCATATGCTTGTCTC-3’和Geo11：5’-ACCTTGTTACGACTTTTACTTCC-3’，第二步扩增采用的引物为：NS31-GC：5’-CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGTTGGAGGGCAAGTCTGGTGCC-3’和Glol：5’-GCCTGCTTTAAACACTCTA-3’，以上引物全部由上海英骏生物技术公司合成，先加入扩增18S rDNA全长的引物和反应体系进行第一步扩增，50μl的PCR反应体系组成如下：10ng的DNA模板、50pmol每种引物、1μl dNTPs、5μl的10×PCR buffer、2.5mmol/L的MgCl₂、5U的Taq DNA聚合酶，适量的双蒸水补足50μl，PCR反应条件为：94℃预变性4min，然后在94℃变性45s，50℃引物复性45s，72℃引物延伸1.5min，循环30次，72℃终延伸10min，取其产物进行100倍稀释后作为模板，以18S rDNA为目标进行扩增，PCR反应条件为：94℃预变性4min，然后在94℃变性45s，55℃引物复性45s，72℃引物延伸1min，循环35次，72℃终延伸10min，目的产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，电泳缓冲液为1×TAE缓冲液；

4)采用DCODE^TM系统构建DGGE指纹图谱，具体方法为：，将各样品18SrDNA扩增纯化产物在10％聚丙烯变性胶中分离，100V，12h，样品点样量1000ng DNA；

5)在紫外灯下将优势条带用无菌手术刀小心割下，并在银染图谱中标记相应位置，经无菌水冲洗3遍后放入1.5mLEP管中，用灭菌枪头捣碎，加入30uldd H₂O浸泡5小时，将EP管12000rpm离心5min，取上清作为PCR模板，在不带GC夹子的针对18S rDNA片段设计的特异引物NS31：5’-TTGGAGGGCAAGTCTGGTGCC-3’Glol：5’-GCCTGCTTTAAACACTCTA-3’的引导下，进行PCR扩增，50ul PCR反应体系为：10ng的DNA模板(一般用1μl)、50pmol每种引物、1μl dNTPs、5μl的10×PCR buffer、2.5mmol/L的MgCl₂、3U的Taq DNA聚合酶，适量的双蒸水补足50μl，采用巢式PCR反应程序：94℃预变性4min，然后在94℃变性45s，50℃引物复性45s，72℃引物延伸1.5min，循环30次，72℃终延伸10min；反应结束后取3pl反应产物进行2％琼脂糖凝胶电泳检测，用CyC le-Pure DNA试剂盒对目的片段进行回收及纯化，并进行测序，测序由上海英骏生物技术公司进行；

6)步骤5的测序结果和标准菌群的序列进行比对，确定渥堆发酵普洱茶的优势真菌菌群，采用Blast程序在线进行序列比对分析。