CN104878000A - 一种针对膨胀污泥中Type0092型丝状菌群聚合酶链式反应方法 - Google Patents
一种针对膨胀污泥中Type0092型丝状菌群聚合酶链式反应方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104878000A CN104878000A CN201510267145.2A CN201510267145A CN104878000A CN 104878000 A CN104878000 A CN 104878000A CN 201510267145 A CN201510267145 A CN 201510267145A CN 104878000 A CN104878000 A CN 104878000A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- type
- temperature
- time
- polymerase chain
- chain reaction
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
一种针对膨胀污泥中Type0092型丝状菌群聚合酶链式反应方法，涉及污水生物处理领域。反应体系：2倍浓度的Taq PreMix试剂12.5μl；DNA模板0.5-1μl；正向引物U27f(10μm/L)0.5-1μl；反向引物U1492r(浓度为10μm/L)0.5-1μl；加灭菌水到总体积25μl。程序：①1个循环：温度为94℃时间为2-5min。②35个循环：依次为变性温度94℃，时间20-45s；复性温度53-55℃，时间30-45s；延伸温度72℃，时间1-2min。③1个循环：温度72℃，时间5-8min。将扩增产物在1.5％的琼脂糖凝胶电泳中跑胶，得到分离良好的DNA亮条带。本发明快速准确地对Type0092型丝状菌群进行PCR反应扩增，进行鉴定分析，为后续分析提供基础。
Description
技术领域
本发明涉及污水生物处理领域，提供一种针对膨胀污泥中Type 0092型丝状菌群的聚合酶链式反应方法，可以快速准确地对Type 0092型丝状菌群进行PCR反应扩增，对污泥中Type 0092型丝状菌群进行鉴定分析，同时为后续该菌种定量分析提供基础。
背景技术
污泥膨胀一直以来是制约活性污泥法污水处理厂运行的常见问题，大量文献表明：大多数污泥膨胀问题是由丝状微生物过度增殖引起的。然而，在污水处理中引起污泥膨胀的丝状菌种类繁多，其中Type 0092型丝状菌群是引起各污水处理工艺污泥膨胀常见菌种之一。因此考察活性污泥中Type 0092型丝状菌群及与其相互作用菌种的群落结构特性以抑制其过度生长具有重要意义。
然而，目前国内外由于分析技术的限制，对于各种丝状菌的鉴定与分析方法也不尽相同，常用的丝状菌鉴定方法有：①Eikelboom丝状菌鉴定方法主要是通过对丝状菌进行革兰氏和纳氏染色，通过对丝状菌形态结构分析来对其进行分类。然而以丝状细菌形态学为基础的分类方法，存在着不足之处：一些丝状细菌如浮游球衣菌、Type1701和Type 0092能够根据生存环境的不同而改变其形态特征；另外，一些丝状细菌虽然在形态上相似，但它们的生理特征和在分类学上的类别却显著不同。②丝状菌的荧光原位杂交(FISH)方法是将相应的丝状菌DNA(或RNA)探针用特殊的核苷酸分子标记，然后将探针直接杂交到染色体或DNA纤维切片上，再用与荧光素分子偶联的单克隆抗体与探针分子特异性结合来进行丝状菌鉴定与分析。然而此方法无法进行后续特定菌种的准确定量及相关菌群发育树分析。
因此，目前缺乏针对特定优势丝状菌如Type 0092型丝状菌群的PCR分析方法，对特定优势丝状菌进行PCR扩增分析，后续进行相关菌群发育树及绝对定量分析。
发明内容
针对上述研究的不足之处，本发明提供针对Type 0092型丝状菌群聚合酶链式反应方法，可以快速准确地对Type 0092型丝状菌群进行PCR反应扩增，对污泥中Type 0092型丝状菌群进行准确鉴定分析，同时为后续该菌种绝对定量分析及相关菌群发育树的研究打下基础。
一种针对膨胀污泥中Type 0092型丝状菌群的引物，其核苷酸序列为：
正向：5’-GAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’
反向：5’-GGYTACCTTGTTACGACTT-3’。
一种针对膨胀污泥中Type 0092型丝状菌群聚合酶链式反应方法，其特征在于：
(1)Type 0092型丝状菌群聚合酶链式反应方法的反应体系：
2倍浓度的Taq PreMix试剂12.5μl；
DNA模板0.5-1μl；
正向引物U27f 0.5-1μl；正向引物序列为：
5’-GAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’，浓度为10μm/L；
反向引物U1492r 0.5-1μl；反向引物序列为：
5’-GGYTACCTTGTTACGACTT-3’，浓度为10μm/L；
加灭菌水到总体积25μl。
(2)Type 0092型丝状菌群聚合酶链式反应的反应程序：
①1个循环：温度为94℃时间为2-5min。
②35个循环：依次为变性温度94℃，时间20-45s；复性温度53-55℃，时间30-45s；延伸温度72℃，时间1-2min。
③1个循环：温度72℃，时间5-8min。
一种针对膨胀污泥中Type 0092型丝状菌群的PCR的试剂盒，包括所述引物。
针对膨胀污泥中Type 0092型丝状菌群聚合酶链式反应(PCR)方法，特征在于：
(1)Type 0092型丝状菌群聚合酶链式反应方法的反应体系：
2倍浓度的Taq PreMix试剂12.5μl；
DNA模板0.5-1μl；
正向引物U27f(序列为5’-GAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’，浓度10μm/L)0.5-1μl；
反向引物U1492r(序列5’-GGYTACCTTGTTACGACTT-3’，浓度10μm/L)0.5-1μl；
加灭菌水到总体积25μl。
(2)Type 0092型丝状菌群聚合酶链式反应的反应程序：
①1个循环：温度为94℃时间为2-5min。
②35个循环：依次为变性温度94℃，时间20-45s；复性温度53-55℃，时间30-45s；延伸温度72℃，时间1-2min。
③1个循环：温度72℃，时间5-8min。
(3)在保证以上反应体系和反应程序的基础上，进行Type 0092型丝状菌群聚合酶链式反应(PCR)反应，并将扩增产物在1.5％的琼脂糖凝胶电泳中跑胶，得到分离良好的DNA亮条带。
进一步，本发明膨胀污泥中Type 0092型丝状菌群聚合酶链式反应(PCR)方法：
(1)准备200μl离心管，依次加入2倍浓度的Taq PreMix试剂12.5μl；DNA模板0.5-1μl；正向引物U27f(10μm/L)0.5-1μl；反向引物U1492r(10μm/L)0.5-1μl；加灭菌水到总体积25μl；同时用灭菌水代替DNA模板进行阴性对照试验。
(2)将装有阴性对照及样品的200μl PCR反应离心管做好标记，放入TECHNE TC-512型PCR仪。
(3)设定反应程序：①1个循环：温度为94℃时间为2-5min。②35个循环：依次为变性温度94℃，时间20-45s；复性温度53-55℃，时间30-45s；延伸温度72℃，时间1-2min。③1个循环：温度72℃，时间5-8min。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)本发明提供的Type 0092型丝状菌群聚合酶链式反应(PCR)方法的反应体系和反应程序可以快速准确地进行Type 0092型丝状菌群PCR试验，可以得到分离效果良好的目的条带。
(2)本发明提供的Type 0092型丝状菌群聚合酶链式反应(PCR)方法可以准确地对膨胀污泥中Type 0092型丝状菌群进行定性分析。
(3)本发明提供的Type 0092型丝状菌群聚合酶链式反应(PCR)方法为后期膨胀污泥中Type 0092型丝状菌相关菌群发育树及其绝对定量分析打下了基础。
附图说明
图1为本发明Type 0092型丝状菌群纳氏染色图片(1000倍)
图2为本发明Type 0092型丝状菌群PCR产物1.5％琼脂糖凝胶电泳图
图3为本发明Type 0092型丝状菌群凝胶回收产物1.5％琼脂糖凝胶电泳图
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方法对本发明作进一步详细说明，本发明Type0092型丝状菌群聚合酶链式反应(PCR)包括以下步骤：
(1)将膨胀污泥进行革兰氏和纳氏染色，初步鉴定污泥中菌种，按照Eikeboom分类方法分析其中有无疑似Type 0092型丝状菌群(见图1)，如有进行下一步。
(2)用相应DNA提取试剂盒提取污泥中全部DNA。
(3)准备200μl离心管，依次加入2倍浓度的Taq PreMix试剂12.5μl；DNA模板1μl；正向引物U27f(10μm/L)0.8μl；反向引物U1492r(10μm/L)0.8μl；加灭菌水到总体积25μl；同时用灭菌水代替DNA模板进行阴性对照试验。
(4)将装有阴性对照及样品的200μl PCR反应离心管做好标记，放入TECHNE TC-512型PCR仪。
(5)设定反应程序：①1个循环：温度为94℃时间为5min。②35个循环：依次为温度94℃，时间45s；温度53℃时间45s；温度72℃时间2min。③1个循环：温度72℃时间8min。
(6)将PCR扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳试验，观察目的DNA条带的分离效果(图2)，如果分离效果良好，进行下一步。
(7)将目的条带进行割胶，用DNA回收试剂盒进行目的DNA纯化，将纯化产物跑胶看纯化分离效果，得到单一的亮条带，进行下一步(图3)。
(8)将目的DNA与载体连接后转化到感受态细胞。
(9)将转化后的感受态细胞涂板，37℃恒温箱过夜培养。
(10)挑菌摇菌将菌液送测序公司测序，将测序序列与目的菌种的DNA序列对比分析，发现与目的菌序列一致。
本发明在以下范围内做了多个实施例，都得到相同的效果。
(1)准备200μl离心管，依次加入2倍浓度的Taq PreMix试剂12.5μl；DNA模板0.5-1μl；正向引物U27f(10μm/L)0.5-1μl；反向引物U1492r(10μm/L)0.5-1μl；加灭菌水到总体积25μl；同时用灭菌水代替DNA模板进行阴性对照试验。
(2)将装有阴性对照及样品的200μl PCR反应离心管做好标记，放入TECHNE TC-512型PCR仪。
(3)设定反应程序：①1个循环：温度为94℃时间为2-5min。②35个循环：依次为变性温度94℃，时间20-45s；复性温度53-55℃，时间30-45s；延伸温度72℃，时间1-2min。③1个循环：温度72℃，时间5-8min。
本发明PCR产物的琼脂糖凝胶电泳试验发现条带分离效果好，条带明显。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种针对膨胀污泥中Type 0092型丝状菌群的引物，其核苷酸序列为：
正向：5’-GAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’
反向：5’-GGYTACCTTGTTACGACTT-3’。
2.一种针对膨胀污泥中Type 0092型丝状菌群聚合酶链式反应方法，其特征在于：
(1)Type 0092型丝状菌群聚合酶链式反应方法的反应体系：
2倍浓度的Taq PreMix试剂12.5μl；
DNA模板0.5-1μl；
正向引物U27f 0.5-1μl；正向引物序列为：
5’-GAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’，浓度为10μm/L；
反向引物U1492r 0.5-1μl；反向引物序列为：
5’-GGYTACCTTGTTACGACTT-3’，浓度为10μm/L；
加灭菌水到总体积25μl；
(2)Type 0092型丝状菌群聚合酶链式反应的反应程序：
①1个循环：温度为94℃时间为2-5min；
②35个循环：依次为变性温度94℃，时间20-45s；复性温度53-55℃，时间30-45s；延伸温度72℃，时间1-2min；
③1个循环：温度72℃，时间5-8min。
3.一种针对膨胀污泥中Type 0092型丝状菌群的PCR的试剂盒，包括，权利要求1所述引物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510267145.2A CN104878000A (zh) | 2015-05-24 | 2015-05-24 | 一种针对膨胀污泥中Type0092型丝状菌群聚合酶链式反应方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510267145.2A CN104878000A (zh) | 2015-05-24 | 2015-05-24 | 一种针对膨胀污泥中Type0092型丝状菌群聚合酶链式反应方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104878000A true CN104878000A (zh) | 2015-09-02 |
Family
ID=53945677
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510267145.2A Pending CN104878000A (zh) | 2015-05-24 | 2015-05-24 | 一种针对膨胀污泥中Type0092型丝状菌群聚合酶链式反应方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN104878000A (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105886503A (zh) * | 2016-06-15 | 2016-08-24 | 北京工业大学 | 一种针对膨胀污泥中Haliscomenobacter hydrossis丝状菌群特异性引物和方法 |
| CN106086170A (zh) * | 2016-06-15 | 2016-11-09 | 北京工业大学 | 一种针对膨胀污泥中Eikelboom Type 0092型丝状菌群特异性引物和方法 |
| CN106086176A (zh) * | 2016-06-15 | 2016-11-09 | 北京工业大学 | 一种Haliscomenobacter hydrossis丝状菌群PCR引物和方法 |
-
2015
- 2015-05-24 CN CN201510267145.2A patent/CN104878000A/zh active Pending
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| CATHERINE A. OSBORNE ET AL: "PCR-generated artefact from 16S rRNA gene-specific primers", 《FEMS MICROBIOLOGY LETTERS》 * |
| LACHLAN SPEIRS, ET AL.: "Filamentous Bacterium Eikelboom Type 0092 in Activated Sludge Plants in Australia Is a Member of the Phylum Chloroflexi", 《APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY》 * |
| 高莎 等.: "A2 O工艺活性污泥中可培养丝状细菌的多样性", 《环境科学》 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105886503A (zh) * | 2016-06-15 | 2016-08-24 | 北京工业大学 | 一种针对膨胀污泥中Haliscomenobacter hydrossis丝状菌群特异性引物和方法 |
| CN106086170A (zh) * | 2016-06-15 | 2016-11-09 | 北京工业大学 | 一种针对膨胀污泥中Eikelboom Type 0092型丝状菌群特异性引物和方法 |
| CN106086176A (zh) * | 2016-06-15 | 2016-11-09 | 北京工业大学 | 一种Haliscomenobacter hydrossis丝状菌群PCR引物和方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN109251963A (zh) | 恒温检测细胞培养液中支原体污染的方法及试剂盒 | |
| JP2003516710A (ja) | 核酸の検出方法 | |
| CN104046700A (zh) | 一种快速鉴定驴皮、马皮和骡子皮的检测试剂盒 | |
| CN102080130B (zh) | 一种磁珠富集法筛选芒属植物ssr标记的制备方法及应用 | |
| CN104878000A (zh) | 一种针对膨胀污泥中Type0092型丝状菌群聚合酶链式反应方法 | |
| CN107760767B (zh) | 一种小麦抗赤霉病多重荧光ssr标记检测方法 | |
| CN105039510B (zh) | 一种针对膨胀污泥中Haliscomenobacter hydrossis丝状菌群聚合酶链式反应方法 | |
| CN101586160A (zh) | 马尾松病死木中松材线虫的特异性检测引物、检测方法及其应用 | |
| CN113151567B (zh) | 用于鉴别花脸香蘑n006#菌株的ssr分子标记及方法 | |
| CN102329874B (zh) | 活性污泥中氨氧化菌实时荧光定量pcr检测方法 | |
| CN101570780A (zh) | 肉制品中布氏菌检测试剂盒及检测方法 | |
| CN105463093A (zh) | 一种用于鱼类线粒体全基因组扩增的引物、试剂盒及扩增方法 | |
| CN103468790A (zh) | 一组用于检测斑茅多态性的引物组、检测方法和用途 | |
| CN111554349B (zh) | 一种基于高通量测序的物种鉴定系统和方法 | |
| CN106399497A (zh) | 黄连木微卫星位点及引物和应用 | |
| CN105132576B (zh) | 用于分类检测水体及沉积物中四环素抗性基因tetO的引物序列及对应检测方法 | |
| WO2019173695A2 (en) | Microarray based multiplex pathogen analysis and uses thereof | |
| CN101914626A (zh) | 一种山羊品种ssr分子标记鉴定方法 | |
| CN110819734B (zh) | 苹果树腐烂菌lamp扩增引物及苹果树腐烂病检测试剂盒 | |
| CN106086176A (zh) | 一种Haliscomenobacter hydrossis丝状菌群PCR引物和方法 | |
| CN105886503A (zh) | 一种针对膨胀污泥中Haliscomenobacter hydrossis丝状菌群特异性引物和方法 | |
| Mirmajlessi et al. | General principles of real-time PCR: a technology for quantitative detection of phytopathogens | |
| CN101691613B (zh) | 一种利用lamp检测溶珊瑚弧菌的引物组、快速诊断试剂盒及检测方法 | |
| CN105316414B (zh) | 同时鉴定果汁饮料中多种耐热菌的基因快速筛查方法 | |
| CN112725426B (zh) | 一种用于波棱瓜性别鉴定的特异性scar分子标记、引物组、试剂盒、鉴定方法及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| EXSB | Decision made by sipo to initiate substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20150902 |