CN110273014A - 一种整合多重巢式pcr一步检测多种微生物的方法 - Google Patents

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徐汪节
王朝霞
潘雅君
彭丽娜
张曼
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Abstract

本发明公开了一种整合多重巢式PCR一步检测多种微生物的方法，包括：基于待测微生物DNA条码基因特点差异化设计NM‑PCR的通用引物和特异引物，NM‑PCR一步检测反应体系建立，即以待测微生物基因组DNA作为PCR反应模板进行参数优化，待测样本中微生物基因组快速DNA提取，以样本中基因组DNA作为模板进行NM‑PCR扩增反应，PCR反应产物进行凝胶电泳检测。本发明兼具巢式PCR的特异性和多重PCR的高通量，且仅需一步PCR反应完成上述两次PCR过程，避免传统PCR多步操作，可以快速大量检测临床样本如环境水源、食品的微生物污染情况，特异性强，通量高，大大缩短检测时间和成本。

Description

一种整合多重巢式PCR一步检测多种微生物的方法
技术领域
本发明涉及微生物检测技术领域，具体涉及一种整合多重巢式PCR一步检测多种微生物的方法，用于临床、食品领域病原细菌的快速PCR检测。
背景技术
微生物检测特别是病原性细菌检测在临床微生物检测、传染性疾病诊断和食品卫生安全监控等领域具有举足轻重的作用。传统的检测技术如常规培养、生化鉴定或者血清学分型等方法均存在一定局限性，如操作起来极其繁琐，耗时耗力，无法准确鉴定到微生物的基因型。近年来，基于核酸扩增的方法包括核酸序列扩增法(Nucleic Acid Sequence-Based Amplification，NASBA)、自列复制(Self-sustained Sequence Replication，3SR)、链置换扩增法(Strand Displacement Amplification，SDA)、聚合酶链式反应(PolymeraseChain Reaction，PCR)以及荧光定量PCR等，已应用于病原微生物及其毒性、耐药性和基因指纹图谱分析，其中PCR方法是目前应用最广泛的核酸扩增技术。
基于细菌16s rDNA(真菌18s rDNA)序列的高保守性和特异性，目前已经开发出多种PCR法来鉴定和检测样本中细菌，如多重PCR及PCR-EIA方法等。但是，由于临床标本或者环境中存在污染菌种杂、菌群密度不一以及污染量低等，现有的PCR检测方法很难解决高通量性(即同时检测多种细菌)与特异性准确性之间的矛盾。目前，已有巢式PCR和多重PCR联用可以部分解决上述难题，但现实操作中这两种PCR方法需要分步完成，操作繁琐，耗时耗力，过程环境增加污染概率，在通量性、灵敏度、特异性、快速性和易操作等方面存在缺陷。因此，急需开发一种高通量且特异灵敏的快捷一步法核酸扩增检测方法。
发明内容
本发明解决的技术问题在于克服现有PCR扩增技术高通量及特异性之间的缺陷，提供一种整合多重巢式PCR于一步PCR法检测多种微生物的方法，即Nested-multiplexPCR，简称NM-PCR，兼具巢式PCR的特异性和多重PCR的高通量，同时避免传统两步PCR法繁琐过程及增加污染的可能，可以快速大量检测临床样本如环境水源、食品的微生物污染情况，特异性强，通量高，大大缩短检测时间和成本。
本发明解决上述技术问题通过以下技术方案实现：
本发明的整合多重巢式PCR一步检测多种微生物的方法，包括以下步骤：
(1)基于待测微生物DNA条码基因(如细菌16s rDNA)差异化设计NM-PCR的通用引物和特异引物进行PCR扩增反应；其中：以巢式PCR引物为通用引物，以多重PCR引物为特异引物；
(2)提取步骤(1)中待测微生物标准株基因组DNA；
(3)将步骤(2)中基因组DNA作为PCR模板，优化NM-PCR参数并构建NM-PCR一步检测反应体系；
(4)将步骤(3)中NM-PCR一步检测反应体系进行待测样本中微生物检测，包含待测微生物基因组DNA富集阶段和待测微生物特异区域扩增阶段；
(5)将步骤(4)中所得PCR反应产物进行凝胶电泳检测，所得待测样本检测结果与待测细菌扩增片段理论值对照。
进一步，步骤(1)中，待测物种DNA条码基因位于两端的保守区域设计通用引物(序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示)，且引物长度在26bp以上，个别差异位点兼并碱基，退火温度为63℃～66℃；待测物种DNA条码基因变异区域设计片段长度不等的特异引物，且引物长度在20bp以内，GC含量均一，退火温度为53℃～56℃。
进一步，所述微生物包括:绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，SA)、肺炎克雷伯杆菌(Klebsiellapneumonia,KP)和嗜肺巴斯德杆菌(Pasteurellapneumotropica,PP)。
进一步，步骤(2)中，通过Chelex-100煮沸法提取待测微生物基因组DNA，过程为：菌样加无菌10％(w/v)Chelex-100溶液，在漩涡混合器上震荡5s，沸水浴10min，冷却至室温后离心，上清液即为基因组DNA溶液。
进一步，步骤(3)中，NM-PCR参数包括反应体系内通用引物和特异引物的浓度、DNA聚合酶用量、退火温度和扩增循环数。
更进一步，步骤(3)中，所述DNA聚合酶用量包括2.5U、4U、5U和6U四个梯度；和/或所述NM-PCR扩增反应包括40个NM-PCR总循环数；其中所述的40个NM-PCR总循环数包括：
富集阶段5个循环和检测阶段35个循环，或
富集阶段10个循环和检测阶段30个循环，或
富集阶段15个循环和检测阶段25个循环。
更进一步，步骤(3)中，所述的NM-PCR一步检测反应体系的组成为：rTaq PCR(5U/μl)1μL、10x PCR Buffer(Mg2+Plus)5μL、dNTPs(10mmol/L)1μL、通用引物UP-F(2.5μmol/L)1μL、通用引物UP-R(2.5μmol/L)1μL、特异引物(10μmol/L)0.625-1.5μL、DNA模板1μL、ddH2O补水至50μL。
更进一步，步骤(3)中，所述NM-PCR扩增反应的过程为：
先94℃预变性5min，94℃反应30s，65℃反应30s，72℃反应1min，共10个循环；
再94℃反应30s，55℃反应30s，72℃反应1min，共30个循环；
最后72℃延伸5min，降温至10℃结束反应。
本发明的上述技术方案中，将巢式和多重PCR采用差别化设计整合为一步NM-PCR，基于待测物种的DNA条码基因保守区设计巢式PCR引物作为通用引物，变异区设计多重PCR引物作为特异引物，巢式PCR引物长度至少26bp，多重PCR引物长度不超过20bp，GC含量均一，保证巢式PCR时退火温度高，多重PCR引物不工作；并且巢式PCR引物采用兼并碱基策略避免保守区个别位点的差异，保证扩增效率的一致性。另外，根据巢式PCR引物和多重PCR引物长度差异，NM-PCR采用不同退火温度达到巢式PCR富集和多重PCR特异性检测；其中，高退火温度(大于65℃)进行巢式PCR模板富集，多重PCR引物不工作减少背景杂带。采用巢式和多重PCR引物浓度不同，减少非特异性扩增，如巢式PCR过程中通用引物以较低浓度(单独扩增30循环电泳检测不出条带为上限浓度)既可进行模板的富集扩增，又不干扰后续多重PCR扩增的特异性。通过提高DNA聚合酶浓度增加循环数，提高扩增检测灵敏性。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明整合多重巢式PCR为一步NM-PCR检测多种微生物，能够优先检测出样本中多种微生物，具有高通量性；由于有富集区扩增环节，可以很好检测出样本中微量微生物，具有高灵敏性，可以快速大量检测临床样本如环境水源、食品的微生物污染情况，特异性强，通量高，大大缩短检测时间和成本，在临床诊断、食品领域微生物检测应用前景广。
附图说明
图1为本发明中NM-PCR法的原理示意图；其中：UP-F/UP-R为16s rDNA序列保守区的通用引物，P1/P1′、P2/P2′、P3/P3′和P4/P4′分别为各细菌16s rDNA序列变异区的特异引物。
图2为本发明实施例中检测四种细菌的灵敏性分析电泳图。
图3为本发明实施例中检测四种细菌的特异性分析电泳图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
实施例：实验动物SPF小鼠四种微生物感染监测分析
(1)样本收集处理
实验动物SPF级小鼠饲养需要进行微生物监测。本实施例拟监测SPF级小鼠的四种细菌感染：绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)，金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，SA)，肺炎克雷伯杆菌(Klebsiella pneumoniae，KP)和嗜肺巴斯德杆菌(Pasteurella pneumotropica，PP)。用咽拭子分别擦拭SPF小鼠饮水瓶嘴及小鼠口腔，以及收集小鼠粪便。咽拭子用1mL无菌10％(w/v)Chelex-100溶液洗涤、收集上清。称取20mg小鼠粪便放入灭菌研钵中，冰上彻底研碎后加入1mL无菌10％(w/v)Chelex-100溶液转移至EP管中，室温静置5min，收集上清液。
(2)样本微生物基因组DNA提取
将上述两种样本上清液12000rpm离心5min，弃上清，用100μL无菌10％(w/v)Chelex-100溶液重悬，合并至一个EP管中。在漩涡混合器上震荡5s，沸水浴10min，冷却至室温后离心，上清液即为基因组DNA溶液，用于后续PCR反应模板。
(3)四种细菌通用引物和特异引物设计
先下载四种细菌16s rDNA序列全长，利用DNAssist软件进行同源性比对，选定四种细菌的保守区域及变异区域。以保守区及变异区位点分别设计通用引物UP-F/UP-R，及四种细菌特异引物如下：
16s rDNA通用引物如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示：
UP-F:ACCTTGTTACGACTTCACCCCARTCAT
UP-R:GAGTTTGATCMTGGCTCAGRWTGAACGC
扩增产物长度：1493bp
绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)引物如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示：
PA-F:CTACTGAGCTAGAGTACG
PA-R:GATCCGGACTACGATCGGT
扩增产物长度：664bp
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，SA)引物如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示：
SA-F:GGATAACCTACCTATAAGACT
SA-R:ATGTGCACAGTTACTTACACAT
扩增产物长度：362bp
肺炎克雷伯杆菌(Klebsiellapneumonia，KP)引物如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示：
KP-F:TCATCGATTGACGTTACCCT
KP-R:TTCACATCCGACTTGACAGA
扩增产物长度：140bp
嗜肺巴斯德杆菌(Pasteurellapneumotropica，PP)引物如SEQ ID NO:9和SEQ IDNO:10所示：
PP-F：GTAAAGTTCTTTCGGTGAT
PP-R：TTATCACGTTAGCTACGGG
扩增产物长度：450bp
(4)NM-PCR反应体系中参数优化。
①NM-PCR反应中退火温度优化。利用四种细菌标准株基因组DNA为模板，单重PCR扩增。通用引物从60℃到70℃每1℃为一个梯度，确定通用引物扩增保守区最佳温度范围为63℃-66℃；余下四种细菌特异引物扩增16s rDNA变异区最佳温度范围为53℃-56℃，高于60℃基本无扩增条带。NM-PCR反应最佳退火温度为：保守区富集扩增阶段为65℃，四种特异性扩增阶段为55℃。
②NM-PCR反应中引物浓度优化。利用细菌标准株基因组DNA为模板，依据单PCR产物量浓度，优化NM-PCR多重体系中各引物浓度的配比，分别按照下面四组进行优化：
第一组：通用引物上下游引物(储存浓度各2.5μmol/L)为0.05μmol/L，四种菌PA、SA、KP和PP特异性上下游引物混合物(储存浓度各10μmol/L)均为0.125μmol/L；
第二组：通用引物上下游引物(储存浓度各2.5μmol/L)为0.05μmol/L，四种菌PA、SA、KP和PP特异性上下游引物混合物(储存浓度各10μmol/L)分别为0.25、0.125、0.125和0.25μmol/L；
第三组：通用引物上下游引物(储存浓度各2.5μmol/L)为0.05μmol/L，四种菌PA、SA、KP和PP特异性上下游引物混合物(储存浓度各10μmol/L)分别为0.2、0.125、0.125和0.3μmol/L；
第四组：通用引物上下游引物(储存浓度各2.5μmol/L)为0.05μmol/L，四种菌PA、SA、KP和PP特异性上下游引物混合物(储存浓度各10μmol/L)分别为0.25、0.25、0.25和0.3μmol/L；
最终确定最佳引物浓度为第三组。
③NM-PCR反应中DNA聚合酶用量优化。Taq DNA聚合酶用量设为四个梯度：2.5U、4U、5U和6U四个梯度，当酶量5U以上基本上没差别，采用酶量为5U。
④NM-PCR反应中循环数优化。按照NM-PCR扩增包含两个阶段，即16s rDNA全长序列富集阶段及单个细菌特异区域扩增检测阶段，将40个NM-PCR总循环数拆开按照三组进行优化：富集阶段5个循环，检测阶段35个循环；富集阶段10个循环，检测阶段30个循环；富集阶段15个循环，检测阶段25个循环；最佳循环数条件为：富集阶段10个循环，检测阶段30个循环；
(5)NM-PCR反应体系建立
①50μL反应体系中：
特异性上下游引物各按(4)中浓度配比，
DNA模板1μL，
ddH2O补水至50μL。
②NM-PCR反应参数设定：
首先94℃预变性5min；接着94℃30s，65℃30s，72℃1min，共10个循环；然后94℃30s，55℃30s，72℃1min，共30个循环；最后72℃延伸5min，降温至10℃结束反应。
③PCR产物电泳检测及结果：
取5μL PCR产物与1μL的6*loading buffer混合，进行1.2％琼脂糖凝胶电泳，100V，30min电泳结束后于凝胶成像系统检测结果，与待测细菌扩增片段理论值相对照，出现相似大小的扩增条带片段推测出样本中存在对应细菌。
(6)NM-PCR法灵敏性及高通量分析
①NM-PCR法高通量分析：
取多份PA、SA、KP和PP四种细菌的基因组DNA样品，按照单一细菌模板、两种细菌随机组合的复合模板、三种细菌随机组合的复合模板以及四种细菌随机组合的复合模板的方式配制成不同的待测样品，采用上述优化的条件，对其进行检测，结果如图2所示。
②NM-PCR法灵敏性分析：
取浓度相同的四种细菌总DNA基因组等体积混合在一起作为复合模板，按照10倍稀释，采用上述优化后NM-PCR法，并且以普通的多重PCR(无模板扩增富集)作为对照进行灵敏性检测，结果如图3所示，同时利用SPF级小鼠监测样品进行检测。
通过此实施例，可以通过本发明的一步NM-PCR同时检测四种细菌，较传统多重PCR法具有更高的灵敏度和高通量性，快速准确，稳定性好，特异性强，可以广泛应用于各行业微生物检测。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域技术人员而言，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
序列表
<110> 上海交通大学
<120> 一种整合多重巢式PCR一步检测多种微生物的方法
<141> 2019-06-04
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 27
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 1
accttgttac gacttcaccc cartcat 27
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 2
gagtttgatc mtggctcagr wtgaacgc 28
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 3
ctactgagct agagtacg 18
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 4
gatccggact acgatcggt 19
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 5
ggataaccta cctataagac t 21
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 6
atgtgcacag ttacttacac at 22
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
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tcatcgattg acgttaccct 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 8
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<211> 19
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 9
gtaaagttct ttcggtgat 19
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 10
ttatcacgtt agctacggg 19

Claims (7)

1.一种整合多重巢式PCR一步检测多种微生物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)基于待测微生物DNA条码基因差异化设计NM-PCR的通用引物和特异引物，进行PCR扩增反应；其中，以巢式PCR引物为通用引物，以多重PCR引物为特异引物；
(2)提取步骤(1)中待测微生物标准株基因组DNA；
(3)将步骤(2)中基因组DNA作为PCR模板，优化NM-PCR参数并构建NM-PCR一步检测反应体系；
(4)将步骤(3)中NM-PCR一步检测反应体系进行待测样本中微生物检测，包含待测微生物基因组DNA富集阶段和待测微生物特异区域扩增阶段；
(5)将步骤(4)中所得PCR反应产物进行凝胶电泳检测，所得待测样本检测结果与待测细菌扩增片段理论值对照；其中：
步骤(1)中，所述差异化设计NM-PCR的通用引物和特异引物包括：在待测物种DNA条码基因位于两端的保守区域设计通用引物，序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，且引物长度在26bp以上，个别差异位点兼并碱基，退火温度为63℃～66℃，待测物种DNA条码基因变异区域设计片段长度不等的特异引物且引物长度在20bp以内，GC含量均一，退火温度为53℃～56℃。
2.如权利要求1所述检测多种微生物的方法，其特征在于，所述微生物包括绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯杆菌和嗜肺巴斯德杆菌。
3.如权利要求1所述检测多种微生物的方法，其特征在于，步骤(2)中，提取待测微生物基因组DNA的过程为：菌样加无菌10％(w/v)Chelex-100溶液，在漩涡混合器上震荡5s，沸水浴10min，冷却至室温后离心，上清液即为待测微生物基因组DNA溶液。
4.如权利要求1所述检测多种微生物的方法，其特征在于，步骤(3)中，NM-PCR参数包括反应体系内通用引物和特异引物的浓度、DNA聚合酶用量、退火温度和扩增循环数。
5.如权利要求4所述检测多种微生物的方法，其特征在于，步骤(3)中，
所述DNA聚合酶用量包括2.5U、4U、5U和6U四个梯度；和/或
所述NM-PCR扩增反应包括40个NM-PCR总循环数，为：
富集阶段5个循环和检测阶段35个循环，或
富集阶段10个循环和检测阶段30个循环，或
富集阶段15个循环和检测阶段25个循环。
6.如权利要求1或4或5所述检测多种微生物的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的NM-PCR一步检测反应体系的组成为：rTaq PCR(5U/μl)1μL、10x PCR Buffer(Mg2+Plus)5μL、dNTPs(10mmol/L)1μL、通用引物UP-F(2.5μmol/L)1μL、通用引物UP-R(2.5μmol/L)1μL、特异引物(10μmol/L)0.625-1.5μL、DNA模板1μL、ddH2O补水至50μL。
7.如权利要求6所述检测多种微生物的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述NM-PCR扩增反应的过程为：
先94℃预变性5min，94℃反应30s，65℃反应30s，72℃反应1min，共10个循环；
再94℃反应30s，55℃反应30s，72℃反应1min，共30个循环；
最后72℃延伸5min，降温至10℃结束反应。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN113355437A (zh) * 2021-05-24 2021-09-07 杭州隆基生物技术有限公司 一种用于检测胃肠道内容物中5种致病菌的多重pcr引物探针组及试剂盒

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20170204452A1 (en) * 2014-07-23 2017-07-20 Steffen Mergemeier Method for the detection of sepsis

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20170204452A1 (en) * 2014-07-23 2017-07-20 Steffen Mergemeier Method for the detection of sepsis

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
丁振若等: "《现代检验医学》", 31 January 2007, 人民军医出版社 *
张勤等: "疟疾四重巢式PCR检测方法的建立", 《中国国境卫生检疫杂志》 *
祝岩波等: "金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和肺炎克雷伯杆菌多重PCR方法的建立与初步应用", 《中国比较医学杂志》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113355437A (zh) * 2021-05-24 2021-09-07 杭州隆基生物技术有限公司 一种用于检测胃肠道内容物中5种致病菌的多重pcr引物探针组及试剂盒

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