CN1995320A - 一种富集空气微生物的方法与专用装置 - Google Patents

Abstract

本发明公开了富集空气微生物的装置及方法。本发明所提供的富集空气微生物的装置，包括：壳体，所述壳体一端开口，另一端封闭，封闭端带有多孔网格；过滤收集组件，所述过滤收集组件可拆卸地连接于所述壳体的开口端；风机组件，所述风机组件包括页轮和与页轮连接的电动机，设于所述壳体内部；所述页轮的叶片端对着所述过滤收集组件。本发明采用直接吸入滤过式原理，在一定时间内对一定体积空气中全部微生物进行过滤富集，然后对富集的微生物进行核酸的提取、纯化处理，继而再结合相应的分子微生物学检测方法进行检测鉴定。

Description

一种富集空气微生物的方法与专用装置

技术领域

本发明涉及一种用于富集空气微生物的装置，以及用该装置富集空气微生物的方法。

背景技术

随着物质生活水平的提高，人们对空气质量的要求也越来越高。空气污染，特别是空气中病原微生物对人类健康带来的危害正日益受到重视。人类的许多重要传染病都可通过空气传播，有研究表明医院内获得性感染的患病率为3％～20％，而其中由空气微生物引起的呼吸道感染就约占15％～20％。如2003年在我国及周边地区暴发流行的SARS病毒，该病毒主要就是以气溶胶的形式在空气中扩散而传播的，这是一种典型的呼吸道——空气——呼吸道传播疾病；另一个例子就是最近发生的H5N1禽流感疾病，该病毒除可通过动物的分泌物而进入水、土壤中外，也可以气溶胶的形式而传播。由于空气中微生物的这种高危害性，因此使得对各种环境条件下空气微生物的及时、简便、准确的监测就有着重要的意义！

对空气微生物的高效、全面的采集是空气微生物准确检测的前提。目前对空气微生物的采集，主要有两种方式：一种是基于平板暴露式的静态沉降采集法，另一种是基于空气采集器的动态采集法。但这两种采集方法都具有一定的局限性。静态沉降法容易受到人为因数、环境湿度、温度、密闭性及场地多样性等外部条件限制而变数较大，结果既不全面也不稳定；而动态采集法，无论是离心式还是撞击式，虽然可以部分克服静态沉降采集法的缺陷，但也带来两个新的问题，一是气流的撞击易造成微生物的死亡，造成结果的假阴性；二是易受微生物大小与空气动力学相互作用的影响，造成在一定的空气动力学范围内，只能实现对一定范围大小的微生物粒子进行收集。

而且更重要的是，这两种采集方法还有一个共同的致命缺陷，即方法是建立在传统的微生物分离培养鉴定基础上的。也就是说空气微生物必须收集在有培养基的平皿上，通过培养增菌后，对菌落进行计数或再进行后续的分离培养结合形态特性、生化鉴定等方法检测。

我们知道空气微生物具有多样性的特征，其中既有细菌，也可能存有一些真菌孢子以及病毒等等，而显然普通的营养培养基是不可能实现对真菌和病毒等的收集的。即使是细菌也有许多是难培养的以及需要特殊条件培养的，如结核分支杆菌。而且这种分离培养鉴定方法还存在着操作复杂、特异性不强、所需时间长等缺点，再加上许多细菌生化特征、抗生素敏感型等表型特征不稳定，易受到基因调控、质粒获失及技术操作等方面的影响，因此易造成假阴性结果而导致漏诊或误诊。

发明内容

本发明的目的是一种富集空气微生物的装置及方法。

本发明所提供的富集空气微生物的装置，包括：

壳体，所述壳体一端开口，另一端封闭，封闭端带有多孔网格；

过滤收集组件，所述过滤收集组件可拆卸地连接于所述壳体的开口端；

风机组件，所述风机组件包括页轮和与页轮连接的电动机，设于所述壳体内部；所述页轮的叶片端对着所述过滤收集组件。

在本发明中，过滤收集组件包括膜前收集网槽、滤膜和膜后网式衬垫；所述膜前收集网槽与膜后网式衬垫相互连接，所述滤膜固定于两者之间；所述过滤收集组件通过膜后网式衬垫连接于所述壳体上。为了提高过滤收集组件之间的密封性，过滤收集组件还包括密封圈，所述密封圈设于膜前收集网槽和膜后网式衬垫之间。为了便于过滤收集组件的携带、灭菌、保存，所述过滤收集组件还配有前密封盖和后密封盖。在本发明中，常用滤膜选自尼龙膜滤膜、聚脂核孔膜、聚丙烯膜、醋酸纤维素膜、尼龙膜和聚偏二氟乙烯膜，滤膜孔径为0.1-10微米；优选的，所述滤膜为醋酸纤维素膜，孔径为0.22微米。

本发明中各种部件的连接方式有多种，通常可以采用螺纹连接。

为了能够精确控制空气微生物的收集量，富集空气微生物的装置还设有用于控制电动机的控制组件；所述控制组件嵌设于所述壳体的表面。

以及，为了方便本发明装置的使用和调节，富集空气微生物的装置还配有支撑架。所述支撑架包括高度可调试三脚架、方向可调试支撑架。

应用本发明装置进行空气微生物富集的方法，包括如下步骤：

1)清洗、消毒过滤收集组件，开动电动机，在过滤收集组件上收集空气微生物；

2)将过滤收集组件放入缓冲液中，清洗、离心，收集沉淀，富集得到空气微生物。

本发明采用直接吸入滤过式原理，在一定时间内对一定体积空气中全部微生物进行过滤富集，然后对富集的微生物进行核酸的提取、纯化处理，继而再结合相应的分子微生物学检测方法进行检测鉴定。

本发明采用了非培养基原理的富集方式，可克服由于营养条件及培养方式差异而造成的空气微生物收集的局限性，从而可实现对全部空气微生物，包括细菌、真菌、病毒等在内的一次性同步收集；本发明由于对接了非增菌培养的鉴定方式，其一可以充分利用现代分子微生物学检测高通量化、自动化、快速化的检测特性，从而克服传统分离培养鉴定法存在的操作复杂、特异性不强、所需时间长等缺点；其二可以通过对空气微生物的实时收集，实现对空气微生物的定量分析，避免由于增菌培养而造成的量化误差。而且这种主动式的直接吸入滤过收集方法，不仅可以克服静态沉降收集法中由于沉降系数不足或环境影响因素而造成收集不完整，而且也克服了离心式或撞击式空气采集器中由于离心力范围的局限性而造成只能对相应体积、重量大小微生物粒子收集的不足，从而尽可能的控制了由于环境因素、设备因素、人为因素以及微生物体积、重量大小等物理因素对收集的影响。

附图说明

图1为本发明富集空气微生物的装置的结构示意图；

图2为本发明装置的过滤收集组件的立体分解示意图；

图3A、图3B分别为膜前收集网槽的剖视图和立体图；

图4A、图4B分别为前密封盖的剖视图和立体图；

图5A、图5B分别为后密封盖的剖视图和立体图；

图6A、图6B分别为膜后网式衬垫的剖视图和立体图；

图7为不包括过滤收集组件的本发明富集空气微生物的装置的结构示意图；

图8为包括过滤收集组件的本发明富集空气微生物的装置的结构示意图。

具体实施方式

如图1、图7和图8所示，本发明富集空气微生物的装置包括：壳体1，壳体1的一端开口，另一端封闭，封闭端带有多孔网格；过滤收集组件2，用于收集空气微生物，过滤收集组件2可拆卸地连接于壳体1的开口端；风机组件3，风机组件3包括页轮32和与页轮连接的电动机31，设于壳体1内部，页轮32的叶片端321对着过滤收集组件2。电动机31带动页轮32转动，叶片321的转动在壳体1内部形成真空负压，使外部空气向过滤收集组件2流动，从而在过滤收集组件2上收集到空气中的微生物。

本发明富集空气微生物的装置还可以设置有控制组件4及支撑架5。控制组件4主要用于控制调节电动机31的工作模式，包括延时启动控制、收集时间、空气体积调节等调控模式，各种常用的单片机即可以达到要求，为了便于操作，可在壳体1上设置液晶屏41和操作面板42。支撑架5用于固定调节壳体1的高度以及方向等，包括高度可调试三脚架、方向可调试支撑架等。

如图2所示，过滤收集组件2包括膜前收集网槽21、滤膜23和膜后网式衬垫22；膜前收集网槽21与膜后网式衬垫22相互连接，滤膜23固定于两者之间，用于收集空气微生物，滤膜可为尼龙膜滤膜、聚脂核孔膜、聚丙烯膜、尼龙膜、聚偏二氟乙烯膜、醋酸纤维素膜等，滤膜孔径为0.1-10微米；优选的，滤膜为醋酸纤维素膜，滤膜孔径为0.22微米。为了提高膜前收集网槽21与膜后网式衬垫22连接的密封性，还在两者之间设置密封圈24。整个过滤收集组件2通过膜后网式衬垫22连接到壳体1的开口端。

在日常应用中，过滤收集组件2一般与壳体1分离，单独放置，在需要用来收集微生物时，再将过滤收集组件2与壳体1连接，组装成为本发明的富集空气微生物的装置。如图3A、3B，图4A和4B所示，膜前收集网槽21还配有前密封盖26；如图5A、5B，图6A和6B所示，膜后网式衬垫22也配有后密封盖25，这样，整个过滤收集组件2能够形成良好的密封性，可以防止滤膜23以及膜前收集网槽21与膜后网式衬垫22被灰尘及微生物所污染，保持过滤收集组件2的洁净度。为了便于拆卸以及密封，前密封盖27与膜前收集网槽21，膜前收集网槽21与膜后网式衬垫22，膜后网式衬垫22与后密封盖25，以及膜后网式衬垫22与壳体1的连接方式均采用螺纹连接；当然，其他的连接方式也是可行的，如快卡式连接或法兰式连接等。

应用上述富集空气微生物的装置对空气微生物的收集方法，包括如下步骤：

1)取出滤过收集组件中的滤膜前收集网槽，将滤膜放到滤膜后网式衬垫上，再盖上滤膜前收集网槽，与前后密封盖一起高压消毒处理。

2)停止消毒后，无菌条件下用前后密封盖盖住滤过收集组件，备用。

3)在收集场所，用酒精对收集装置主机中与滤过收集组件的结合处消毒处理，打开后密封盖，接上滤过收集组件。

4)根据需要设置延时启动设置，并对收集的空气体积、收集速度参数进行设置。

5)收集。

6)收集完毕后，先盖上前密封盖，连同取下滤过收集组件，封上后密封盖。以备核酸的提取。

7)无菌条件下取下滤过收集组件后密封盖，将前密封盖打开，连同滤过收集组件放入缓冲液中，清洗，离心。收集沉淀，收集得到空气微生物。

对收集得到的空气微生物可以进一步进行分析处理，例如，可以进行核酸提取：沉淀中加入裂解液，采用酚-氯仿抽提法或玻璃珠法进行核酸的提取、纯化。

本文提及的核酸，主要是指DNA或RNA。在实际应用中，可以根据不同检测方法的需要，或不同微生物的特征，对微生物的DNA或RNA分别提取或实现同步提取。

对微生物核酸的提取，现在已有许多商品化的核酸提取试剂供应，如Invitrogen公司的TRIzol Reagent(总RNA提取)及DNAzol Reagent(总DNA提取)；美国MRC公司的Genomic DNA Purification Kit(基因组DNA提取)；Toyobo公司的MagExtractor-Genome(基因组DNA磁珠分离试剂)及MagExtractor-RNA(总RNA磁珠分离试剂)等等。甚至还可运用自动化的核酸提取仪器进行核酸的提取，如美国应用生物系统公司6100型核酸提取仪以及生物梅里埃公司的NucliSENSeasyMAG全自动核酸提取仪等等。这些商品化的提取试剂盒和自动提取仪器均带有提取所需的配套试剂，并附有标准的方法步骤和程序。操作者只要严格按照方法步骤执行，均可以顺利实施收集微生物的核酸提取。

不同公司的提取产品，虽然在试剂组成和方法上有一定的差异，但其本质一般都是基于传统的酚-氯仿抽提法或玻璃珠分离法而进行的。因此，本文分别以传统的酚-氯仿抽提法及玻璃珠法为例来说明微生物核酸的提取步骤和过程，方法主要参考《精编分子生物学实验指南》((美)F.奥斯伯等著，颜子颖，王海林译。北京：科学出版社，1998年第一版)。

(一)酚-氯仿抽提法制备微生物基因组DNA：

(1)细菌沉淀中加入5-10倍体积的裂解液(100mmol/L NaCl，10mmol/L Tris·Cl，25mmol/L EDTA，0.5％SDS，pH8.0，使用前加入10μg/mL蛋白酶K)；混匀；

(2)55～60℃水浴10～20分钟；离心：12000g×10分钟；取上清；

(3)加入100μL 5mol/L的NaCl，充分混匀，再加入80μL CTAB/NaCl溶液(10％CTAB，0.7mol/L NaCl)混匀，65℃温育10分钟；

(4)加入等体积的氯仿：异戊醇(24∶1)混匀；离心：12000g×10分钟；吸取上层水相；

(5)再加入等体积的酚、氯仿、异戊醇(25∶24∶1)；混匀；离心：12000g×10分钟；

(6)吸取上层水相，加入0.6体积异丙醇，轻轻混匀至DNA沉淀；离心，弃上清；加入2倍体积的预冷无水乙醇，充分混匀，-20℃放置30分钟；离心：4℃，12000g×10分钟；

(7)轻轻倒去上清液，倒置于滤纸上，尽量沾干多余液体；在真空干燥器内干燥沉淀物；

(8)用小体积TE缓冲液(10mmol/L Tris·Cl，1mmol/L EDTA，pH8.0)溶解沉淀物，备检测用。

(二)玻璃珠法提取微生物基因组DNA：

(1)细菌沉淀中加入5-10倍体积的裂解液(同上)；混匀；55～60℃水浴10～20分钟；离心：5000g×10分钟；取上清；

(2)加入等体积的18mol/L的NaI(2.25g Na₂SO₃溶于40mL H₂O中，加入135gNaI搅拌溶解)，加入1/2体积的玻璃珠悬液(200-300μl的200μm玻璃珠与等体积水混合，使用前短暂涡旋振荡)，室温下5分钟；稍加离心；弃上清；

(3)1mL洗涤液(20mmol/L Tris·Cl，1mmol/L EDTA，100mmol/L NaCl，加入等体积100％乙醇)将DNA/玻璃珠沉淀洗3次，轻轻涡旋振荡混匀后，稍加离心沉淀玻璃珠；

(4)TE缓冲液(同上)重悬沉淀，使终浓度为0.5μg/μL。于45℃温育2-3分钟，以将DNA从玻璃珠上洗脱下来。

(5)离心1分钟，收集上清，备用。

(三)酚-氯仿抽提法制备微生物RNA：实验所用的溶液均用EDPC水处理配置；实验所用玻璃器皿均在300℃干烤4小时；塑料制品用EDPC水浸泡处理后高压灭菌，以避免RNA酶污染。

(1)细菌沉淀中加入5-10倍体积的裂解液(同上，DFPC水配置)；混匀；55～60℃水浴10～20分钟；离心：12000g×10分钟；取上清；

(2)加入等体积的酚、氯仿、异戊醇(25∶24∶1)抽提；高速离心5分钟，取上层水相；

(3)用酚、氯仿、异戊醇(25∶24∶1)再抽提一次；用氯仿：异戊醇(24∶1)抽提；取上层水相；

(4)加入15μL 5mol/L NaCl，并2倍体积加预冷无水乙醇充分混匀，-20℃放置30分钟；离心：4℃，12000g×10分钟；

(5)沉淀用预冷70％乙醇冲洗，晾干。用95μL DNA酶消化缓冲液溶解沉淀，加入4μL 2.5mg/mL无RNA酶的DNA酶I，37℃水浴1小时；

(6)用酚、氯仿、异戊醇(25∶24∶1)再抽提一次；移出水相；有机相中加入100μLTE缓冲液混匀，离心：4℃，12000g×10分钟；合并两次水相；

(7)加入等体积的氯仿：异戊醇(24∶1)抽提；加入10μL 5mol/L NaCl，600μL预冷无水乙醇充分混匀，-20℃放置30分钟；离心：4℃，12000g×10分钟；

(8)沉淀用预冷70％乙醇冲洗，晾干。用DEPC水溶解，-70℃保存备用。

对收集到的核酸可进行相应的检测分析，目前相关的分子生物学检测方有很多，常用的包括核酸杂交、限制性片段多态性分析、PCR、LCR及荧光定量PCR等。本文分别以较为常用的PCR、RT-PCR以及芯片检测为例说明。

(一)PGR检测方法包括如下步骤：

(1)针对检测目标，设计特异检测片段及相对应的特异引物，并合成引物；引物长度一般设计为15-30bp，常用为20bp左右。检测片段即引物扩增长度一般为200-500bp。

(2)冰上按下列组份配置PCR反应液：以TAKARA生物有限公司的Ex Taq DNA聚合酶试剂盒为例(DRR01AM)。

10×扩增缓冲液    10μL

4种dNTP混合物     各200μmol/L

引物              各10～100pmol

模板DNA           0.1～2μg

Taq DNA聚合酶     2.5U

Mg²               1.5mmol/L

加双或三蒸水至    100μL

(3)反应管放入PCR仪中。并基于PCR原理设置变性-退火-延伸三个温度点及相应反应程序。在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性(一般优选设置为94℃，1分钟)，再迅速冷却至40～60℃(一般优选设置为引物Tm值-5℃，30-60秒)，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃(一般优选设置为72℃，反应时间设置根据150核苷酸/秒/酶分子，一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min足够)，在Taq DNA聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。反应循环一般设置为28-35个。

(4)琼脂糖凝胶电泳对PCR产物检测。

(二)RT-PCR检测。RT-PCR一般分为两步法和一步法，分别如下：

RT-PCR两步法：

(1)冰上按下列组份配置RT反应液：以TAKARA生物有限公司的RNA PCR Kit(AMV)为例(DRR019A)。

10×RT缓冲液              1μL

dNTP混合物(各2.5mmol/L)       2μL

RNase Inhibitor(40U/μL)  0.25μL

Random 9mers(50pmol/μL)

或Oligo dT-Adaptor Primer(2.5pmol/μL)

或特异性下游引物             0.5μL

微生物RNA样品              ≤1μg total RNA

RT反转录酶(5U/μL)         0.5μL

Mg²(25mmol/L)              2μl

加RNase Free dH₂O至        10μL

(2)在PCR仪中，设置下列条件反应：42℃反应15-30分钟，99℃反应5分钟，然后5℃反应5分钟。若是使用Random 9mers为引物，则必须在42℃反应前先设置30℃反应10分钟。

(3)再以逆转录获得的cDNA为模板，进行PCR反应，反应步骤同上述的PCR检测方法。

RT-PCR一步法：

(1)冰上按下列组份配置RT-PCR反应液：以TAKARA生物有限公司的One StepRNA PCR Kit(AMV)为例(DRR024A)

10×One Step RT-PCR缓冲液    5μL

dNTP混合物(各2.5mmol/L)      5μL

RNase Inhibitor(40U/μL)  1μL

上游特异引物(20μmol/L)   1μL

下游特异引物(20μmol/L)      1μL

微生物RNA样品             ≤1μg total RNA

AMV-Optimized Taq(5U/μL) 1μL

AMV-RTase XL(5U/μL)          1μL

Mg²(25mmol/L)             10μl

加RNase Free dH₂O至       50μL

(2)在PCR仪中，设置下列条件反应：50℃反应30分钟，94℃反应2分钟，然后按设置PCR条件反应(设置方法同上述的PCR检测方法)。

(3)琼脂糖凝胶电泳对产物检测。

(三)芯片检测方法包括如下步骤：

(1)针对检测目标，设计并合成检测探针；固定探针、构建芯片(也可以购买商品化的芯片使用)；

(2)根据芯片的检测要求，对待检测微生物核酸特异标记(如荧光、同位素、酶及纳米金等标记)；

(3)对芯片进行预杂交、杂交、漂洗等反应处理；

(4)对反应芯片进行结果检测分析。

实施例1、

实验目的：对人群高流动场所环境空气中SARS病毒的存在情况进行监测

实验样本来源：深圳市火车站候车室内、深圳市福田长途汽车站候车室内空气样本

实验步骤：

(一)收集前准备

(1)打开收集装置中滤过收集组件中的滤膜前收集网槽，将滤膜放到滤膜后网式衬垫上，盖上滤膜前收集网槽，与前后密封盖一起高压消毒处理。

(2)停止消毒后，无菌条件下用前后密封盖盖住滤过收集组件。

(二)样本的收集：分别在上午10点及下午3点，各在深圳市火车站候车室内及深圳市福田长途汽车站候车室内收集两次空气样本，并连续收集三天。共有12个样本。

(1)在收集场所，用酒精对收集装置主机中与滤过收集组件的结合处消毒处理，打开后密封盖，接上滤过收集组件。

(2)设置延时3分钟启动，收集参数设置为：空气滤过速度为200升/分钟，收集时间为30分钟；收集。

(5)收集完毕后，先盖上前密封盖，连同取下滤过收集组件，封上前密封盖。以备核酸的提取。

(三)样本的RNA提取：使用深圳匹基生物技术开发有限公司的病毒RNA提取试剂盒，且所有用品及液体均经无RNA酶处理。

(1)无菌条件下取下滤过收集组件后密封盖，将前密封盖打开，连同滤过收集组件放入缓冲液中，涡旋振荡清洗；无菌水漂洗两次；收集全部清洗液，12000g离心10分钟；收集沉淀；

(2)沉淀中加入500μL裂解液，吸头反复吹打混匀，再加入100μL氯仿，混匀器上振荡混匀5秒(不宜过于强烈)；12000g，离心15分钟；

(3)吸取上层液相，加入250μL异丙醇，颠倒混匀；12000g，离心15分钟。弃上清，滤纸上沾干多余液体，加入1mL 75％乙醇，颠倒洗涤；12000g，离心10分钟。轻轻倒去上清，倒置于滤纸上，尽量沾干多余液体；

(4)12000g，离心10秒，将管底少量液体用微量加样器吸干，在真空干燥器内短时间干燥沉淀物，DEPC水溶解RNA备用。

(四)RT-PCR检测反应：实验方法参考王艳等《反转录巢式PCR方法检测SARS冠状病毒》见《第一军医大学学报》23卷第5期421-423页。实验试剂为TAKARA生物有限公司的RNA PCR Kit(AMV)(DRR019A)及Ex Taq DNA聚合酶试剂盒(DRR01AM)。采用GAPDH为检测内参对照

(1)根据Genebank DQ640652 SARS全基因序列设计引物，由上海英骏生物公司合成。上游引物：5′-GAAGCTATTCGTCACGTTCG-3′；下游引物：5′-CTGTAGAAAATCCTAGCTGGAG-3′；扩增片段长度为109bp。检测内参对照GAPDH的上游引物为：5′-CGGATTTGGTCGTATTGGG-3′，下游引物为：5′-CGGATTTGGTCGTATTGGG-3′；扩增片段长度为216bp。

(2)冰上按下列组份配置RT反应液：10×RT Buffer 1μL，dNTP Mixture 1μL，RNase Inhibitor 0.25μL，SARS病毒或内参GAPDH下游引物0.5μL，AMV ReverseTranscriptase 0.5μL，MgCl₂ 2μL，RNase Free dH₂O 3.75μL，分别各加制备的RNA样品1μL；42℃反应30分钟，99℃反应5分钟，5℃反应5分钟，反转录合成第一链；

(3)冰上按下列组份配置PCR反应液：10×EX Taq Buffer 5μL，SARS病毒或内参GAPDH上游引物0.5μL，MgCl₂ 4μL，dH₂O 28.75μL，分别各加上述制备的第一链模板DNA 10μL。SARS病毒的扩增条件为：94℃预变性5分钟；然后94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒，循环30次；最后再置72℃延伸5分钟。内参GAPDH的扩增条件为：94℃预变性5分钟；然后94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸1分钟，循环30次；最后再置72℃延伸5分钟。

(4)分别对12个样品的SARS病毒和内参GAPDH的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示各样品均有清晰GAPDH产物条带，而SARS病毒扩增结果均为阴性。

实施例2

实验目的：对医院环境空气中结核分支杆菌的存在情况进行监测

实验样本来源：深圳市南山区人民医院门诊大厅内空气样本

实验步骤：

(一)收集前准备：同上实施例1。

(二)样本的收集：分别在上午10点及下午3点，在深圳市南山区人民医院门诊大厅内不同位置各收集两次空气样本，并连续收集三天。共有12个样本。其余步骤同实施例1。

(三)样本的DNA提取：

(1)无菌条件下取下滤过收集组件后密封盖，将前密封盖打开，连同滤过收集组件放入缓冲液中，涡旋振荡清洗；无菌水漂洗两次；收集全部清洗液，12000g离心10分钟；收集沉淀；

(2)细菌沉淀中加入5-10倍体积的裂解液(100mmol/L NaCl，10mmol/L Tris·Cl，25mmol/L EDTA，0.5％SDS，pH8.0，使用前加入10μg/mL蛋白酶K)；混匀；

(3)56℃孵育30分钟后加饱和酚100μL，充分混合直到形成乳浊液，4℃ 12000g离心10分钟，小心吸取上层水相；

(4)加入等体积的酚：氯仿：异戊醇(25∶24∶1)混合液，充分摇匀，4℃ 12000g离心10分钟，小心抽提上层液；

(5)再加入等体积氯仿：异戊醇(24∶1)；抽提液中加入1/10体积的3M乙酸钠(pH5.2)，约2倍体积的预冷无水乙醇，充分混匀，-20℃放置30分钟；4℃ 12000g离心10分钟；

(6)轻轻倒去上清液，沉淀加入100μL预冷的无水乙醇，4℃ 12000g离心10分钟；

(7)再在沉淀中再加70％预冷的乙醇，摇匀后4℃12000g离心10分钟，轻轻倒去上清液，将管倒置在吸水纸上，尽量沾干多余液体，真空干燥仪内短时间干燥沉淀；

(8)加TE缓冲液100μL作PCR扩增用。

(四)PCR检测反应：试剂采用伊利康生物公司的结核杆菌核酸扩增检测试剂盒。

(1)引物根据Genebank AE000516结核分支杆菌基因组序列设计的，上游引物序列为：5′-GTCCTCGCGAGTCTAGGCCA-3′，下游引物序列为：5′-TCCGCTGCCAGTCGTCTTCC-3′；检测片段长度大约为240bp。

(2)检测按照试剂盒说明书进行：试剂盒中取出已分装好有PCR反应混合液的离心管，加20μL反应液，离心数秒，再加入4μL待检DNA样品或试剂盒带确有的阳性模板，混匀后稍加离心。如下表：

加入物

阴性对照

阳性对照

样品

反应液阳性模板待检样品

20μL---------

20μL4μL-----

20μL------4μL

(3)将上述待扩增样品和阴阳性对照置PCR扩增仪中，设置扩增条件为：93℃预变性3分钟；然后93℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸60秒，循环35次；最后再置72℃延伸5分钟。

(4)琼脂糖凝胶电泳对PCR产物检测，结果显示：阳性对照有清晰的条带出现，而阴性对照和检测样品均无条带显示。

Claims (10)

1、一种富集空气微生物的装置，其特征在于，所述富集空气微生物的装置包括：

壳体，所述壳体一端开口，另一端封闭，封闭端带有多孔网格；

过滤收集组件，所述过滤收集组件可拆卸地连接于所述壳体的开口端；

风机组件，所述风机组件包括页轮和与页轮连接的电动机，设于所述壳体内部；所述页轮的叶片端对着所述过滤收集组件。

2、根据权利要求1所述的富集空气微生物的装置，其特征在于：所述过滤收集组件包括膜前收集网槽、滤膜和膜后网式衬垫；所述膜前收集网槽与所述膜后网式衬垫相互连接，所述滤膜固定于两者之间；所述过滤收集组件通过膜后网式衬垫连接于所述壳体上。

3、根据权利要求2所述的富集空气微生物的装置，其特征在于：所述膜前收集网槽与膜后网式衬垫的连接方式为螺纹连接；所述膜后网式衬垫与所述壳体的连接方式为螺纹连接。

4、根据权利要求2所述的富集空气微生物的装置，其特征在于：所述滤膜选自尼龙膜滤膜、聚脂核孔膜、聚丙烯膜、醋酸纤维素膜、尼龙膜和聚偏二氟乙烯膜，滤膜孔径为0.1-10微米；优选的，所述滤膜为醋酸纤维素膜，孔径为0.22微米。

5、根据权利要求2所述的富集空气微生物的装置，其特征在于：所述过滤收集组件还包括密封圈，所述密封圈设于膜前收集网槽和膜后网式衬垫之间。

6、根据权利要求2所述的富集空气微生物的装置，其特征在于：所述过滤收集组件还配有前密封盖和后密封盖。

7、根据权利要求1所述的富集空气微生物的装置，其特征在于：所述富集空气微生物的装置还设有用于控制电动机的控制组件；所述控制组件嵌设于所述壳体的表面。

8、根据权利要求1所述的富集空气微生物的装置，其特征在于：所述富集空气微生物的装置还配有支撑架。

9、根据权利要求8所述的富集空气微生物的装置，其特征在于：所述支撑架包括高度可调试三脚架、方向可调试支撑架。

10、一种富集空气微生物的方法，是在权利要求1所述富集空气微生物的装置中进行的，包括如下步骤：

1)清洗、消毒过滤收集组件，开动电动机，在过滤收集组件上收集空气微生物；

2)将过滤收集组件放入缓冲液中，清洗、离心，收集沉淀，富集得到空气微生物。

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