JP5993516B2 - サンプルに存在する微生物を溶解するため、分析の目的のために微生物の核酸を抽出及び精製するための自動システム - Google Patents

サンプルに存在する微生物を溶解するため、分析の目的のために微生物の核酸を抽出及び精製するための自動システム Download PDF

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Description

本発明の技術分野は、生物学的分析のそれである。より具体的には、本発明は、まず、環境又は臨床のサンプルに存在する微生物を溶解するため、微生物の核酸の抽出及び精製をするための装置に関する。本発明は、さらに、微生物を溶解するため、分析の目的のために微生物の核酸を抽出及び精製するための自動システムに関する。
数年間、病院における院内感染の発生が、かなり増加している。これらの感染は、入院患者の汚染により説明される。したがって、患者は、免疫抑制された限定により、病院環境に存在し、装置及び表面の消毒並びに空調に対して常に払われる多大な注意にも関わらず破壊されない病原性微生物による。これらのますます多くの頻繁な事例の環境微生物汚染の観点において、環境コントロールを改善し、容易にする装置及び方法の開発が、医療従事者の主な課題となってきた。
院内感染の問題から離れて、環境条件のモニタリングは、近年にわたって、産業環境、特に食品産業並びに医薬品及び化粧品産業において、頻発する懸念となってきている。食品産業において、本発明者らは、病原性微生物による製品又はさらに原料の汚染が、消費者の健康について悲惨な結果を有する場合があることをよく知っている。実際に、細菌、例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ又はＳａｌｍｏｎｅｌｌａ属のものによる毒性の食品感染は、現在よくあることである。空気品質のモニタリングも、医薬品又は化粧品産業の品質アプローチにおいて重要なプロセスである。
さらに、このモニタリングは、ますます厳しくなる規制により、高まったレベルの要求にも合致しなければならない。
環境モニタリングを行うための、医療従事者又は製造業者に利用可能な機器の中でも、空気のバイオサンプラは、空気における微生物を検出するための解決策の選択肢である。これらの装置は、空気生物汚染を測定するのを望む場所における適切な点に置かれる。それらは、一般的に、培養培地に連結された空気サンプラからなる。空気サンプラにより収集された空気は、培養培地と接触する。収集された任意の空中微生物は、培養培地上に堆積されるであろう。ついで、培養培地は回収され、微生物の増殖を促進するためのストーブに入れられる。したがって、伝統的な微生物学的技術により、微生物を検出及び特定可能である。
それにも関わらず、これらの装置は、使用される技術に関連する大きな欠点を有する。この欠点は、分析結果を得るのに時間がかかることである。実際に、微生物学、特に細菌学の伝統的な技術の使用は、細胞増殖に必要な培養時間を待つことを含み、又は、特定を可能にするために特定の培養培地に再度播種する工程さえも含む。結果として、結果を得るのにかかる時間は、院内感染又は食品中毒の原因となる病原性の有機体を検出及び特定するのを望む場合、比較的長くなり、長過ぎさえする。
この種の装置の別の欠点は、培養培地の使用は、細菌の属と種との間を区別することが可能であるが、一般的には、全く同じ細菌種の株間を区別することができないことである。ここで、微生物の病原性は、問題の株に応じて著しく変動し得ることが公知である。
さらに、この種の装置は、生きているが、培養できない空中微生物の検出ができないという欠点を有する。
これらの装置は、収集を継続する際に、栄養表面が乾燥するという欠点も有する。
さらに、空中粒子、特に微生物の回収を目的とした装置が存在する。例えば、文献、英国特許第２２５４０２４号には、サイクロン効果の原理に基づいて、空気に存在する粒子を収集するための装置が記載されている。このような装置は、空気に存在する粒子、例えば、微生物を収集するのに適していることを証明するが、このようにして得られたサンプルを処理するための、特に、分析に使用されるのを意図した遺伝子材料の抽出を行うための研究はされていなかった。
より一般的には、臨床サンプル又は環境サンプルに関連するかに関わらず、微生物の特定及び／又は結果を伝達する速度に関して最も関連のある技術は、何らの疑いもなく、分子診断の技術である。微生物の遺伝子材料、特に、特定種の所望配列の分析に基づくこれらの技術は、記録的な時間で、微生物の非常に正確な特定を得るのを可能にする。それらが、培養工程を省略可能であるためである。
それにも関わらず、このような技術の使用は、特定数の制限を有する。その最も重要なものは、空気中に存在し、そのため分析を行うのに回収可能な微生物の量が潜在的に制限されることである。実際に、環境サンプル、特定の臨床サンプルも、比較的微生物が乏しいことが知られている。結果として、この原料から取得された遺伝子材料の量は少ない。ついで、収率の点から核酸を抽出するのに使用される技術の性能は、重要なパラメータになる。
さらに、微生物を溶解するほとんどの既存の技術は、全ての微生物に関して一般的でなく、及び／又は、手動工程を行うための資格のある担当者の介在を必要とする。
文献、国際公開第２００５／０３８０２５号には、特に空気からサンプリングされた微生物から核酸を抽出するための方法が記載されている。この方法は、溶解の３種類の方法、すなわち、化学的溶解、ヒートショック溶解及び機械的溶解を使用することからなる。このような方法が、何らの疑いもなく、核酸の抽出の効率を最適化するのを可能にすることにより、分析に利用可能な遺伝子材料の量を増加させるのを可能にする場合、この効率は、回収された微生物の量に依存するままである場合さえある。ここで、微生物の回収を最適化することについては、この文献には記載されていない。
文献、米国特許第５７０７８６１号には、生きた細胞、例えば、微生物を崩壊させるための装置が記載されている。この装置は、ガラスビーズと、微生物を含むチューブとチューブを有する支持体の孔との間の空間による振動効果との両方を使用して、細胞を溶解させる。このため、このような装置は、細胞溶解を最適化可能であるため、遺伝子材料の抽出を最適化可能である。このような装置及びそれが使用する方法は、上記のものと同じ制限を有する。すなわち、それらは、回収された微生物の量に依存するままである。さらに、それらは、細胞の残骸からそれらを単離するために、核酸を濃縮する後の工程を必要とする更なる欠点を有する。最後に、それらは、濃縮工程の最後に手動で核酸を回収することを必要とする。
これらの問題は、文献、米国特許第５５６７０５０号に記載された装置にも生じる。
より高い統合を有するシステムも記載されている。例えば、文献、国際公開第２００４／０１８７０４号には、空気中の微生物を収集し、それらを特定するための、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）増幅の技術を使用する装置及び関連する方法が記載されている。このシステムは、郵便物仕分けセンターにおける生物汚染による暗殺未遂と戦うために特別に設計されている。このシステムは、郵便物を移動させる循環路に沿って置かれた空気のサンプリング装置、サイクロン効果による粒子のろ過／分離用装置、液体サンプル由来の粒子の濃縮／回収用装置、カリフォルニアの企業ＣｅｐｈｅｉｄからのＧｅｎｅＸｐｅｒｔ（商標）ＰＣＲ分析カートリッジ内にサンプル画分を輸送するための装置からなる。ついで、カートリッジは、空気から収集された微生物（一又は複数）を特定するための独立した自動の生物学的分析器に、手動で移動される。
このシステムは、上記の装置及び方法に関連する多くの技術的問題を解決するが、それにも関わらず、システムは、大きな欠点を有する。これらの欠点の１つ目は、分析カートリッジを移動させる前のサンプル処理（収集、分離、濃縮／回収）用のシステムが、比較的複雑であり、高価であることである。第２の欠点は、収集された微生物が液体サンプル中で回収され、その画分のみが分析されることである。これは、全ての微生物、したがって、全ての核酸が回収されないかなりのリスクが存在することを意味する。リスクは、分析の適切性を大きく制限する。さらに、その複雑性にも関わらず、このシステムは、カートリッジのＧｅｎｅＸｐｅｒｔ（商標）自動分析器内への手動の移動を必要とする。
本出願人は、まず、空気のサンプリング手段内部に置くのに適し、核酸を回収するための手段を受容するのに適したカートリッジに関する特許出願、国際公開第２００９／００１０１０号を既に出願している。カートリッジは、概ね円筒形状であり、微生物の保持ゾーンを含む。保持ゾーンは、微生物を溶解するための手段を含む。この発明は、さらに、空中微生物を収集するための装置と、微生物を溶解するための装置とに関する。
本出願人は、中でも、空中微生物を収集するための装置に関する特許出願、国際公開第２０１０／０６７０１９号も既に出願している。装置は、
・空気サンプリングモジュールであって、
ｉ．モジュール内に空気流の流入を可能にする空気流入ダクトを含み、ダクトがその基部に空気流を分配するための手段を有する上側構成要素、
ｉｉ．形成された空気流の排出を可能にする空気排出用手段を含む下側構成要素
を含み、上側及び下側の構成要素が、空気流が空気サンプリングモジュール内で形成され得るように、互いに一体化可能である空気サンプリングモジュール；
・概ね円筒形状であり、微生物の保持ゾーンを含むカートリッジであって、保持ゾーンが、微生物を溶解するための手段を含み、カートリッジが空気サンプリングモジュール内に位置しているカートリッジ
を含む。
これら２つの新規な解決手段により、処理が、多種多様な微生物についての環境及び臨床のサンプルの両方に効果的な、普遍的な溶解により、微生物が、細菌、ウイルス又は、任意選択的に、増殖状態若しくは胞子の形態における糸状菌であるかどうかに関わらず、改善されることが明白である。
さらに、非常に高濃度の微生物が存在する。システムは、種々の下流での分析（例えば、ＰＣＲ、ディッシュ上での線条接種等）に適合可能であり、機械的溶解が一体化される。
ただし、なお一層の最適な解決手段が見出され得る場合、システムは、人間性において、十分機能するシステムとして満足されない。例えば、これら２つの例において、収集は、流体である、気体又は液体の量によって制限される。流体は、回収媒体、一般的には、培養培地と接触する。流体の流れは、常に、同じ点においてこの媒体に衝突するであろう。衝突は、
・残り部分を使用することなく、正確なスポットにおける媒体の飽和、
・又は、同じ点において常に気体又は液体により衝突される場合に媒体の分解
の何れかをもたらすであろう。分解は、気体の場合には解離をもたらし、液体の場合には媒体の表面の液状化をもたらす。両方の場合、特に寒天の解離の場合には、時間の関数として、捕捉効率が非常に著しく低下するであろう。
さらに、衝突による捕捉方法は、１μｍ未満の直径を有する小さな粒子については、非常に非効率である。別の問題は、空気流による回収媒体（グリセロールを含むビーズ）の一定割合の飛沫同伴リスクが存在することである。したがって、この流体の射出及び媒体上でのそのリバウンドは、しぶきを生じ得る。しぶきは、汚染の更なるリスクである。
本発明の目的は、上記欠点に取り組む装置を提供することである。
このために、本発明は、流体に含まれる微生物を収集するための装置において、
・ビーズのセットを含む反応モジュール、
・流体流をモジュールに流入させる少なくとも１つの流体流入ダクト、
・モジュールの内部を通過した流体流の排出を可能にする、流体排出用の少なくとも１つのダクト、
・モジュール内のビーズを保持するための手段、
・少なくとも１つの反応液を流入させるための少なくとも１つの流路、
・少なくとも１つの反応液を排出するための少なくとも１つの流路
を含み、反応液の流入及び排出用流路並びに流体の流入及び排出用ダクトが、モジュールレベルにおいて、下記のように配置される装置を提供する。
・流体の流入及び排出用ダクトが、流体とビーズとの間の接触を最大化するために、モジュールを取り囲みながら互いに向かい合っており、
・反応液（一又は複数）用流路がそれぞれ、モジュールの２つの対向する端部に配置され、及び、
・反応液（一又は複数）用流路が、一面に配置され、流体の流入及び排出用ダクトが、軸に沿って配置され、軸が、面に対しておおよそ垂直である。
第１の実施態様に基づいて、本発明に基づく装置は、流体と反応液とを外部から分離する気密性の閉じ込め容器を含む。
装置の第１の実施態様に基づいて、流体が気体である場合、ビーズのセットは、グリセロールでコートされたビーズからなる。
装置の第２の実施態様に基づいて、流体が液体である場合、モジュールは、反応液（一又は複数）用流路により形成された面において、おおよそ広がるフィルタを含み、流入流路は、ビーズのセットを含むフィルタの一面に配置され、排出流路が、ビーズが存在しないフィルタの他面に配置される。このため、この機構は、例えば、不要なもの若しくは阻害剤、例えば、タンパク質、膜である任意の細胞残留物を分離するために、流体がビーズと接触、ついで、フィルタを通って循環するのを可能にする。
具体的な実施態様では、モジュールの形状は、
・反応液の流入及び排出用流路により形成された面に沿って、並びに、
・流体の流入及び排出用ダクトにより形成された軸に対して垂直に
切断された場合、少なくとも１つの直線部及び／又は少なくとも１つの円弧状の部分を含む。円弧状の部分は、２つの端部の間に含まれる。反応液が反応液の流入流路内に流入される際の移動と、反応液が反応液の排出流路を介して排出される際の移動との間で、反応液がビーズのベッドを通って完全に通過するように、反応液の流入用流路は、モジュールの一端に位置し、反応液の排出用流路は、モジュールの他端に位置している。
この最後に言及された実施態様又は変形例に基づいて、モジュールが、反応液の流入及び排出用流路により形成された面に垂直な面に沿って切断され、流体の流入及び排出用ダクトにより形成された軸に沿って通過する場合、モジュールは四辺形セクションを有する。
具体的な実施態様では、モジュールが、
・反応液の流入及び排出用流路により形成された面に沿って、並びに、
・流体の流入及び排出用ダクトにより形成された軸に対して垂直に
切断された場合、モジュールは、「Ｃ」型のものである。
「Ｃ」型は、２点を繋ぐ円形又はパラボラの円周部に対応する少なくとも１つの円弧状の部分を含む。「Ｃ」の端部は、反応液の流入用流路がモジュールの一端に位置し、反応液の排出用流路が、モジュールの他端に位置するように、モジュールの２つの端部ゾーンである。反応液が反応液の流入流路内に流入される際の移動と、反応液が反応液の排出流路を介して排出される際の移動との間で、反応液はビーズのベッドを通って完全に通過する。
この最後に言及された実施態様又は変形例に基づいて、モジュールが、「Ｃ」の中心を通り、「Ｃ」を切断する半径に沿って切断される場合、モジュールは、四辺形型のものである。
さらに、この最後に言及された実施態様又は変形例に基づいて、反応液の流入流路は、モジュールの「Ｃ」形状の一端に位置し、反応液の排出流路は、「Ｃ」の他端に位置している。
実施態様又は変形例に関わらず、ビーズは、２００と６００μｍとの間の直径を有し、ビーズをモジュールの内部に保持するための手段は、格子からなり、その孔は、ビーズより小さく、１００から５００μｍの範囲の直径を有する。
実施態様又は変形例に関わらず、収集された微生物の処理用の別の反応モジュールを含み、モジュールは、
・不要なもの若しくは阻害剤、例えば、タンパク質、膜である細胞残留物を分離するための手段、及び／又は、
・収集され、阻害剤から分離された核酸を増幅するための手段、及び／又は、
・このように生成された増幅産物を検出するための手段
を含む。
本発明は、流体に含まれる微生物を収集するための方法において、
・微生物を含むことが疑われる流体を、少なくとも１つの流体流入ダクトを介して導入すること、
・微生物が固定されるビーズのベッドを通過させること、
・微生物が除去されている流体を、流体排出用の少なくとも１つのダクトを介して排出すること、
・少なくとも１つの反応液を、少なくとも１つの反応液流入流路を介して導入すること、
・微生物を懸濁させるために、微生物が固定されるビーズのベッドを通過させること、及び
・微生物を移動させるこの液体を、反応液排出用の少なくとも１つの流路を介して排出すること
からなり、流体の流入及び排出用ダクトが、ビーズのベッドを取り囲みながら互いに向かい合っており、反応液の流入及び除去用流路が、ビーズ全体に達するように、配置されている方法にも関連する。
一実施態様に基づいて、流体が気体である場合、ビーズは、グリセロールでコートされる。
一実施態様に基づいて、流体が液体である場合、ビーズは、ポリマーコーティングでコートされる。
一実施態様に基づいて、反応液がビーズのベッドを通過する際、ビーズは、外部振とう手段により振とうされ、接触することにより、微生物の膜を破壊又は崩壊可能となり、核酸にアクセス可能となり、排出できるようになる。
一実施態様に基づいて、規定量の反応液は、反応液の流入流路内に流入され、規定量の反応液の存在において微生物が規定時間溶解されるように、溶解中は、反応液の排出流路を介して排出されない。この時間は、好ましくは、５と３０分との間であり、この液体量は、好ましくは、１００μｌと１ｍｌとの間であり、及びより好ましくは、５００μｌである。
この実施態様の変形例に基づいて、ビーズは、超音波を使用して振とうされる。
実施態様又は変形例に関わらず、微生物の一部又は全部を含んだ液体が、装置の別の反応モジュールに排出されて、収集された微生物の処理を可能にする。処置は、
・不要なもの若しくは阻害剤、例えば、タンパク質、膜である細胞残留物を分離すること、及び／又は、
・収集された核酸を増幅すること、及び／又は、
・このように生成された増幅産物を検出すること
からなる。
実施態様又は変形例に関わらず、この方法についての第１の可能性は、
・試験される流体が、気体（例えば、空気）からなり、
・気体が、ビーズのベッドを通過し、微生物が固定されるビーズが、グリセロールでコートされ、及び、
・少なくとも１つの反応液が、グリセロールを液化し、微生物を懸濁させるために導入される
ことを特徴とする。
実施態様又は変形例に関わらず、この方法についての第２の可能性は、
・試験される流体が、液体からなり、
・試験される液体が、ビーズのベッドを通過し、ついで、排出される前で、液体が含んでいた微生物を除去した後にフィルタを通過し、微生物が、固定され、
・少なくとも１つの反応液が、微生物を懸濁させるために導入される
ことを特徴とする。
これら２つの可能性の何れか１つに基づいて、液体は、反応液排出用の少なくとも１つの流路を介した排出と、阻害剤除去及び／又は増幅及び／又は検出用のモジュールとの間でろ過される。
流体サンプルは、微生物を含み得る、任意の気体状又は液状のサンプルを意味する。流体サンプルは、ヒト又は動物由来のサンプルでもよい。このサンプルは、例えば、尿、全血、血漿若しくは任意の他の体液又は呼気でもよい。サンプルは、食品由来のもの、例えば、飲料でもよい。サンプルは、環境由来のもの、例えば、水又は閉じ込められた空気であってもよい。さらに、液体サンプルは、いわゆる、トランスファー液であってもよく、スワッブ型の表面サンプリング装置、例えば、企業ＣＯＰＡＮにより、「ｆｌｏｃｋｅｄ ＳＷＡＢＳ」の名称で市販されるものの上に含まれる任意の微生物が、トランスファー液中でスワッブを振とうさせることにより再懸濁されている。
微生物は、細菌、ウイルス、酵母、糸状菌、寄生虫を含む群由来である。
微生物が単離されるサンプルは、環境由来のものである。このため、サンプルは、空気又は液体、例えば、水のサンプル；表面サンプルであり得る。サンプルは、臨床由来のもの、すなわち、微生物を検出し、微生物、任意選択的に病原体を特定するための分析の対象として適切なヒト又は動物由来の任意のサンプルであってもよい。
標的核酸の存在は、ハイブリダイゼ―ション反応の可視化により検出され得る。ハイブリダイゼ―ション反応は、例えば、捕捉核酸と、転写、逆転写又は、ＮＡＳＢＡ型（核酸配列ベース増幅）若しくはＰＣＲの増幅工程により単離又は生成された標的核酸との間での任意の反応を意味する。
核酸は、オリゴヌクレオチド、デオキシリボ核酸及びリボ核酸並びにそれらの誘導体を意味する。オリゴヌクレオチドの用語は、それらが天然又は修飾であるか、適切なハイブリダイゼ―ション条件において別のオリゴヌクレオチドに対して、少なくとも部分的に相補にハイブリダイズ可能であるかどうかに関わらず、少なくとも２つ、好ましくは少なくとも５つ、好ましくは少なくとも８つ、及びさらにより好ましくは少なくとも１４個のヌクレオチド（デオキシリボヌクレオチド若しくはリボヌクレオチド又は両方）の配列を意味する。
修飾ヌクレオチドは、例えば、修飾された塩基を含む、並びに／又は、ヌクレオチド間の結合のレベル及び／若しくは骨格のレベルでの修飾を含むヌクレオチドを意味する。修飾された塩基の例として、イノシン、メチル-５-デオキシシチジン、ジメチルアミノ-５-デオキシウリジン、ジアミノ-２,６-プリン及びブロモ-５-デオキシウリジンを言及し得る。
修飾されたヌクレオチド間結合を説明するために、ホスホロチオエート、Ｎ-アルキルホスホラミデート、アルキルホスホネート及びアルキルホスホジエステル結合を言及し得る。
アルファ-オリゴヌクレオチド、例えば、特許出願、フランス国特許第２６０７５０７号に記載されたもの、ＬＮＡ、例えば、Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, Volume 8, Issue 16, August 18, 1998, pp. 2219-2222に記載されたホスホロチオエート-ＬＮＡ及び２’-チオ-ＬＮＡ並びに、M. Egholmらによる文献J. Am. Chem. Soc. (1992), 114, 1895-1897の対象であるＰＮＡが、骨格が修飾されているヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドの例である。
ハイブリダイゼーション反応の可視化は、任意の検出手段、例えば、直接的又は間接的な手段により行われ得る。
直接的な検出の場合、すなわち、標識化の媒介がない場合、ハイブリダイゼ―ション反応は、プラズモン共鳴により、又は、導電性ポリマーを有する電極でのサイクリックボルタンメトリにより観察される。
間接的な検出の場合、すなわち、標識化による場合、標識化は、標的核酸上に直接的に、又は、予め標識された核酸の特異的な結合パートナーを介しての何れかで行われ得る。
標的核酸の特異的な結合パートナーは、標的核酸に結合可能な任意のパートナーを意味し、例えば、核酸、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド及び酵素基質が言及され得る。
標識化は、検出可能なシグナルを直接的又は間接的に生成可能なマーカーの固定を意味する。これらのマーカーの非排他的な列記は、例えば、電気化学、比色定量、蛍光、発光により検出可能なシグナルを生じる酵素、例えば、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、ベータ-ガラクトシダーゼ、グルコース-６-リン酸脱水素酵素等の酵素；酵素阻害剤；酵素補因子；粒子、例えば、金粒子、磁性ラテックス、リポソーム；発色団、例えば、発光化合物、染料、放射活性分子、例えば、３２Ｐ、３５Ｓ又は１２５Ｉ、蛍光分子、例えば、フルオレセイン、ローダミン、Ａｌｅｘａ（登録商標）、ウンベリフェロン、ルミノール又はフィコシアニンからなる。蛍光の場合、それは、酵素−基質反応の蛍光生成物、蛍光体−クエンチャの組み合わせ、蛍光の励起又は蛍光特性に基づく任意の他のシステムであり得る。
間接的なシステムも、例えば、別のリガンド／抗リガンドのペアを介して使用され得る。リガンド／抗リガンドのペアは、当業者に周知であり、例えば、下記ペア： ビオチン／ストレプトアビジン、糖／レクチン、ポリヌクレオチド／相補のポリヌクレオチドが言及され得る。この場合、結合剤を有するリガンドである。抗リガンドは、先の段落に記載されたマーカーにより直接的に検出可能でもよいし、又は、リガンド／抗リガンドによりそれ自体を検出可能でもよい。
これらの間接的な検出システムは、特定の条件において、シグナルの増幅をもたらし得る。シグナル増幅についてのこの技術は、当業者に周知であり、参照は、本出願人の先の特許出願、フランス国特許第２７８１８０２号及び国際公開第９５／０８０００号又は文献J. Histochem. Cytochem. 45: 481-491, 1997になされ得る。
標的核酸の予備的な標識化は、末端において、ランダム若しくは特異的にポリメラーゼによる、キナーゼによるマーカーの直接的若しくは間接的な包含により、又は、分子「内」の包含により行われ得る。
標的検体の特異的な結合パートナーの標識化は、当業者に周知であり、例えば、Greg T. Hermansonによる、Bioconjugate Techniques, 1996, Academic Press Inc, 525B Street, San Diego, CA92101 USAに記載されている。
使用されるコンジュゲートの標識化の種類、例えば、酵素の使用に応じて、当業者は、標識化の可視化用試薬を添加するであろう。この工程は、現像に対応する。現像の前に、バックグラウンドノイズを制限するために、反応に使用されなかった検体若しくは要素の画分、又は、弱く若しくは非特異的に結合した画分を除去するのを可能にする洗浄バッファーを使用する。
本発明に基づく装置の目的及び利点は、何ら限定されることなく、下記の図面を参照して、下記の例示を考慮してより良好に理解されるであろう。
図１は、本発明の具体的な実施態様に基づく、それを機能させる全ての構成要素を含む、微生物の収集及び溶解をするのに使用されるカード又はカートリッジの分解上面図を示す。 図２は、図１に示された本発明の実施態様に基づく装置のコアを形成するメインカードの上面斜視図を示す。 図３は、図１に示された本発明の実施態様にさらに基づく、メインカードの底面斜視図を示す。 図４は、少なくとも１つの流体流入ダクトと接触し、微生物を捕捉するのを可能にする面におけるビーズのベッド及びそれを保持する格子のレベルでの図２の詳細を示す。Ｃ型モジュールの２つの対向する端部は、反応液の流入及び排出用流路に流体連結される。 図５Ａは、閉じ込めプレートが閉じられた際にビーズが存在する、メインカードのろ過部のフローシートである。 図５Ｂは、図５Ａのそれに類似するが、閉じ込めプレートが開いているフローシートである。 図６は、捕捉ビーズ内の流体の移動及び閉じ込めプレートの移動が強調されている、図５Ｂからの詳細Ａを提供する。 図７は、図６と同じであるが、閉じ込めプレートの新たな移動及び捕捉ビーズ内の反応液の移動開始に焦点を当てている。 図８は、図７と同じであり、捕捉ビーズ内の流体の移動を明確に示す。 図９は、図８と同じであるが、核酸の抽出を強調する。 図１０Ａは、微生物が経時的に保持手段により保持されるチャンバ充填の有効性を示す。 図１０Ｂは、微生物が経時的に保持手段により保持されるチャンバ充填の有効性を示す。 図１０Ｃは、微生物が経時的に保持手段により保持されるチャンバ充填の有効性を示す。 図１０Ｄは、微生物が経時的に保持手段により保持されるチャンバ充填の有効性を示す。 図１１は、本発明に基づく装置内での溶解効率を説明するグラフを示す。
本発明は、微生物収集装置１に関する。図１は、微生物収集装置１が、任意の流体２又は液体１２が存在していない状態で表された、本出願人により提案された一実施態様の分解図を示す。収集装置１は、２つの主部である、二次カード５に対して下側位置に位置しているメインカード４、上側位置にある二次カード５を本質的に含む。メインカード４は、Ｌ型であり、二次カード５は、この「Ｌ」型に一体化されており、概ね平行六面体の形状を提供する。メインカード４及び二次カード５は、互いに接触をもたらすのを意図する。この方法において、それらは、ビーズ６を保持するための手段９を形成し、手段９は、本質的に「Ｌ」型の水平部に存在するキャビティからなるであろう。このキャビティ９は、二次カード５の底面がカード４と接触することにより閉じられる。２つのカード、メインカード４及び二次カード５がアッセンブリされると、反応モジュール３を形成する。ただし、保持手段９は、単にこの反応モジュール３の端部からなることはなく、図１には示されていない、１つ又はそれ以上の格子２７も含む。格子２７は、流体２又は液体１２を通過させるが、これも図示されていないがビーズ６は通過させず、反応モジュール３に残す。図４に示された格子２７上では、格子２７における孔２８の直径は、使用されるビーズ６の直径により決まる。格子２７における孔２８は、ガラスビーズの直径より小さい直径のものでなければならない。好ましい実施態様では、格子２７における孔２８は、ガラスビーズの直径より顕著に小さい直径のものでなければならない。「顕著に」は、例えば、ビーズ６が、４００から６００μｍの直径を有し、格子２７が、２００から２５０μｍの孔２８を有することを意味する。
図４に示された、２つのカード４及び５と、流体の流入及び排出用ダクト４０及び４１と、反応液の流入及び排出用流路７及び８とのアッセンブリは、気密性の閉じ込め容器１３を使用して閉じ込められる。閉じ込め容器１３は、図１に表された実施態様において、特定数の閉じ込めプレートからなる。
まず、上側位置において、２つの上面プレート１４及び１５が存在する。ついで、下側位置において、２つの底面プレート１６及び１７が存在する。プレート１４及び１６は、特に分析ゾーン２６の流体流路のレベルにおいて、反応モジュール３の閉じ込めを提供する。反応ゾーン２６は、後述されるであろう。ついで、上面及び底面の強磁性の閉じ込めプレート１５及び１７が存在する。その部品については、反応モジュール３上に位置している。
捕捉工程後に、プレート１５及び１７は、消耗品の近くに位置変更される。微生物１０のみが、チャンバ９に残る。ついで、流路７及び８は、超音波溶解工程前に、溶出バッファーを循環させるのに使用される。
上面プレート１５及び底面プレート１７は、それらが、反応モジュール３の４つの角及びその中心に配置された特定数のマグネット２１を封入する場合、強磁性の性質のものであることに留意されたい。一方、マグネット２１は、Ｏ−リングシール１８上での強磁性プレート１５及び１７の圧力を提供する一方、微生物の捕捉後に密封性を提供する。これらのプレート１５及び１７は、捕捉ビーズ６へのアクセスを提供し、捕捉ビーズ６は、ビーズ６上の流体２に存在する微生物１０を捕捉するのを可能にする。スライド上に位置し、本例では、それらがダブテール形状であるプレート１５及び１７は、スライド２９上を装置１の表面にわたって摺動する。空気のサンプリングの完了時に、プレート１５及び１７は、スライド２９に沿って摺動することにより、その元の位置に位置変更される。ついで、液体回路は閉じられる。「クランプ」力は、閉鎖時に完全な密封性を確保するために、プレートに要求される。この力は、例えば、強磁性であり、当該プレートの表面全体に均一な圧力である利点を有する。
メインカード４及び二次カード５と、上面プレート１５及び底面プレート１７との間において、密封性は、密封性のＯ−リングシール１８のセットにより確保される。これらのＯ−リングシール１８は、上側位置において、数字上３つであり、下側位置において数字上３つであり、同心円状である。当然、この部材は、１つのＯ−リングシールの使用で十分である場合があるため、何ら限定されない。さらに、他のシール手段が、上面プレート１４及び底面プレート１６と、装置１の残り部分との間に存在する。使用される手段は、特に、メインカード４上での接着剤又は両面接着剤により、これらのプレートそれぞれの接着である。同様に、二次カード５は、装置の本体４に持続的に接着される。この接着は、超音波的に、レーザ又は熱的に行われ、持続的であり、収集装置１のアッセンブリを可能にする。
メインカード４は、流路が存在する２つのゾーンを含むことに留意されたい。まず、反応モジュール３の近くに２５で参照された保存ゾーンが存在する。上記で言及された分析ゾーン２６も存在する。ゾーン２５及び２６のレベルに存在する種々の流路は、カード全体の流体管理を可能にする。保存ゾーン２５における流路は、反応液１２（溶出バッファー）の保存のための貯留部である。分析ゾーン２６における流路は、分析用のサンプル調製のための流体流路である。それらは、カードの前後で循環する。蛍光の読み取りも、ゾーン２６における流路において行われる。これらのゾーン２５及び２６が、本発明の本質ではないため、それらは、さらに記載されないであろう。
これらの種類の流路及びその機能は、２００９年９月１８日のフランス国優先権に基づいて本出願人により出願された先の特許出願、国際公開第２０１１／０３３２３１号においてより良好に説明される。読み手は、これがより完全な情報を意味するのを求められる。
微生物１０の捕捉後に、プレート１５及び１７は、再度閉じられる。チャンバ２５からのバッファーが、微生物を再懸濁させるために、捕捉チャンバ９内に送られる。ついで、超音波溶解が、カードに対して外部の手段により、この同じチャンバ９において行われる。ついで、ライゼートは、分配器バルブ２２により分配される。分配器バルブ２２は、孔３１内を摺動し、ポンプピストン２３によりゾーン２６の流路内に送られる。ポンプピストン２３は、核酸１１の検出及び増幅のための調製のために、孔３２内を摺動する。
ただし、種々の構成要素は、流体管理及び分配器バルブ２２及びポンプピストン２３の介在による区画間における反応液１２の移動を可能すると理解されたい。これらのポンプピストン２３の３つは、メインカード４の左側にあり、他の３つは、この同じカード４の右側にある。
最後に、図１の記載を終了するために、メインカード４内にさらに、乾燥台２４が存在することが留意される。これらの台２４は、分析ゾーン２６の近くに位置し、「ペレット」とも呼ばれ、凍結乾燥、乾燥又は他の方法でのゲル化により得られた、凍結乾燥された試薬のビーズの形式において、カードと一体化された試薬の保存を最適化するための乾燥剤を含む。乾燥剤は、ペレットと直接接触しないが、ペレットの近くにある。これらのペレットは、核酸１１の増幅に必要な試薬を含む。
分配器バルブ２２は、収集装置１における流体の分配を制御する。したがって、複数の位置に存在し、
・反応液１２の保存、
・（微生物１０の捕捉後における）反応液１２のビーズ６を含むチャンバ又は保持手段９への移動、
・１２０μＬのライゼートの総量又はゾーン２６の６つの流路に流路あたり２０μＬの移動
を提供する。
最後に、ポンプピストン２３は、シリンジに類似し、プロセス全体を通して、反応液１２の吸引及び移動を可能にする。その具体的な特徴は、それらが、（空気が外部から吸引されない）クローズドエアサイクルにおいて機能することであるが、外部空気の吸引を含むより簡易なバージョンが考えられる。この閉鎖容器の利益は、外部との接続の最大限の回避であり、このため、内部から外部及びその逆についての相互汚染リスクの最大限の回避である。
強磁性プレート１５及び１７をロックするためのバネプレート１９が存在することが図１においてわかる。このプレート１９は、ネジ２０により反応モジュール３に取り付けられる。したがって、これらの取り外し可能なプレートを意図せずに操作するのを可能にすべきでない。このバネプレート１９は、それらの意図しない解放の防止及び回避を可能にする。
図２は、メインカード４のより詳細な図を示す。後者は、異なる厚みの２つの部分からなる。左側の厚みがより厚く、分析ゾーン２６を含む。乾燥台２４及び、分配器バルブ２２を受容するための孔３１の存在も留意される。分配器バルブ２２は、この図において示されていない。最後に、６つのポンプピストン２３を受容するための６つの孔３２も存在する。ポンプピストン２３も、この図には示されておらず、メインカード４内にある。メインカード４の小さい厚みを有する部分、すなわち、この図の右側には、反応液１２用の保存ゾーン２５の存在が留意される。そして、反応液１２は、
−捕捉された微生物１０を再懸濁させ、
−この液体１２を介したビーズ６の超音波振とうによる溶解を提供し、
−所望の有機体を移動させ、及び、
−最後に、核酸１１の増幅及び検出に必要な反応混合物１２を供給
している。
図３は、二次カード５を示す。この部分には、Ｏ−リングシール１８を受容するための場所及びマグネット２１を受容するための位置３３が存在することに留意される。シール１８及びマグネット２１は、この図には示されていない。
図４は、ビーズ６の保持手段９並びに流路７及び８のレベルにおける、図２の詳細の拡大図を示す。Ｃ型モジュールの２つの対向する端部は、反応液の流入及び排出用流路７及び８に、流体接続される。
本例では、手段９は、図５Ａ及び５Ｂにより明確に示された格子２７からなる。格子２７の孔２８を分離する空間は小さく、例えば、５００μｍのビーズについて、孔は、２００から３００μｍの直径を有するであろうし、２００から３００μｍの空間により互いに分離されるであろうことが留意される。空間は、流体２又は液体１２がこの空間内に押し込まれるのをもたらす。空間は、所望の核酸を含む微生物間の接点を改善及び増加させ、ビーズ６の表面が、核酸１１のより良好な捕捉を可能にする。ビーズ６は、ビーズの表面における微生物の付着をさらに容易にする物質によってもコートされている。この物質は、使用される流体が気体である場合には、特にグリセロールである。このため、グリセロールの使用は、気体、特に空気中の微生物を収集する場合においてのみ機能する。この例では、空気は、グリセロールを越えて通過し、微生物は、後者に捕捉される。ついで、グリセロールは、反応バッファー１２により溶解される。細菌が存在する場合、ついで、それらは、超音波によりこのバッファー中で溶解されるであろう。水に存在する微生物を収集する場合、これは、水に溶解され、カードから排出される、グリセロールにより機能しない。液体媒体による正しい操作を達成するために、グリセロールについて、置換は、例えば、水に溶解しないが、特定の反応バッファーにのみ溶解するか、又は、この特定のバッファーに「塩析」可能なポリマーコーティングに見出されるべきである。又は、流体がフィルタを通って循環する前に、ビーズと接触するように、ビーズの下流に、フィルタが追加され得る。
図５Ａ及び５Ｂに基づいて、チャンバ又は保持手段９を含むメインカード４のレベルにおいて、４０及び４１で参照される２つのダクトが存在することが留意される。ダクト４０は、流体２をモジュール３内に流入させ、流体２は、後の分析用に捕捉される細菌を含む。一方、ダクト４１は、この同じ流体２を、モジュール３の外部へ排出する。当然、流入と排出との間において、流体２は、ビーズ６が存在するモジュール３を通過するであろう。通過は、微生物の収集が行われ得るこのレベルにおいてである。流体２がダクト４０及び４１を介して導入及び排出される場合、溶出バッファー又は他のバッファーから成り得る反応液１２は、図４に示された流入流路７を介して、モジュール３内に導入される。反応液１２は、この同じモジュール３から、図４にも示された排出流路８を介しても排出される。
実際に、この流体２、例えば、空気、一方、反応液１２とは異なる液体であり得る流体２は、カードに対して垂直に循環する。流体２は、格子２７を通って流れる。
図５から８は、微生物を捕捉するためのプロトコルの簡略化された説明を提供する。
図５Ａは、微生物１０を抽出するのが望まれる流体２の処理のレベルにおける、本発明に基づく装置１の一部を記載する。装置１には、
・保持手段９を形成するキャビティに存在するビーズ６、
・装置１、したがって、カード４の保持手段９内にビーズ６を閉じ込める、複数の孔２８が開けられた上側格子及び下側格子２７、
・閉じ込め用の強磁性上面プレート１５、
・閉じ込め用の強磁性底面プレート１７、プレート１５及び１７は、閉じ込め用の上面及び底面プレート１４及び１６と同様に、カード４に接着されていない。
・この図において示されていない流体流路
が存在する。図５Ｂに基づいて、装置１は、図５Ａの構成に大体同一であるが、閉じ込め用の強磁性上面プレート１５及び閉じ込め用の強磁性底面プレート１７は、Ｆ１に沿って移動させられる。これにより、流体２がＦ２に基づいて、ビーズ６内を通過し、図に示されていない反応液（一又は複数）用流路に対して垂直な移動により、格子２７による位置に保持されるのが可能となる。この移動は、モジュール３内の流体２の流入ダクト４０及び排出ダクト４１を介して行われる。
図６は、図５Ｂからの詳細Ａを示す。この構成において、取り外し可能な閉じ込めプレート１５及び１７は、Ｆ１に基づいて取り外され、流体２は、格子２７の軸に対して垂直に循環する。微生物１０は、保持手段９内のビーズ６に捕捉される。
図７において、取り外し可能なプレート１５及び１７は、Ｆ３に基づく摺動運動により、閉じた位置に戻される。溶出バッファー１２は、流入流路７を介して、チャンバ９内に導入される。溶出バッファー１２は、微生物１０をビーズ６から取り外す。
最後に、図８において、チャンバ９が満たされた時点で、超音波溶解が、微生物、例えば、細菌１０を崩壊させ、核酸１１を放出するために行われる。核酸１１を含むライゼートは、凍結乾燥された試薬のビーズを再懸濁させることにより、光学的検出等による増幅を準備するために、排出流路８を介して流路に送られる。
したがって、装置は、特に空気からの微生物１０を、グリセロールコートされたガラスビーズ上に、ビーズ６のベッドを通して空気流を循環させることにより、捕捉するのを可能にする。乾燥表面による微生物の捕捉は、多くの利点、例えば、
・（蒸発により）捕捉中に媒体が摩耗しないこと、
・保存中の蒸発がないこと、
・微生物が非常に高濃度であること、
・平坦な衝突表面に対する（マイクロビーズによる）非常に大きく展開された捕捉表面、
・捕捉表面が容易に飽和しないこと
を提供する。
したがって、捕捉は、衝突システムにおいてより非常に効率的である。
さらに、装置は、
・流体由来の微生物の捕捉のための面から離れた大きな表面積を提供し、
・ヘッド損失を低減し、したがって、ポンプの全体寸法を低減することにより、空中微生物の捕捉中に、装置が、捕捉格子２７を通して空気を取り入れるポンプに接続され、
・捕捉面における流体流路の使用により、単にピペッティングすることにより、任意の液体バッファーに、微生物を取り込ませることにより、グリセロール上に微生物が捕捉された後に、取り外し可能なプレート１５及び１７が再度閉じられる。（チャンバ２５に保存された）再懸濁バッファーは、ビーズを含むチャンバ内に押し込まれる。ついで、微生物は、グリセロールに取り込まれる。後者は、捕捉された微生物が放出されるように、バッファーに溶解され、
・消耗品又は微生物を収集するための装置１において、（特に超音波による）溶解を一体化し、
・空気がグリセロールコートされたビーズのベッドにわたって通過する（及び、ビーズのベッドに衝突されない）場合、小さなヘッド損失で高い捕捉効率を得る
ように設計される。
捕捉効率は、主に、ビーズのベッドの厚み及びビーズのサイズにより決まるが、捕捉効率は、特に１μｍを下回る粒径についてのビーズを通した透過における捕捉により顕著に高い。この捕捉方式は、技術的な困難性、例えば、
・ヘッド損失の制御、
・捕捉チャンバにおけるビーズの維持、
・バッファー中への微生物の取り込み、
・溶解
を示す。
乾燥した捕捉は、（＞４ｍ３のサンプルにおける）経時的な効率の損失なしに、バブリング又は水性ゲルを使用することなく行われる。グリセロールの利点は、グリセロールが乾かないことである。したがって、サンプリングされた空気の体積は、効率の著しい損失なく、非常に大きくあり得る。水性表面（寒天、ペトリ皿）又は水性液（コリオリ型）上での捕捉によるシステムは、捕捉の進行時に乾燥するという欠点を有する。この乾燥は、捕捉効率の低下をもたらす。１つの規定された液体における捕捉は、収集の下流で行われる分析の種類を決定する。一方、乾燥捕捉に関して、微生物は、任意のバッファーに取り込まれ得る。
さらに、乾燥表面（ガラスビーズ＋グリセロール）上での捕捉は、微生物が非常に少量、１ｍＬ未満又はさらに１００μＬ未満のバッファーに放出されるのを可能にする。微生物の濃度を向上させる利点は、濃度の向上がそれらの検出を促進することである。分子生物学における検出用システムは、マイクロリットル（μＬ）あたりに１ゲノム当量オーダーの検出限界を有する。
したがって、従来の装置に関して、捕捉体積が１５ｍＬ（微生物を希釈する大きな体積）である場合、さらに大きな量（１５から３０倍以上、すなわち、２００から６００μＬ）の微生物を捕捉する必要がある。
機械的な溶解は、非常に効果的であり、全ての種類の生物学的方法、例えば、プロトコルの次の工程に必要とされる任意のバッファーにおける超音波溶解に対応している。
捕捉された微生物の溶解は、装置において一体化される。溶解技術は、（化学的溶解とは対照的に）純粋に機械的であるため、選択された溶解バッファー及び溶解される微生物に関わらず、優れた溶解収率を確保する。このため、溶解は、ライゼートをそのままの状態で使用し、ついで、増幅、例えば、ＮＡＳＢＡ又はＰＣＲを行うことが可能である。
本発明により提供された装置１の好ましい使用に基づいて、微生物１０が溶解され、核酸１１が反応液又は溶出バッファー１２に取り込まれた後に、収集装置１は、抽出された核酸１１の増幅及び検出を行うのを可能にする。この目的のために、溶解後に行われる、主に４つの工程が存在する。
第１の工程は、溶解後に液体１２に存在する、微生物１０の核酸１１及び特定数の残留物３０を含むバッファー１２を抽出する工程からなる。これらの残留物は、分析ゾーン２６のレベルにおいて行われるであろう、その後の分析に考慮されない。この第１の工程では、核酸１１と残留物３０とを含む液体１２は、排出流路８を介して、保持手段９から出ていくであろう。排出流路８のレベルにおいて、排出流路８は、例えば、抽出された核酸以下のサイズを有する生物学的要素のみが通過可能であるフィルタを有することが可能である。
第２の工程では、この混合物は、図２に明確に示されたように、アリコート３４を取得するためのゾーン内に送られる。このため、得られた体積は、１２０μｌに対応する。
ついで、このアリコートは、３５で参照されるライゼート分離ゾーンにおける第３の工程に送られる。この図では、ゾーン２６の分析流路において、６回の２０μｌに分離を可能にする、互いに十分区別される６つのゾーンが存在する。ゾーン２６のこれらの流路において、増幅は、増幅用試薬、例えば、ヌクレオチド、増幅プライマー及び検出プローブにより行われる。増幅用試薬は、中間ゾーン３６に配置されている。少なくとも１つの酵素（ＰＣＲを行う場合は１つの酵素、ＴＭＡを行う場合は２つ、及び、ＮＡＳＢＡを行う場合は３つ）を含む第２の中間ゾーン３７が存在することが図３からわかる。第２の中間ゾーン３７は、メインカード４の前面に位置している。
第４及び最後の工程は、図３に明確に示されたように、検出が行われ得る中間ゾーン３７の右側に、ゾーン２６の流路のレベルにおいて起こる。
したがって、これらの移動は全て、分配器バルブ２２及びポンプピストン２３により行われる。図に示されていないそれらの摺動運動により、液体を、種々のゾーンから、核酸１１の増幅及びそれらのその後の検出を可能にするであろう他のゾーンに向けることが可能となる。分配器バルブ２２及びポンプピストン２３は、図１に明確に示された、システムの密封性を確保するシール３８及び３９をそれぞれ有する。
実施例１： ビーズサイズ及びビーズのベッド厚みの関数としての、（粒子計数装置による）微生物の捕捉効率
以下は、全く同じ装置についての、ビーズサイズ及びビーズのベッド厚みの関数としての、捕捉効率についてのプロトコルである。
１．Ａ． 手順：
摺動プレート１５及び１７は、実験全体にわたって開いている。この実験について、粒子計数装置を、吸引された空気の立方メートル（ｍ３）あたりの粒子量を評価するのに使用する。検出された粒子を、０．３μｍ、０．５μｍ、１μｍ及び５μｍ間の異なるサイズカテゴリーに分類する。
３つのサイクルの測定を行う。
１： 装置を使用しないブランク参照測定。
２： 粒子計数装置の上流に装置を含む評価測定。
３： 第２の参照測定。
１．Ｂ．実験：
ブランク参照測定を平均化する。捕捉効率は、装置の有無での測定の割合として算出される。
結果を、以下の表１に示す。
Figure 0005993516
表１： ビーズサイズ及びビーズのベッド厚みの関数としての、（粒子計数装置による）微生物の捕捉効率（％）
１．Ｃ．分析：
全く同じ装置１について、表１は、捕捉効率が、ＰＣＴ文献に記載された装置からなる先行技術に対して、ビーズサイズ及びビーズのベッド厚みに関わらず、非常に効果的であることを示す。０．５μｍより小さい粒子は、十分な収率を提供するのが明らかではないが、先行技術よりはるかに高い（ゼロに対して最少で１８％の収率）。０．５と５μｍとの間のサイズについて、結果は、良好である（常に６５％超、さらに、６５％の場合を除けば、常に８５％超）。試験したビーズのベッド全ての厚みは、許容範囲である。
実施例２： 試験した装置それぞれのヘッド損失の最適化
２．Ａ．手順：
各装置を、試験ベンチに置く。試験ベンチは、気流量の関数として、ヘッド損失を測定可能である。その目的は、装置１の捕捉効率とそのヘッド損失との間の最良の妥協を見出すことである。高いヘッド損失は、（携帯式用途に好ましくない）サンプリング装置の高い電力消費を意味する。
２．Ｂ．実験：
表２は、微生物の捕捉用装置の設計を支援するための表である。（サイズ範囲： ０．５−１μｍ、１−５μｍ、５−２５μｍによる）粒子捕捉効率と装置のヘッド損失（ｍｂａｒ）とを比較する。装置を通る特定量の空気をくみ出すのに必要なエネルギーは、（全く同じ流量について）ヘッド損失に比例する。携帯式ポンプとの用途について、捕捉効率とヘッド損失との間の良好な妥協を見出す必要がある（表２を参照のこと）。
Figure 0005993516
表２： ビーズサイズ及びビーズのベッド厚みの関数としての、（５０Ｌ／分で）試験した装置の粒径範囲及びヘッド損失による微生物の捕捉効率
２．Ｃ．分析：
この表及び、先行技術を構成する特許出願、国際公開第２００９／００１０１０号との比較の観点から、本発明に基づく装置は、ビーズのベッド厚み及び使用されたビーズの直径に関わらず、常に、先行技術により提供された解決手段より良好な性能を提供することがわかる。さらに、４２５から６００μｍのビーズ及び１．５ｍｍのベッド厚みについて、結果は、同等のヘッド損失についての特許、国際公開第２００９／００１０１０号の装置より、粒子を捕捉するのに最も効率的である。
実施例３： 装置の充填及び内容物排出：
３．Ａ．手順：
ビーズ６のチャンバ９のみを試験する。（ビーズで満たされているが、液体を含まない）ビーズチャンバの流入口を、流体コネクタ及びピペットに接続する。液体は、液体が満たされるまで、ビーズチャンバ内に押し込められる。充填されると、液体は、同じ方法で空にされる。
３．Ｂ．実験：
図１０Ａから１０Ｄは、微生物１０が捕捉されるチャンバ９の充填を示す。５００μＬを、流入流路７のレベルにおいて注入し、２００μＬを、排出流路８のレベルにおいて回収する。
３．Ｃ．結果：
充填は、完全に起こる。
実施例４： 微生物の溶解：
４．Ａ．手順：
溶解チャンバからなる装置１を、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓを含むバッファー１２で満たす。装置を、微生物を溶解するために、ソノトロードにより超音波に供する。実験を、０、１、５及び１０分の溶解時間で繰り返す。溶解の収率を、ペトリ皿上でのライゼートの増加及び計測により評価する。この実験の目的は、溶解工程における超音波の伝達に適したインターフェースを見出すことである。
４．Ｂ．実験：
図１１に関連して、全く同じ設計のビーズチャンバ装置を、いくつかのインターフェース構成と共に使用する。すなわち、
・１ｓｔ構成： 強磁性のプレート１５及び１７を置き換えるプラスチックの構成要素（本発明に基づく修飾された装置と直接接触するソノトロード）、
・２ｎｄ構成： （ソノトロードと本発明に基づく装置との間に存在する）シリコーン層、
・３ｒｄ構成： 装置に追加された強磁性のプレート１５及び１７として機能する金属の構成要素。
３つの装置を、従来通り、２種類のビーズ直径について試験する（表３を参照のこと）。
Figure 0005993516
表３： 超音波溶解の効率
４．Ｃ．結果：
結果は、行った全ての試験について、全く良好である。ただし、金属インサートを使用する解決手段は、両方の種類のビーズについて、概ね同じ良好な結果を提供する。
実施例５： 溶解及び微生物（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）の精製を行わないＮＡＳＢＡ増幅：
５．Ａ．手順：
装置を、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓの細菌と、試験される細菌とは異なる細菌からなる内部コントロールとを含むバッファーで充填する。溶解を、実施例４に記載された３ｒｄ構成に基づく装置において行う。ついで、ライゼートを、装置から取り出し、分析する。
５．Ｂ．実験：
検出曲線を、以下の表４及び５に表す。
Figure 0005993516
Figure 0005993516
この実験は、微生物を溶解し、ＮＡＳＢＡ分析によりそれらを検出するのに記載された装置の効率を示す。微生物を、実験の前に、バッファー１２内に注入する（各実験において異なる濃度の微生物）。カードの金属フラップを閉じる。ビーズを含む部分を、（種々の濃度の微生物を含む）バッファー１２で充填する。装置を、溶解を行う超音波プローブに置く。溶解工程の最後に、バッファー１２を、手動で収集し、カードから離れたＮＡＳＢＡにより分析する。これらの結果を、コントロール範囲と比較する。
第１の目的により、結果の解釈は、二値である。陽性は、微生物が検出されたことを意味し、陰性は、微生物が検出されないことを意味する。
５．Ｃ．分析：
試験したサンプルは、０．２ＣＦＵ／μｌを越える全ての濃度について陽性と示されたことが上記表からわかる。
１．微生物１０を収集するための装置
２．流体
３．反応モジュール
４．メインカード
５．二次カード
６．ビーズ
７．モジュール３の反応液流入流路１２
８．モジュール３からの反応液１２排出用流路
９．モジュール３内のビーズ６の保持手段
１０．流体２に存在する微生物
１１．微生物１０に存在する核酸
１２．反応液
１３．プレート１４から１７からなる気密性の閉じ込め容器
１４．装置１の閉じ込め用の上面プレート
１５．装置１の閉じ込め用のスライド式強磁性上面プレート
１６．装置１の閉じ込め用の底面プレート
１７．装置１の閉じ込め用のスライド式強磁性底面プレート
１８．容器１３とカード４及び５との間の密封性のＯ−リングシール
１９．強磁性プレート１５及び１７のロック用バネプレート
２０．バネプレート１９の固定ネジ
２１．マグネット
２２．分配器バルブ
２３．ポンプピストン
２４．乾燥台
２５．反応液１２の保存ゾーン
２６．カードの前後における分析ゾーン
２７．上側及び下側の格子
２８．格子２７における孔
２９．スライド
３０．溶解後の液体１２に存在する微生物の残留物
３１．分配器バルブ２２を受容するための孔
３２．ポンプピストン２３を受容するための孔
３３．マグネット２１を受容するカード４及び５の貫通孔
３４．分取ゾーン
３５．分離ゾーン
３６．酵素を含む第１の中間ゾーン
３７．酵素を含む第２の中間ゾーン
３８．分配器バルブ２２上のシール
３９．ポンプピストン２３上のシール
４０．モジュール３内の流体２流入ダクト
４１．モジュール３内の流体２除去用ダクト
Ｆ１．流体２の通過のための開放を可能にする、強磁性の上面プレート１５及び強磁性の底面プレート１７の摺動運動
Ｆ２．ビーズ６を通過する流体２の移動
Ｆ３．液体１２の通過に対して閉鎖を可能にする、強磁性の上面プレート１５及び強磁性の底面プレート１７の摺動運動
Ｆ４．ビーズ６を通過する液体１２の移動
Ｆ５．核酸１１の抽出

Claims (16)

  1. 流体（２）に含まれる微生物を収集するための装置（１）において、
    ・ビーズ（６）のセットを含み空洞（９）を有する反応モジュール（３）であって、前記空洞（９）が前記流体（２）の流れの前記空洞（９）を通っての流入および排出を可能にする第１面および反対側の第２面を有する、反応モジュール（３）、
    ・前記流体（２）の流れを前記空洞（９）に流入を可能にするために前記空洞（９）の前記第１面に対して開いている面を有する、前記流体（２）の少なくとも１つの流入ダクト（４０）、
    ・前記空洞（９）の内部を通過した前記流体（２）の流れの排出を可能にするために前記空洞（９）の前記第２面に対して開いている面を有する、前記流体（２）の少なくとも１つの排出ダクト（４１）、
    ・前記空洞（９）内の前記ビーズ（６）の保持手段（９）、
    ・少なくとも１つの反応液（１２）の前記空洞（９）内の流入のための少なくとも１つの流入流路（７）、
    ・前記反応液（１２）の前記空洞（９）からの排出のための少なくとも１つの排出流路（８）
    を含み、前記反応液（１２）の前記流入流路（７）及び前記排出流路（８）並びに前記流体（２）の前記流入ダクト（４０）及び前記排出ダクト（４１）が、下記のように配置され、
    ・前記流体（２）の前記流入及び排出用ダクト（４０及び４１）が互いに向かい合うことで、第１軸（Ｆ２）に沿って前記空洞（９）に前記流体（２）の流れを生成するようになっており、
    ・前記流入及び排出用ダクト（４０及び４１）の前記面がそれぞれ、前記空洞（９）の前記第１面及び第２面よりも大きくなっていることで、前記流体（２）と前記ビーズ（６）との間の接触を最大化するようになっており、
    ・前記流入及び排出流路（７及び８）がそれぞれ、前記空洞（９）の２つの反対の端部に配置され、並びに、
    ・前記流入及び排出流路（７及び８）が、前記第１軸（Ｆ２）に垂直な一面に配置されることで、前記第１軸（Ｆ２）に垂直な第２軸（Ｆ４）に沿って前記空洞（９）に前記反応液（１２）の流れを生成するようになっている、装置。
  2. 前記流体と前記反応液とを外部から分離する気密性の閉じ込め容器（１３）を含むことを特徴とする、請求項１に記載の装置。
  3. 前記流体が気体である場合、前記ビーズのセットが、グリセロールでコーティングされたビーズからなることを特徴とする、請求項１又は２に記載の装置。
  4. 前記流体が液体である場合、前記空洞（９）が、前記流入及び排出流路（７及び８）により形成された前記面にほぼ広がるフィルタを含み、前記流入流路が、前記ビーズのセットを含む前記フィルタの一面に配置され、前記排出流路が、前記ビーズが存在しない前記フィルタの他面に配置されることを特徴とする、請求項１又は２に記載の装置。
  5. 前記空洞（９）が、
    ・前記反応液の流入及び排出流路（７及び８）により形成された前記面に沿って、
    切断されている場合、前記空洞（９）が「Ｃ」型のものであることを特徴とする、請求項１から４のいずれか一項に記載の装置。
  6. 前記モジュールが、前記「Ｃ」の中心を通り、前記「Ｃ」を切断する半径に沿って切断されている場合、前記モジュールが、四辺形型のものであることを特徴とする、請求項５に記載の装置。
  7. 前記反応液の流入用流路が、前記モジュールの前記「Ｃ」型の一端に位置し、前記反応液の排出用流路が、前記「Ｃ」の他端に位置していることを特徴とする、請求項５又は６に記載の装置。
  8. 前記ビーズが、２００から６００μｍの間の直径を有し、前記ビーズを前記モジュールの内部に保持するための手段が、前記空洞（９）の前記第１面及び第２面のそれぞれに配置された格子からなり、その孔が、前記ビーズより小さく、１００から５００μｍの範囲の直径を有することを特徴とする、請求項１から７のいずれか一項に記載の装置。
  9. 収集された前記微生物の処理用の別の反応モジュールを含み、前記別のモジュールが、
    １．不要なもの若しくは阻害剤である細胞残留物を分離するための手段、及び／又は、
    ２．収集され、前記阻害剤から分離された核酸を増幅するための手段、及び／又は、
    ３．増幅するための手段により生成された増幅産物を検出するための手段
    を含むことを特徴とする、請求項１から８のいずれか一項に記載の装置。
  10. 流体に含まれる微生物を収集するための方法において、
    １．空洞内に含まれ保持されたビーズのベッド内に第１軸（Ｆ２）に沿って前記流体の流れを生成することであり、前記流れを生成することが、
    ・微生物を含むことが疑われる前記流体を、前記空洞の第１面に対して開いている面を有する少なくとも１つの流体流入ダクトを介して前記空洞の前記第１面を通して前記空洞内に導入することにより、前記微生物が固定される前記ビーズのベッド内に前記流体を通過させること、
    ・前記微生物が除去されている前記流体を、前記空洞の第２面に対して開いている面を有する前記流体排出用の少なくとも１つのダクトを介して前記空洞の前記第２面を通して前記空洞内から排出すること、
    による、生成すること、
    ２．前記第１軸に垂直な第２軸（Ｆ４）に沿って前記ビーズのベッド内を通る反応液の流れを生成することにより、前記ビーズのベッドにより固定された前記微生物を懸濁させることであり、前記流れを生成することが、
    ・少なくとも１つの反応液を、少なくとも１つの反応液流入流路を介して前記空洞内に導入すること、
    ・前記微生物を輸送する前記反応液を、前記反応液排出用の少なくとも１つの流路を介して前記空洞から排出すること、
    による、生成すること、
    からなり、前記流体ダクトが、互いに向かい合っており、前記流入及び排出用ダクト（４０及び４１）の前記面がそれぞれ、前記空洞の前記第１面及び第２面よりも大きくなっていることで、前記流体と前記ビーズとの間の接触を最大化するようになっていることを特徴とする、方法。
  11. 前記反応液が前記ビーズのベッドを通過する際、前記ビーズが、外部振とう手段により振とうされ、接触することにより、前記微生物の膜を溶解可能となり、前記核酸にアクセス可能となり、排出できるようになることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記ビーズの振とうが、超音波を使用してもたらされることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記微生物の一部又は全部を含んだ前記反応液が、前記装置の反応モジュールに排出されて、収集された前記微生物の処置を可能にし、前記処置が、
    １．不要なもの若しくは阻害剤、例えば、タンパク質、膜である前記細胞残留物を分離すること、及び／又は、
    ２．収集された前記核酸を増幅すること、及び／又は、
    ３．増幅により生成された前記増幅産物を検出すること
    からなることを特徴とする、請求項１０から１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. １．試験される前記流体が、気体からなり、
    ２．前記気体が、前記ビーズのベッドを通過し、前記微生物が固定される前記ビーズが、グリセロールでコーティングされ、
    ３．少なくとも１つの反応液が、前記グリセロールを液化し、前記微生物を懸濁させるために導入される
    ことを特徴とする、請求項１０から１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. １．試験される前記流体が、液体からなり、
    ２．試験される前記液体が、前記ビーズのベッドを通過し、ついで、排出される前で、前記液体が含んでいた前記微生物を除去した後にフィルタを通過し、前記微生物が、固定され、
    ３．少なくとも１つの反応液が、前記微生物を懸濁させるために導入される
    ことを特徴とする、請求項１０から１３のいずれか一項に記載の方法。
  16. 前記液体が、前記反応液排出用の少なくとも１つの流路を介した排出と、阻害剤除去及び／又は増幅及び／又は検出用モジュールとの間でろ過されることを特徴とする、請求項１４又は１５に記載の方法。
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