JP2015523081A - サンプルに存在する微生物を溶解するため、分析の目的のために微生物の核酸を抽出及び精製するための自動システム - Google Patents
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Abstract
Description
・空気サンプリングモジュールであって、
i.モジュール内に空気流の流入を可能にする空気流入ダクトを含み、ダクトがその基部に空気流を分配するための手段を有する上側構成要素、
ii.形成された空気流の排出を可能にする空気排出用手段を含む下側構成要素
を含み、上側及び下側の構成要素が、空気流が空気サンプリングモジュール内で形成され得るように、互いに一体化可能である空気サンプリングモジュール;
・概ね円筒形状であり、微生物の保持ゾーンを含むカートリッジであって、保持ゾーンが、微生物を溶解するための手段を含み、カートリッジが空気サンプリングモジュール内に位置しているカートリッジ
を含む。
・残り部分を使用することなく、正確なスポットにおける媒体の飽和、
・又は、同じ点において常に気体又は液体により衝突される場合に媒体の分解
の何れかをもたらすであろう。分解は、気体の場合には解離をもたらし、液体の場合には媒体の表面の液状化をもたらす。両方の場合、特に寒天の解離の場合には、時間の関数として、捕捉効率が非常に著しく低下するであろう。
・ビーズのセットを含む反応モジュール、
・流体流をモジュールに流入させる少なくとも1つの流体流入ダクト、
・モジュールの内部を通過した流体流の排出を可能にする、流体排出用の少なくとも1つのダクト、
・モジュール内のビーズを保持するための手段、
・少なくとも1つの反応液を流入させるための少なくとも1つの流路、
・少なくとも1つの反応液を排出するための少なくとも1つの流路
を含み、反応液の流入及び排出用流路並びに流体の流入及び排出用ダクトが、モジュールレベルにおいて、下記のように配置される装置を提供する。
・流体の流入及び排出用ダクトが、流体とビーズとの間の接触を最大化するために、モジュールを取り囲みながら互いに向かい合っており、
・反応液(一又は複数)用流路がそれぞれ、モジュールの2つの対向する端部に配置され、及び、
・反応液(一又は複数)用流路が、一面に配置され、流体の流入及び排出用ダクトが、軸に沿って配置され、軸が、面に対しておおよそ垂直である。
・反応液の流入及び排出用流路により形成された面に沿って、並びに、
・流体の流入及び排出用ダクトにより形成された軸に対して垂直に
切断された場合、少なくとも1つの直線部及び/又は少なくとも1つの円弧状の部分を含む。円弧状の部分は、2つの端部の間に含まれる。反応液が反応液の流入流路内に流入される際の移動と、反応液が反応液の排出流路を介して排出される際の移動との間で、反応液がビーズのベッドを通って完全に通過するように、反応液の流入用流路は、モジュールの一端に位置し、反応液の排出用流路は、モジュールの他端に位置している。
・反応液の流入及び排出用流路により形成された面に沿って、並びに、
・流体の流入及び排出用ダクトにより形成された軸に対して垂直に
切断された場合、モジュールは、「C」型のものである。
・不要なもの若しくは阻害剤、例えば、タンパク質、膜である細胞残留物を分離するための手段、及び/又は、
・収集され、阻害剤から分離された核酸を増幅するための手段、及び/又は、
・このように生成された増幅産物を検出するための手段
を含む。
・微生物を含むことが疑われる流体を、少なくとも1つの流体流入ダクトを介して導入すること、
・微生物が固定されるビーズのベッドを通過させること、
・微生物が除去されている流体を、流体排出用の少なくとも1つのダクトを介して排出すること、
・少なくとも1つの反応液を、少なくとも1つの反応液流入流路を介して導入すること、
・微生物を懸濁させるために、微生物が固定されるビーズのベッドを通過させること、及び
・微生物を移動させるこの液体を、反応液排出用の少なくとも1つの流路を介して排出すること
からなり、流体の流入及び排出用ダクトが、ビーズのベッドを取り囲みながら互いに向かい合っており、反応液の流入及び除去用流路が、ビーズ全体に達するように、配置されている方法にも関連する。
・不要なもの若しくは阻害剤、例えば、タンパク質、膜である細胞残留物を分離すること、及び/又は、
・収集された核酸を増幅すること、及び/又は、
・このように生成された増幅産物を検出すること
からなる。
・試験される流体が、気体(例えば、空気)からなり、
・気体が、ビーズのベッドを通過し、微生物が固定されるビーズが、グリセロールでコートされ、及び、
・少なくとも1つの反応液が、グリセロールを液化し、微生物を懸濁させるために導入される
ことを特徴とする。
・試験される流体が、液体からなり、
・試験される液体が、ビーズのベッドを通過し、ついで、排出される前で、液体が含んでいた微生物を除去した後にフィルタを通過し、微生物が、固定され、
・少なくとも1つの反応液が、微生物を懸濁させるために導入される
ことを特徴とする。
・反応液12の保存、
・(微生物10の捕捉後における)反応液12のビーズ6を含むチャンバ又は保持手段9への移動、
・120μLのライゼートの総量又はゾーン26の6つの流路に流路あたり20μLの移動
を提供する。
−捕捉された微生物10を再懸濁させ、
−この液体12を介したビーズ6の超音波振とうによる溶解を提供し、
−所望の有機体を移動させ、及び、
−最後に、核酸11の増幅及び検出に必要な反応混合物12を供給
している。
・保持手段9を形成するキャビティに存在するビーズ6、
・装置1、したがって、カード4の保持手段9内にビーズ6を閉じ込める、複数の孔28が開けられた上側格子及び下側格子27、
・閉じ込め用の強磁性上面プレート15、
・閉じ込め用の強磁性底面プレート17、プレート15及び17は、閉じ込め用の上面及び底面プレート14及び16と同様に、カード4に接着されていない。
・この図において示されていない流体流路
が存在する。図5Bに基づいて、装置1は、図5Aの構成に大体同一であるが、閉じ込め用の強磁性上面プレート15及び閉じ込め用の強磁性底面プレート17は、F1に沿って移動させられる。これにより、流体2がF2に基づいて、ビーズ6内を通過し、図に示されていない反応液(一又は複数)用流路に対して垂直な移動により、格子27による位置に保持されるのが可能となる。この移動は、モジュール3内の流体2の流入ダクト40及び排出ダクト41を介して行われる。
・(蒸発により)捕捉中に媒体が摩耗しないこと、
・保存中の蒸発がないこと、
・微生物が非常に高濃度であること、
・平坦な衝突表面に対する(マイクロビーズによる)非常に大きく展開された捕捉表面、
・捕捉表面が容易に飽和しないこと
を提供する。
・流体由来の微生物の捕捉のための面から離れた大きな表面積を提供し、
・ヘッド損失を低減し、したがって、ポンプの全体寸法を低減することにより、空中微生物の捕捉中に、装置が、捕捉格子27を通して空気を取り入れるポンプに接続され、
・捕捉面における流体流路の使用により、単にピペッティングすることにより、任意の液体バッファーに、微生物を取り込ませることにより、グリセロール上に微生物が捕捉された後に、取り外し可能なプレート15及び17が再度閉じられる。(チャンバ25に保存された)再懸濁バッファーは、ビーズを含むチャンバ内に押し込まれる。ついで、微生物は、グリセロールに取り込まれる。後者は、捕捉された微生物が放出されるように、バッファーに溶解され、
・消耗品又は微生物を収集するための装置1において、(特に超音波による)溶解を一体化し、
・空気がグリセロールコートされたビーズのベッドにわたって通過する(及び、ビーズのベッドに衝突されない)場合、小さなヘッド損失で高い捕捉効率を得る
ように設計される。
・ヘッド損失の制御、
・捕捉チャンバにおけるビーズの維持、
・バッファー中への微生物の取り込み、
・溶解
を示す。
以下は、全く同じ装置についての、ビーズサイズ及びビーズのベッド厚みの関数としての、捕捉効率についてのプロトコルである。
摺動プレート15及び17は、実験全体にわたって開いている。この実験について、粒子計数装置を、吸引された空気の立方メートル(m3)あたりの粒子量を評価するのに使用する。検出された粒子を、0.3μm、0.5μm、1μm及び5μm間の異なるサイズカテゴリーに分類する。
1: 装置を使用しないブランク参照測定。
2: 粒子計数装置の上流に装置を含む評価測定。
3: 第2の参照測定。
ブランク参照測定を平均化する。捕捉効率は、装置の有無での測定の割合として算出される。
全く同じ装置1について、表1は、捕捉効率が、PCT文献に記載された装置からなる先行技術に対して、ビーズサイズ及びビーズのベッド厚みに関わらず、非常に効果的であることを示す。0.5μmより小さい粒子は、十分な収率を提供するのが明らかではないが、先行技術よりはるかに高い(ゼロに対して最少で18%の収率)。0.5と5μmとの間のサイズについて、結果は、良好である(常に65%超、さらに、65%の場合を除けば、常に85%超)。試験したビーズのベッド全ての厚みは、許容範囲である。
2.A.手順:
各装置を、試験ベンチに置く。試験ベンチは、気流量の関数として、ヘッド損失を測定可能である。その目的は、装置1の捕捉効率とそのヘッド損失との間の最良の妥協を見出すことである。高いヘッド損失は、(携帯式用途に好ましくない)サンプリング装置の高い電力消費を意味する。
表2は、微生物の捕捉用装置の設計を支援するための表である。(サイズ範囲: 0.5−1μm、1−5μm、5−25μmによる)粒子捕捉効率と装置のヘッド損失(mbar)とを比較する。装置を通る特定量の空気をくみ出すのに必要なエネルギーは、(全く同じ流量について)ヘッド損失に比例する。携帯式ポンプとの用途について、捕捉効率とヘッド損失との間の良好な妥協を見出す必要がある(表2を参照のこと)。
この表及び、先行技術を構成する特許出願、国際公開第2009/001010号との比較の観点から、本発明に基づく装置は、ビーズのベッド厚み及び使用されたビーズの直径に関わらず、常に、先行技術により提供された解決手段より良好な性能を提供することがわかる。さらに、425から600μmのビーズ及び1.5mmのベッド厚みについて、結果は、同等のヘッド損失についての特許、国際公開第2009/001010号の装置より、粒子を捕捉するのに最も効率的である。
3.A.手順:
ビーズ6のチャンバ9のみを試験する。(ビーズで満たされているが、液体を含まない)ビーズチャンバの流入口を、流体コネクタ及びピペットに接続する。液体は、液体が満たされるまで、ビーズチャンバ内に押し込められる。充填されると、液体は、同じ方法で空にされる。
図10Aから10Dは、微生物10が捕捉されるチャンバ9の充填を示す。500μLを、流入流路7のレベルにおいて注入し、200μLを、排出流路8のレベルにおいて回収する。
充填は、完全に起こる。
4.A.手順:
溶解チャンバからなる装置1を、Staphylococcus epidermidisを含むバッファー12で満たす。装置を、微生物を溶解するために、ソノトロードにより超音波に供する。実験を、0、1、5及び10分の溶解時間で繰り返す。溶解の収率を、ペトリ皿上でのライゼートの増加及び計測により評価する。この実験の目的は、溶解工程における超音波の伝達に適したインターフェースを見出すことである。
図11に関連して、全く同じ設計のビーズチャンバ装置を、いくつかのインターフェース構成と共に使用する。すなわち、
・1st構成: 強磁性のプレート15及び17を置き換えるプラスチックの構成要素(本発明に基づく修飾された装置と直接接触するソノトロード)、
・2nd構成: (ソノトロードと本発明に基づく装置との間に存在する)シリコーン層、
・3rd構成: 装置に追加された強磁性のプレート15及び17として機能する金属の構成要素。
結果は、行った全ての試験について、全く良好である。ただし、金属インサートを使用する解決手段は、両方の種類のビーズについて、概ね同じ良好な結果を提供する。
5.A.手順:
装置を、S.epidermidisの細菌と、試験される細菌とは異なる細菌からなる内部コントロールとを含むバッファーで充填する。溶解を、実施例4に記載された3rd構成に基づく装置において行う。ついで、ライゼートを、装置から取り出し、分析する。
試験したサンプルは、0.2CFU/μlを越える全ての濃度について陽性と示されたことが上記表からわかる。
2.流体
3.反応モジュール
4.メインカード
5.二次カード
6.ビーズ
7.モジュール3の反応液流入流路12
8.モジュール3からの反応液12排出用流路
9.モジュール3内のビーズ6の保持手段
10.流体2に存在する微生物
11.微生物10に存在する核酸
12.反応液
13.プレート14から17からなる気密性の閉じ込め容器
14.装置1の閉じ込め用の上面プレート
15.装置1の閉じ込め用のスライド式強磁性上面プレート
16.装置1の閉じ込め用の底面プレート
17.装置1の閉じ込め用のスライド式強磁性底面プレート
18.容器13とカード4及び5との間の密封性のO−リングシール
19.強磁性プレート15及び17のロック用バネプレート
20.バネプレート19の固定ネジ
21.マグネット
22.分配器バルブ
23.ポンプピストン
24.乾燥台
25.反応液12の保存ゾーン
26.カードの前後における分析ゾーン
27.上側及び下側の格子
28.格子27における孔
29.スライド
30.溶解後の液体12に存在する微生物の残留物
31.分配器バルブ22を受容するための孔
32.ポンプピストン23を受容するための孔
33.マグネット21を受容するカード4及び5の貫通孔
34.分取ゾーン
35.分離ゾーン
36.酵素を含む第1の中間ゾーン
37.酵素を含む第2の中間ゾーン
38.分配器バルブ22上のシール
39.ポンプピストン23上のシール
40.モジュール3内の流体2流入ダクト
41.モジュール3内の流体2除去用ダクト
F1.流体2の通過のための開放を可能にする、強磁性の上面プレート15及び強磁性の底面プレート17の摺動運動
F2.ビーズ6を通過する流体2の移動
F3.液体12の通過に対して閉鎖を可能にする、強磁性の上面プレート15及び強磁性の底面プレート17の摺動運動
F4.ビーズ6を通過する液体12の移動
F5.核酸11の抽出
Claims (16)
- 流体(2)に含まれる微生物を収集するための装置(1)において、
・ビーズ(6)のセットを含む反応モジュール(3)、
・流体流を前記モジュール(3)に流入させる前記流体(2)の少なくとも1つの流入ダクト(40)、
・前記モジュール(3)の内部を通過した前記流体流の排出を可能にする前記流体(2)の少なくとも1つの排出ダクト(41)、
・モジュール(3)内の前記ビーズ(6)の保持手段(9)、
・少なくとも1つの反応液(12)の少なくとも1つの流入流路(7)、
・少なくとも1つの反応液(12)の少なくとも1つの排出流路(8)
を含み、前記反応液(12)の前記流入流路(7)及び前記排出流路(8)並びに前記流体(2)の前記流入ダクト(40)及び前記排出ダクト(41)が、モジュールレベル(3)において、下記のように配置され、
・前記流体の流入及び排出用ダクト(40及び41)が、前記流体(2)と前記ビーズ(6)との間の接触を最大化するために、前記モジュール(3)を取り囲みながら互いに向かい合っており、
・前記一又は複数の反応液(12)のための流路がそれぞれ、前記モジュール(3)の2つの対向する端部に配置され、並びに、
・前記一又は複数の反応液(12)のための流路(7及び8)が、一面に配置され、前記流体の流入及び排出用ダクト(40及び41)が、前記面に対しておおよそ垂直な軸に沿って配置される、装置。 - 前記流体と前記反応液とを外部から分離する気密性の閉じ込め容器(13)を含むことを特徴とする、請求項1に記載の装置。
- 前記流体が気体である場合、前記ビーズのセットが、グリセロールでコーティングされたビーズからなることを特徴とする、請求項1又は2に記載の機構。
- 前記流体が液体である場合、前記モジュールが、前記一又は複数の反応液のための流路により形成された前記面において、おおよそ広がるフィルタを含み、前記流入流路が、前記ビーズのセットを含む前記フィルタの一面に配置され、前記排出流路が、前記ビーズが存在しない前記フィルタの他面に配置されることを特徴とする、請求項1又は2に記載の機構。
- 前記モジュール(3)が、
・前記反応液の流入(7)及び排出(8)用流路により形成された前記面に沿って、並びに、
・前記流体の前記流入ダクト及び前記排出ダクト(40及び41)により形成された前記軸に対して垂直に
切断されている場合、前記モジュール(3)が「C」型のものであることを特徴とする、請求項1から4のいずれか一項に記載の装置。 - 前記モジュールが、前記「C」の中心を通り、前記「C」を切断する半径に沿って切断されている場合、前記モジュールが、四辺形型のものであることを特徴とする、請求項5に記載の装置。
- 前記反応液の流入用流路が、前記モジュールの前記「C」形状の一端に位置し、前記反応液の排出用流路が、前記「C」の他端に位置していることを特徴とする、請求項5又は6に記載の装置。
- 前記ビーズが、200から600μmの間の直径を有し、前記ビーズを前記モジュールの内部に保持するための手段が、格子からなり、その孔が、前記ビーズより小さく、100から500μmの範囲の直径を有することを特徴とする、請求項1から7のいずれか一項に記載の装置。
- 収集された前記微生物の処理用の別の反応モジュールを含み、前記別のモジュールが、
1.不要なもの若しくは阻害剤、例えば、タンパク質、膜である細胞残留物を分離するための手段、及び/又は、
2.収集され、前記阻害剤から分離された核酸を増幅するための手段、及び/又は、
3.このように生成された増幅産物を検出するための手段
を含むことを特徴とする、請求項1から8のいずれか一項に記載の装置。 - 流体に含まれる微生物を収集するための方法において、
1.微生物を含むことが疑われる前記流体を、少なくとも1つの流体流入ダクトを介して導入すること、
2.前記微生物が固定されるビーズのベッドを通過させること、
3.前記微生物が除去されている前記流体を、前記流体排出用の少なくとも1つのダクトを介して排出すること、
4.少なくとも1つの反応液を、少なくとも1つの反応液流入流路を介して導入すること、
5.前記微生物を懸濁させるために、前記微生物が固定される前記ビーズのベッドを通過させること、
6.前記微生物を輸送するこの液体を、前記反応液排出用の少なくとも1つの流路を介して排出すること
からなり、前記流体ダクトが、前記ビーズのベッドを取り囲みながら互いに向かい合っており、前記反応液の流入及び排出用流路が、前記ビーズ全体に達するように、配置されていることを特徴とする、方法。 - 前記液体が前記ビーズのベッドを通過する際、前記ビーズが、外部振とう手段により振とうされ、接触することにより、前記微生物の膜を溶解可能となり、前記核酸にアクセス可能となり、排出できるようになることを特徴とする、請求項10に記載の方法。
- 前記ビーズの振とうが、超音波を使用してもたらされることを特徴とする、請求項11に記載の方法。
- 前記微生物の一部又は全部を含んだ前記液体が、前記装置の別の反応モジュールに排出されて、収集された前記微生物の処理を可能にし、前記処置が、
1.不要なもの若しくは阻害剤、例えば、タンパク質、膜である前記細胞残留物を分離すること、及び/又は、
2.収集された前記核酸を増幅すること、及び/又は、
3.このように生成された前記増幅産物を検出すること
からなることを特徴とする、請求項10から12のいずれか一項に記載の方法。 - 1.試験される前記流体が、気体からなり、
2.前記気体が、前記ビーズのベッドを通過し、前記微生物が固定される前記ビーズが、グリセロールでコーティングされ、
3.少なくとも1つの反応液が、前記グリセロールを液化し、前記微生物を懸濁させるために導入される
ことを特徴とする、請求項10から13のいずれか一項に記載の方法。 - 1.試験される前記流体が、液体からなり、
2.試験される前記液体が、前記ビーズのベッドを通過し、ついで、排出される前で、前記液体が含んでいた前記微生物を除去した後にフィルタを通過し、前記微生物が、固定され、
3.少なくとも1つの反応液が、前記微生物を懸濁させるために導入される
ことを特徴とする、請求項10から13のいずれか一項に記載の方法。 - 前記液体が、前記反応液排出用の少なくとも1つの流路を介した排出と、阻害剤除去及び/又は増幅及び/又は検出用モジュールとの間でろ過されることを特徴とする、請求項14又は15に記載の方法。
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