CN110117532A - 一种用于空气中悬浮微生物的快速检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种用于空气中悬浮微生物的快速检测方法，该技术方案首先探究了肺炎克雷伯氏菌的特异性分子标记，获得了一种对肺炎克雷伯氏菌具有专一指向性的蛋白质片段，以其作为标志物可用于肺炎克雷伯氏菌、臭鼻克雷伯氏菌、鼻硬结克雷伯氏菌的种间鉴别。相对于现有技术的培养法和涂片法而言，本发明准确性更高，且可通过标志物蛋白含量近似性的推算肺炎克雷伯氏菌含量，从而在一定程度上实现定量检测。在以上技术方案的基础上，本发明开发了专用的取样装置，基于琼脂糖凝胶的附着作用和滤膜的拦截作用，在气流通过的过程中实现微生物的固着，再通过洗脱的方式将微生物分散至无菌水中，从而作为生物检材用于质谱分析。

Description

一种用于空气中悬浮微生物的快速检测方法

技术领域

本发明涉及微生物检测技术领域，具体涉及一种用于空气中悬浮微生物的快速检测方法。

背景技术

空气环境是微生物生存的重要场所，也是人类与微生物接触的主要环境，因此对空气中悬浮微生物检测，对于疾病防控、环境质量监测具有重要意义。空气中的微生物主要来自人类的生活和生产过程。它们附着于尘埃或液滴上，随载体悬浮于空气中。在湿度大、灰尘多、通气不良、日光不足的情况下，空气中的微生物不仅数量较多，而且存活时间也较长。微生物污染空气，可使空气成为传播呼吸道传染病的媒介。要检测空气中微生物的种类和数量，需要特殊装置的采样器采样，然后将采得的空气样品通过培养基的培养进行计数。影响微生物计数的因素很多，包括空气中微生物的捕获方法、捕获过程中对微生物的杀灭作用以及培养温度和培养基的选择等。当下还不能找到一种能培养所有微生物的培养基，特别是立克次体和病毒不能在无生命的培养基中生长，因此，一般都是以细菌和真菌作为空气微生物检测的目标。

克雷伯氏菌是一类革兰氏阴性杆菌，其中肺炎克雷伯氏菌(K.peneumoniae) 对人致病性较强，是重要的条件致病菌和医源性感染菌之一，可引起肺炎、脑膜炎、呼吸道感染、泌尿系感染、腹膜炎、腹泻及败血症等，主要通过空气传播，因此对空气环境中肺炎克雷伯氏菌的检测具有重要意义。现有技术中，目前检测肺炎克雷伯氏菌的方法主要包括微生物培养法、生理生化检测法以及实时荧光 PCR等分子诊断方法。其中微生物培养法耗时长且培养条件复杂，生理生化检测结果的判读依赖于操作者的主观判断，从而导致结果重复性差，易错判；实时荧光PCR技术需要昂贵的仪器设备、技术要求高。此外，上述方法的检测精度普遍只能到克雷伯氏菌属，对于属内的肺炎克雷伯氏菌、臭鼻克雷伯氏菌 (K.ozaenae)、鼻硬结克雷伯氏菌(K.rhinoscleromatis)等菌种难以实现有效鉴别。另外，无论采用上述何种方法，快速、可重复的获取待测样品也是实现高效检测的重要技术前提，现有技术中，一般采用沉降平板法或液体撞击法实现取样，其完成速度较慢，也难以保证悬浮微生物的充分富集。综上所述，有必要从取样方式和检测原理层面加以改进，以实现对空气中肺炎克雷伯菌的高效检测。

发明内容

本发明旨在针对现有技术的缺陷，提供一种用于空气中悬浮微生物快速检测的方法，以解决现有技术中常规检测方法对空气中肺炎克雷伯氏菌检测精度较低的技术问题。

本发明要解决的另一技术问题是在利用常规方法检测空气中的悬浮微生物时取样速度较慢、可重复性较差。

本发明要解决的再一技术问题是常规检测方法难以快速鉴别肺炎克雷伯氏菌、臭鼻克雷伯氏菌、鼻硬结克雷伯氏菌等具体菌种。

为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：

一种用于空气中悬浮微生物的快速检测方法，该方法应用到取样装置，所述取样装置包括壳体，通道，风机，滤膜，筛网，其中壳体围成一通道，所述通道具有两个端口，在所述两个端口处分别连接有风机和滤膜，在所述通道中固定连接有若干筛网；

所述检测方法包括以下步骤：

1)将所述取样装置的壳体、风机、滤膜、若干筛网分别灭菌；将琼脂糖凝胶灭菌后降温至70℃，在无菌环境下将若干筛网浸泡于灭菌后的琼脂糖凝胶中，取出筛网在无菌环境下降至室温；

2)在无菌环境下组装所述取样装置；将所述取样装置移至待测地点，启动风机，以恒定的风速运行1min；而后拆卸所述取样装置的滤膜和筛网，将所述滤膜和筛网浸泡于70℃的无菌水中，恒温保持1min，另取新鲜无菌水冲洗滤膜和筛网，合并洗液，再用新鲜无菌水定容至300mL，得到待测样品；

3)将所述待测样品离心取沉淀；分别通过乙醇、氯仿-甲醇溶液浸泡；收集固形物干燥，加入蛋白提取溶液提取；弃沉淀、取上清液待用；检测所述上清液中是否含有氨基酸序列为MLGGDAWPYEGC的肺炎克雷伯氏菌标志性蛋白质片段。

作为优选，步骤3)中所述检测是氨基酸序列测定。

作为优选，步骤3)中所述检测包括以下步骤：对所述上清液进行胰酶酶解；而后通过生物质谱分析酶解产物中是否含有序列为MLGGDAWPYEGC的肺炎克雷伯氏菌标志性蛋白质片段。

作为优选，所述胰酶酶解包括以下步骤：将提取得到的总蛋白溶解后加入二硫键还原剂孵育，而后加入巯基封闭试剂，最后加入胰蛋白酶于35～39℃下孵育，将酶解后的蛋白脱盐、干燥，即得到酶解产物。

作为优选，所述二硫键还原剂是苏糖醇；所述巯基封闭试剂是碘乙酰胺。

作为优选，还包括以下步骤4)：利用已知浓度的一组肺炎克雷伯氏菌溶液执行步骤3)，根据各组的生物质谱信号及其中的肺炎克雷伯氏菌浓度绘制标准曲线。

作为优选，还包括以下步骤5)：执行以上步骤1)～步骤3)，而后将检测到的生物质谱信号代入到步骤4)所得的标准曲线中，计算得到所述待测样品中的肺炎克雷伯氏菌浓度。

作为优选，还包括以下步骤6)：根据所述待测样品中的肺炎克雷伯氏菌浓度以及所述待测样品的体积计算得到所述待测样品中肺炎克雷伯氏菌的总量；根据步骤2)所述恒定的风速和所述运行时间计算流经所述取样装置的总风量；根据所述肺炎克雷伯氏菌的总量和所述总风量计算得到所述取样地点空气中肺炎克雷伯氏菌的浓度。

作为优选，所述筛网的孔径为170目；所述筛网的数量为8个。

作为优选，步骤2)中所述风速不超过8m/s。

在以上技术方案中，壳体用于围成通道，通道用于使气流流经内部的筛网和滤膜，风机为气流提供驱动力，筛网表面附着有凝固的琼脂糖凝胶，从而在气流通过的过程中使菌体被黏附在琼脂糖凝胶表面，通过多组筛网的设置可保证这种黏附作用的充分性；气流通过筛网后到达滤膜可起到最终的拦截作用，筛网对气流中颗粒物的粘附也降低了滤膜被阻塞的发生率。

风机以恒定的风速运行一段时间后，气流中的微生物及颗粒物在筛网和滤膜上得到了固定，而此部分气流的总体积可藉由通道截面积、风速以及取样时间加以确定。对于固定得到的微生物，利用70℃的无菌水将附着有微生物的琼脂糖凝胶溶解，该温度既达到琼脂糖凝胶的熔点又不会造成蛋白质变性，因而可保证微生物在无菌水中的有效分散；与此同时，滤膜上固着的微生物被洗涤后也进入无菌水中，从而得到待测样品。本发明通过实验手段发现，肺炎克雷伯氏菌的菌体蛋白具有特异性的蛋白质片段，该蛋白质片段游离于细胞膜内侧，可能与菌体的物质输送有关，基于这种有益的发现，本发明最终得到序列为MLGGDAWPY EGC的肺炎克雷伯氏菌标志性蛋白质片段，该片段对肺炎克雷伯氏菌具有专一的指向性，在臭鼻克雷伯氏菌、鼻硬结克雷伯氏菌等其他菌株中均无法检出；而且，该片段的含量与菌体密度之间具有良好的线性关系，可在一定范围内用于菌体浓度的定量检测。

在利用以上方法对待测样品执行检测后，若检测结果显示待测样品总蛋白中含有序列为MLGGDAWPYEGC的蛋白片段则判定该样品中含肺炎克雷伯氏菌，反之则不含有肺炎克雷伯氏菌，依据该鉴别原则形成鉴别结论。

本发明提供了一种用于空气中悬浮微生物的快速检测方法，该技术方案首先探究了肺炎克雷伯氏菌的特异性分子标记，获得了一种对肺炎克雷伯氏菌具有专一指向性的蛋白质片段，以其作为标志物可准确反应肺炎克雷伯氏菌的存在，而且，可用于肺炎克雷伯氏菌、臭鼻克雷伯氏菌、鼻硬结克雷伯氏菌的种间鉴别。相对于现有技术的培养法和涂片法而言，本发明准确性更高，且可通过标志物蛋白含量近似性的推算肺炎克雷伯氏菌含量，从而在一定程度上实现定量检测。在以上技术方案的基础上，本发明开发了专用的取样装置，基于琼脂糖凝胶的附着作用和滤膜的拦截作用，在气流通过的过程中实现微生物的固着，再通过洗脱的方式将微生物分散至无菌水中，从而作为生物检材用于质谱分析。本发明具有较高的准确性和灵敏性，且操作简便，具有良好的应用前景。

附图说明

图1是本发明所应用的取样装置的结构示意图；

图2是本发明实施例1中肺炎克雷伯氏菌菌体标准品的液相色谱-生物质谱检测结果图；

图3是本发明实施例1中待测样品的液相色谱-生物质谱检测结果图；

图4是本发明中肺炎克雷伯氏菌标志性蛋白质片段的序列示意图；

1、壳体 2、通道 3、风机 4、滤膜

5、筛网。

具体实施方式

以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。

以下实施例中所使用的近似性语言可用于定量表述，表明在不改变基本功能的情况下可允许数量有一定的变动。因此，用“大约”、“左右”等语言所修正的数值不限于该准确数值本身。在一些实施例中，“大约”表示允许其修正的数值在正负百分之十(10％)的范围内变化，比如，“大约100”表示的可以是90 到110之间的任何数值。此外，在“大约第一数值到第二数值”的表述中，大约同时修正第一和第二数值两个数值。在某些情况下，近似性语言可能与测量仪器的精度有关。

除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。

实施例1(检测特异性实验)

一、实验方法

一种用于空气中悬浮微生物的快速检测方法，该方法应用到取样装置，该取样装置如图1所示，包括壳体1，通道2，风机3，滤膜4，筛网5，其中壳体1 围成一通道2，所述通道2具有两个端口，在所述两个端口处分别连接有风机3 和滤膜4，在所述通道2中固定连接有若干筛网5；

该检测方法包括以下步骤：

1)将所述取样装置的壳体1、风机3、滤膜4、若干筛网5分别灭菌；将琼脂糖凝胶灭菌后降温至70℃，在无菌环境下将若干筛网5浸泡于灭菌后的琼脂糖凝胶中，取出筛网5在无菌环境下降至室温；

2)在无菌环境下组装所述取样装置；将所述取样装置移至待测地点，启动风机3，以恒定的风速运行1min；而后拆卸所述取样装置的滤膜4和筛网5，将所述滤膜4和筛网5浸泡于70℃的无菌水中，恒温保持1min，另取新鲜无菌水冲洗滤膜4和筛网5，合并洗液，再用新鲜无菌水定容至300mL，得到待测样品；

3)另一方面取肺炎克雷伯氏菌纯品，加入蛋白提取溶液提取；弃沉淀，得到标准品上清液待用；

4)将上述待测样品和标准品上清液分别利用碳酸氢铵溶液溶解，加入苏糖醇于室温下孵育，而后加入碘乙酰胺避光孵育，最后加入胰蛋白酶于37℃下孵育，将酶解后的蛋白脱盐、干燥，分别得到待测物酶解产物和标准品酶解产物。

5)将步骤4)得到的待测物酶解产物和标准品酶解产物分别注入色谱-生物质谱联用系统检测，利用生物质谱分析方法获得肺炎克雷伯氏菌标志性蛋白质片段MLGGDAWPYEGC的检测信号。实验结果如图2、3所示。

二、实验结果

如图2所示，肺炎克雷伯氏菌纯品的液相色谱-生物质谱检测结果图中能够清晰看到序列为MLGGDAWPYEGC的蛋白片段吸收峰。而对待测样品检测发现在同样位置也出现了明显的峰值，因此可以判断本实施例的待测样品中含有肺炎克雷伯氏菌。本发明检测方法对肺炎克雷伯氏菌具有很好的特异性。

实施例2(检测灵敏度实验)

一、实验方法

取肺炎克雷伯氏菌菌体纯品，利用无菌水分别制备得到菌体浓度为10cfu/mL、10²cfu/mL、10³cfu/mL、10⁴cfu/mL、10⁵cfu/mL、10⁶cfu/mL、10⁷cfu/mL、10⁸cfu/mL 的菌液，而后取同样体积的上述菌液作为待测样品分别执行以下检测。

1)取待测样品加入蛋白提取溶液提取；弃沉淀，得到待测物上清液待用。

2)将上述上清液利用碳酸氢铵溶液溶解，加入苏糖醇于室温下孵育，而后加入碘乙酰胺避光孵育，最后加入胰蛋白酶于37℃下孵育，将酶解后的蛋白脱盐、干燥，得到酶解产物。

3)将步骤2)得到的酶解产物注入色谱-生物质谱联用系统检测，利用生物质谱分析方法获得肺炎克雷伯氏菌标志性蛋白质片段MLGGDAWPYEGC的检测信号。实验结果如表1所示。

二、实验结果

表1不同菌体浓度待测产物的检测结果

如表1所示，利用本发明方法，浓度超过10²cfu/mL的待测样品都检测出了肺炎克雷伯氏菌，表面本发明方法具有较强的灵敏性，能够对较低菌体含量的待测样品实现准确检测。

实施例3

一种用于空气中悬浮微生物的快速检测方法，该方法应用到取样装置，所述取样装置包括壳体1，通道2，风机3，滤膜4，筛网5，其中壳体1围成一通道 2，所述通道2具有两个端口，在所述两个端口处分别连接有风机3和滤膜4，在所述通道2中固定连接有若干筛网5；所述检测方法包括以下步骤：

1)将所述取样装置的壳体1、风机3、滤膜4、若干筛网5分别灭菌；将琼脂糖凝胶灭菌后降温至70℃，在无菌环境下将若干筛网5浸泡于灭菌后的琼脂糖凝胶中，取出筛网5在无菌环境下降至室温；

2)在无菌环境下组装所述取样装置；将所述取样装置移至待测地点，启动风机3，以恒定的风速运行1min；而后拆卸所述取样装置的滤膜4和筛网5，将所述滤膜4和筛网5浸泡于70℃的无菌水中，恒温保持1min，另取新鲜无菌水冲洗滤膜4和筛网5，合并洗液，再用新鲜无菌水定容至300mL，得到待测样品；

3)将所述待测样品离心取沉淀；分别通过乙醇、氯仿-甲醇溶液浸泡；收集固形物干燥，加入蛋白提取溶液提取；弃沉淀、取上清液待用；检测所述上清液中是否含有氨基酸序列为MLGGDAWPYEGC的肺炎克雷伯氏菌标志性蛋白质片段；

4)利用已知浓度的一组肺炎克雷伯氏菌溶液执行步骤3)，根据各组的生物质谱信号及其中的肺炎克雷伯氏菌浓度绘制标准曲线；

5)执行以上步骤1)～步骤3)，而后将检测到的生物质谱信号代入到步骤 4)所得的标准曲线中，计算得到所述待测样品中的肺炎克雷伯氏菌浓度；

6)根据所述待测样品中的肺炎克雷伯氏菌浓度以及所述待测样品的体积计算得到所述待测样品中肺炎克雷伯氏菌的总量；根据步骤2)所述恒定的风速和所述运行时间计算流经所述取样装置的总风量；根据所述肺炎克雷伯氏菌的总量和所述总风量计算得到所述取样地点空气中肺炎克雷伯氏菌的浓度。

其中，所述检测是氨基酸序列测定。所述检测包括以下步骤：对所述上清液进行胰酶酶解；而后通过生物质谱分析酶解产物中是否含有序列为 MLGGDAWPYEGC的肺炎克雷伯氏菌标志性蛋白质片段。所述胰酶酶解包括以下步骤：将提取得到的总蛋白溶解后加入二硫键还原剂孵育，而后加入巯基封闭试剂，最后加入胰蛋白酶于35～39℃下孵育，将酶解后的蛋白脱盐、干燥，即得到酶解产物。所述二硫键还原剂是苏糖醇；所述巯基封闭试剂是碘乙酰胺。所述筛网(5)的孔径为170目；所述筛网(5)的数量为8个。步骤2)中所述风速不超过8m/s。

以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 厦门华厦学院

<120> 一种用于空气中悬浮微生物的快速检测方法

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 12

<212> PRT

<213> 肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)

<400> 1

Met Leu Gly Gly Asp Ala Trp Pro Tyr Glu Gly Cys

1 5 10

Claims (10)

1.一种用于空气中悬浮微生物的快速检测方法，该方法应用到取样装置，所述取样装置包括壳体(1)，通道(2)，风机(3)，滤膜(4)，筛网(5)，其中壳体(1)围成一通道(2)，所述通道(2)具有两个端口，在所述两个端口处分别连接有风机(3)和滤膜(4)，在所述通道(2)中固定连接有若干筛网(5)；

其特征在于所述检测方法包括以下步骤：

1)将所述取样装置的壳体(1)、风机(3)、滤膜(4)、若干筛网(5)分别灭菌；将琼脂糖凝胶灭菌后降温至70℃，在无菌环境下将若干筛网(5)浸泡于灭菌后的琼脂糖凝胶中，取出筛网(5)在无菌环境下降至室温；

2)在无菌环境下组装所述取样装置；将所述取样装置移至待测地点，启动风机(3)，以恒定的风速运行1min；而后拆卸所述取样装置的滤膜(4)和筛网(5)，将所述滤膜(4)和筛网(5)浸泡于70℃的无菌水中，恒温保持1min，另取新鲜无菌水冲洗滤膜(4)和筛网(5)，合并洗液，再用新鲜无菌水定容至300mL，得到待测样品；

3)将所述待测样品离心取沉淀；分别通过乙醇、氯仿-甲醇溶液浸泡；收集固形物干燥，加入蛋白提取溶液提取；弃沉淀、取上清液待用；检测所述上清液中是否含有氨基酸序列为MLGGDAWPYEGC的肺炎克雷伯氏菌标志性蛋白质片段。

2.根据权利要求1所述的一种用于空气中悬浮微生物的快速检测方法，其特征在于步骤3)中所述检测是氨基酸序列测定。

3.根据权利要求1所述的一种用于空气中悬浮微生物的快速检测方法，其特征在于步骤3)中所述检测包括以下步骤：对所述上清液进行胰酶酶解；而后通过生物质谱分析酶解产物中是否含有序列为MLGGDAWPYEGC的肺炎克雷伯氏菌标志性蛋白质片段。

4.根据权利要求3所述的一种用于空气中悬浮微生物的快速检测方法，其特征在于所述胰酶酶解包括以下步骤：将提取得到的总蛋白溶解后加入二硫键还原剂孵育，而后加入巯基封闭试剂，最后加入胰蛋白酶于35～39℃下孵育，将酶解后的蛋白脱盐、干燥，即得到酶解产物。

5.根据权利要求4所述的一种用于空气中悬浮微生物的快速检测方法，其特征在于所述二硫键还原剂是苏糖醇；所述巯基封闭试剂是碘乙酰胺。

6.根据权利要求3所述的一种用于空气中悬浮微生物的快速检测方法，其特征在于还包括以下步骤4)：利用已知浓度的一组肺炎克雷伯氏菌溶液执行步骤3)，根据各组的生物质谱信号及其中的肺炎克雷伯氏菌浓度绘制标准曲线。

7.根据权利要求6所述的一种用于空气中悬浮微生物的快速检测方法，其特征在于还包括以下步骤5)：执行以上步骤1)～步骤3)，而后将检测到的生物质谱信号代入到步骤4)所得的标准曲线中，计算得到所述待测样品中的肺炎克雷伯氏菌浓度。

8.根据权利要求7所述的一种用于空气中悬浮微生物的快速检测方法，其特征在于还包括以下步骤6)：根据所述待测样品中的肺炎克雷伯氏菌浓度以及所述待测样品的体积计算得到所述待测样品中肺炎克雷伯氏菌的总量；根据步骤2)所述恒定的风速和所述运行时间计算流经所述取样装置的总风量；根据所述肺炎克雷伯氏菌的总量和所述总风量计算得到所述取样地点空气中肺炎克雷伯氏菌的浓度。

9.根据权利要求1所述的一种用于空气中悬浮微生物的快速检测方法，其特征在于所述筛网(5)的孔径为170目；所述筛网(5)的数量为8个。

10.根据权利要求1所述的一种用于空气中悬浮微生物的快速检测方法，其特征在于步骤2)中所述风速不超过8m/s。