CN101474208B

CN101474208B - 一种新生牛血清的分类生产工艺

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Publication number: CN101474208B
Application number: CN2008102383436A
Authority: CN
Inventors: 温晓燕; 孟红; 李鹏; 岳盈盈; 李志会; 宋楠楠
Original assignee: INSTITUTE OF BASIC MEDICINE SAMS
Current assignee: INSTITUTE OF BASIC MEDICINE SAMS
Priority date: 2008-12-15
Filing date: 2008-12-15
Publication date: 2011-09-28
Anticipated expiration: 2028-12-15
Also published as: CN101474208A

Abstract

本发明公开了一种新生牛血清的分类生产工艺，采取新生牛血清后，对其进行蛋白、血红蛋白、细菌内毒素定量检测、微生物学检测和抗体检测，然后将相同抗体背景者归类合并，然后进行细胞增殖谱检验和基础质控；所述细胞增殖谱检验包括传代细胞培养增殖试验和原代细胞培养试验。最后根据细胞增殖情况和抗体背景，将血清做用途分类。本发明的工艺生产的牛血清分类明确、用途专一，满足了生物药业生产不同疫苗需求不同血清的需求，提高了疫苗质量，降低了生产成本。

Description

一种新生牛血清的分类生产工艺

技术领域

本发明涉及一种新生牛血清的分类生产工艺。

背景技术

目前国内市场的牛血清均按照国标规定内容生产。

国标对新生牛血清产品规定符合如下要求：1：新生牛血清根据出生后时间的不同(0.5小时内、出生2小时内、出生4小时内、出生14小时内)分为顶级、超级、特级和普通4级；2：规定蛋白总量为3.5-5.0(W/V，)血红蛋白含量≤0.035(W/V)，内毒素含量≤10EU/ml，无菌试验阴性、支原体阴性和大肠杆菌噬菌体阴性；3：牛腹泻病毒抗体和口蹄疫抗体阴性；4：并对血清促进BHK细胞和SP2/0的细胞生长的情况做了规定(详见表12)。

本申请的发明人在向各畜牧疫苗生产单位供应新生牛血清产品的过程中发现，生产不同的疫苗，需要不同品质的新生牛血清。比如猪瘟疫苗使用牛睾丸原代细胞株、要求牛睾丸原代细胞生长良好，牛腹泻病毒抗体阴性、猪瘟病毒抗体阴性；猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)疫苗病毒使用MARC145细胞株、要求MARC145细胞生长良好，猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体阴性；伪狂犬疫苗病毒用Vero细胞株、要求Vero细胞生长良好，伪狂犬病毒抗体阴性；细小疫苗病毒采用ST细胞株、要求ST细胞生长良好，细小病毒抗体阴性，乙型脑炎疫苗病毒使用BHK细胞株也要求相应细胞生长良好，抗体阴性等。目前国内生产畜牧业疫苗有十几种，理论上应该有符合十几种疫苗生产需要的不同品质的新生牛血清产品才能满足市场要求，而国标只规定了新生牛出生时间、蛋白含量、血红蛋白、微生物学指标以及SP2/0细胞株、BHK细胞株生长的状况和口蹄疫抗体和牛腹泻病毒抗体作为产品的优劣分类标准，缺乏用途分类标准。虽然可见用A549细胞做贴壁效率、用SP2/0细胞做克隆效率来衡量血清质量的资料，但是，没有人采用针对生产目的不同，选择不同细胞谱做细胞增殖试验或贴壁试验，也未见针对生产目的对血清抗体检测对新生牛血清分类的资料和产品。这样，迫使疫苗生产厂家在生产疫苗前首先运行血清筛选程序，造成成本的上升和浪费。

发明内容

针对上述现有技术的不足，本发明提供了一种针对畜牧业不同疫苗专一用途的新生牛血清的新的分类生产工艺。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种新生牛血清的分类生产工艺，其特征在于，包括以下步骤：

(1)原料新生牛血清的生产：采用无支原体采血法采取新生牛血清，并通过建立档案，使原料血清具有明确的溯源性，档案内容包括：a新生牛血清编号；b新生牛的隶属关系；c出生地；d出生时间；e取血时间；f一般情况：体重、精神情况，有无进食，有无腹泻，体表粘液；g新生牛母亲的健康状况；h母牛疫苗接种史；i母牛病史：l年来有无发生明显疾病；j周围牛群的疫情发生情况：3年来有无发生疫情；k周围畜牧养殖动物3年来的疫情情况。

(2)检验：对上述采取的新生牛血清进行蛋白、血红蛋白、细菌内毒素定量检测、微生物学检测和抗体检测。其中，蛋白、血红蛋白、细菌内毒素定量检测均按国标允许方法，采用公知技术检测；微生物学检测包括细菌、真菌、支原体、大肠杆菌噬菌体(E.Coli C300 orK-12)检测，均按照国家标准允许方法进行。

(3)第一次分类：相同抗体背景者归类。

(4)合并混匀：将上述抗体背景相同的血清在无菌混合罐中合并混匀。

(5)将上述混匀的血清打入终末滤网为0.2μ的多级过滤系统，无菌罐装系统罐装(多级过滤系统、无菌灌装系统均为公知技术，工厂生产时的常规技术)。

所述步骤(5)后还包括以下步骤：

(6)抽样进行细胞增殖谱检验和基础质控。

所述细胞增殖谱检验包括传代细胞培养增殖试验和原代细胞培养试验。

所述传代细胞培养增殖试验包括MARC145细胞增殖试验、Vero细胞增殖试验、ST细胞增殖试验、PK15细胞增殖试验和BHK细胞增殖试验；将能够连续传代6代并细胞形态良好、增殖效率高于90％、贴壁效率和克隆效率与对照血清相当作为分类标准，进行下一步分类。

所述原代细胞培养试验为牛睾丸原代细胞培养试验：对新生牛睾丸进行培养，原代牛睾丸细胞培养16或48h长成单层作为分类标准，进行下一步分类。

所述基础质控包括微生物学检测、细菌内毒素检测、pH检测、病毒抗体检测；对于细胞增殖谱检验。

(7)分类：根据上述传代细胞培养试验结果和原代细胞培养结果，结合抗体检测结果，将血清进行总分类。

(8)赋予档案和标签。

所述步骤(2)中的抗体检测包括牛腹泻病毒抗体检测、口蹄疫抗体检测、猪瘟病毒抗体检测、乙型脑炎病毒抗体检测、猪繁殖与呼吸综合征病毒病毒抗体检测、伪狂犬病毒抗体检测、细小病毒抗体检测和猪流行性腹泻病毒抗体检测。方法采用间接ELISA方法。

所述步骤(4)具体为：在GMP车间内，将装有原料新生牛血清的采血袋在十万级条件下浸泡体积比为72～78％的乙醇10～20min，杀灭容器表面细菌、支原体等微生物，然后传递窗进入百级车间，在百级条件下晾干并将袋中血清倾入无菌混合罐中，搅拌混匀。

所述步骤(7)中的分类包括以下几类：

①猪瘟疫苗病毒生产专用血清：牛睾丸细胞生长良好、不含猪瘟病毒抗体和牛腹泻病毒抗体的血清；

②动物乙型脑炎病毒疫苗生产专用血清：BHK细胞生长良好，不含有乙型脑炎病毒抗体的血清；

③猪繁殖与呼吸综合征病毒病毒疫苗生产专用血清：MARC145细胞生长良好，不含有猪繁殖与呼吸综合征病毒病毒抗体的血清；

④口蹄疫病毒疫苗生产专用血清：BHK细胞生长良好，不含有口蹄疫病毒抗体的血清；

⑤伪狂犬疫苗病毒生产专用血清：Vero细胞生长良好，不含有伪狂犬病毒抗体的血清；

⑥细小疫苗病毒生产专用血清：ST、PK15细胞生长良好，不含细小病毒抗体的血清；

⑦猪流行性腹泻病毒：ST细胞、Vero生长良好，不含猪流行性腹泻病毒抗体的血清；

⑧圆环病毒：ST细胞生长良好，不含有猪流行性腹泻病毒抗体的血清。

所述步骤(8)中的档案包括：①本批次新生牛血清的混合档案：由哪些新生小牛的血清组成；②每只新生牛血清编号、新生牛的隶属关系、出生地、出生时间、取血时间、体重、精神情况、进食情况、有无腹泻，体表粘液、新生牛母亲的健康状况；母牛疫苗接种史、母牛病史：1年来有无发生明显疾病；周围牛群的疫情发生情况：3年来有无发生疫情、周围畜牧养殖动物3年来的疫情情况、细胞增殖谱、病毒抗体背景。

所述传代细胞培养增殖试验具体步骤为：

先将抽检血清配制成血清含量为10％的MEM、DMEM培养液备用；

然后将培养成单层的瓶内细胞用常规方法消化，用上述培养基分散传代6代，第7代时做细胞相对增值率、细胞贴壁率和克隆效果试验评价血清质量。

细胞培养谱包括：MARC145(猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗病毒生产)、Vero(伪狂犬疫苗病毒生产)细胞、ST细胞(细小、猪流行性腹泻病毒、圆环疫苗病毒生产)、PK15细胞(细小疫苗病毒疫苗生产)和国标规定的BHK细胞(乙型脑炎病毒、口蹄疫病毒)。

细胞相对增殖率：按照细胞一般传代比例接种96孔板，37℃±1℃、湿润5％二氧化碳培养箱培养24h，镜下观察观察结合中性红染色测定A540值计算细胞增值率，与对照血清组比较，细胞相对增值率＞90％者判为合格。

细胞相对增值率＝(试验孔A540均值/对照血清A540均值)×100％。

贴壁效率和相对贴壁效率：将受试血清配置成10％的细胞培养液体，然后将上述细胞配置成20个细胞/ml，分别接种于采用24孔培养中，每种细胞接种3孔，37℃±2℃、湿润5％二氧化碳培养箱培养7～10d，结晶紫染色，计算细胞克隆，确定贴壁效率和相对贴壁效率。

同时设计用已知血清作为对照。

贴壁效率(％)＝(每孔克隆平均数/每孔接种活细胞平均数)×100％。

相对贴壁效率＝被测血清贴壁效率/参考血清贴壁效率。

克隆效果测定：采用SP2/0细胞。将SP2/0用RPMI-1640培养液(血清含量10％，用受试血清配置)配置成1.5个细胞/100μL，每孔接种100μL 37℃±2℃、湿润条件、5％二氧化碳培养7～10d后显微镜下观察细胞克隆效率和相对克隆效率。

同时设计用已知血清作为对照。

克隆效率＝(阳性孔平均数/培养孔总数)×100％。

相对克隆效率＝待测血清克隆效率/参考血清克隆效率。

以能够连续传代6代并细胞形态良好、增殖效率高于90％、贴壁效率和克隆效率与对照血清相当为依据，标注细胞生长谱，与抗体谱一起作为确定血清用途的依据。

所述牛睾丸原代细胞培养试验具体为：

将2％碘酒灭菌的新生牛睾丸剥离，置平皿中用磷酸盐缓冲盐水洗3次，剪至约1m³以下，加0.25％胰酶37℃消化20min，1000r/min离心5min，弃胰酶，加含受试血清的培养液置37℃静止培养。分别于16h、48h观察形成单层情况。原代牛睾丸细胞于16或48h长成单层为依据，进行下一步分类。

本发明设计了新的新生牛血清的分类平台，与现有技术相比，增加了两个程序：多种抗体检测分类程序和多种细胞培养分类程序，每份原料血清首先运行抗体检测程序、根据抗体谱进行分类合并，抗体背景相同者为一类，然后抗体背景为依据，再运行细胞增殖谱程序，最后根据细胞增殖情况和抗体背景，将血清做用途分类，这样满足了生物药业生产不同疫苗需求不同血清的需求。多种抗体检测分类程序：将原料血清逐份运行抗体检测程序，抗体谱包括：猪繁殖与呼吸综合征病毒病毒抗体、细小病毒抗体、猪瘟病毒抗体、乙型脑炎病毒抗体、伪狂犬病毒抗体、圆环病毒抗体和口蹄疫病毒抗体，检测方法为间接ELISA法。多种细胞培养分类程序：由于生产疫苗种类的不同，对抗体背景和细胞增殖谱的要求各异，因此，首先根据抗体检测结果、确定血清用途，然后有针对性地进行细胞增殖谱试验，即：在原来国标规定SP2/0细胞、BHK细胞试验基础上，根据抗体背景，扩充牛睾丸原代细胞、MARC145细胞株、Vero细胞株、ST细胞株、CHO细胞株，并在疫苗厂家有特殊要求时及时扩充细胞增殖谱。在抗体背景一致、相应细胞增殖良好的条件下，将血清产品确定为某种疫苗专一用途血清。经过抗体检测和细胞增殖谱检验的血清具有抗体背景明确、细胞生长良好、分类细致、具有专一疫苗生产用途的特点，适用于畜牧业疫苗药业。

本发明的工艺生产的牛血清分类明确、用途专一，可以满足生物药物厂的生产要求，厂家可以根据生产疫苗的不同而购买不同的专用血清。比如猪瘟病毒疫苗的生产，目前国内畜牧养殖业猪瘟病毒疫苗的需求极大，但是猪瘟疫苗的生产成本居高不下，主要原因就是市场流通的血清缺乏多种细胞培养分类程序和多种抗体检测程序的支持，不能保障培养出的牛睾丸细胞每批均处于旺盛生长状况，从而使增殖的病毒效价都能达到要求效价，最终产生不合格产品造成浪费。只有运行牛睾丸细胞增殖试验作为新生牛血清分类程序，才能保障疫苗厂家每批产品的质量，杜绝废品产生，从而提高生产质量、缩短生产周期、降低消耗、减少投入，节省人力物力，增加产出比。而且即便培养的细胞处于旺盛状况，也不能保障生产的疫苗病毒效价符合要求，因为新生牛血清中可能含有某些病毒抗体，比如，生产猪瘟疫苗血清不能有猪瘟病毒抗体和牛腹泻病毒抗体，因为该两种病毒亲缘关系密切，其中之一的中和抗体阳性都会对猪瘟疫苗病毒增殖产生特异性的抑制作用，从而减少了不合格产品。因此除了细胞增殖试验，抗体检测程序的运行在血清分类中非常重要。

其他疫苗的生产也存在相同道理。因此，将多种细胞(尤其专用于疫苗生产的细胞)用于增殖试验，以及采用多种病毒抗体检测作为分类和质控程序生产疫苗专用血清，正是市场之急需，是提高疫苗质量，降低消耗、降低成本之良策。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明：

实施例1：畜牧业不同疫苗专一用途新生牛血清分类生产，步骤如下：

1原料新生牛血清：新生牛血清来源于50头新生小牛，编号：200800001～200800050，每份原料新生牛血清分别有待检小样5份。

2原料新生牛血清的检测：

2.1微生物学检测：

2.1.1细菌检测：将留样10份血清多留样①分别接种肉汤液体培养基2份分别置37℃、25℃培养7～15d，观察培养基混浊变化，并涂片做革兰氏染色，显微镜下寻找杆状或球状等规则、类似微生物的形态。同时将10份留样①接种真菌固体培养，分别置37℃、25℃培养10～20d，观察真菌菌落的生长情况。结果：空白对照肉汤培养基澄清透明，染色未观察到规则形态；真菌培养皿未见菌丝体生长。编号20080001、20080029、200800042原料血清培养基浑浊，有细菌污染，剔除。

2.1.2支原体检测：将留样①分别穿刺接种牛心浸液半固体培养基(双份)，分别置37℃和25℃培养20d以上，以云雾状菌落生长判断支原体阳性，并涂片做革兰氏染色，显微镜观察规则形态。结果：空白培养基未见云雾状菌落生长，编号养基20080029、200800042、200800045培养基可见云雾状菌落生长，剔除。

2.1.3：E.Coli C300(或K-12)噬菌体检测：将大肠杆菌分别接种肉汤培养基37℃培养16h，660nm测定OD值，然后将47份原料血清留样①各100微升，分别接种于上述细菌管中，37℃孵育24小时，再于660nm测定OD值，OD值有下降1/3则判定为有大肠杆菌噬菌体污染。

结果：大肠杆菌培养16小时，OD值在1.01～1.78之间，接种血清后继续培养OD值均有显著上升，OD值在1.47～2.04之间。OD值无下降，表明所检血清无E.Coli C300 or K-12噬菌体污染。

2.3细菌内毒素检测，使用湛江博康海洋生物有限公司检测试剂盒。将鲎试剂用无内毒素蒸馏水100μl溶解，然后分别加入稀释40倍的原料血清留洋②100μl与鲎试剂混合，同时设有阴性对照和阳性对照，37℃孵育1小时后通过观察凝集情况判断标本中的细菌内毒素含量范围。结果，血清标本均未发生凝集，表明血清中的细菌内毒素低于0.125EU/ml(试剂盒检测限量为0.125EU/ml)，符合国标规定标准(国标要求10EU/ml)。

2.4血清蛋白含量检测使用上海尚谊化工科技有限公司BCA试剂盒。将原料血清留样②(不包括上述剔除样品20080001、20080029、200800042、200800045)稀释50倍后取4μL，加入到96孔板中，再加入200μL BCA工作液，同时设空白对照(4μL生理盐水加BCA工作液200μL)和标准样本1～6号(标1：2mg/mL、标2：4mg/mL、标3：6mg/mL、标4：8mg/mL、标5：10mg/mL)，60℃放置20分钟，测A570值，根据标准样本A570值，绘制标准曲线，结果表1、图1。根据标准曲线计算、换算47份牛血清标本的蛋白含量，结果发现蛋白含量均在3.62～4.83之间，符合国家标准(国标规定3.5-5.0g％)。

2.5血红蛋白定量检测：邻-甲联苯胺法(孙玉洁，检测血清中血红蛋白含量的邻-甲联苯胺法的建立，中国生物制品学杂志，2006；19(1)：91～93)。

首先配置邻-甲联苯胺试剂：0.2g加入60％冰乙酸中4℃存放。

配置血红蛋白标准液：分析天平称取血红蛋白标准品(sigma产品)1.0g定容于生理盐水100ml作为母液，然后配置成10.0、15.0、20.0、30.0mg％的标准品。

取上述不同浓度点标准品、血清留样②(不包括上述剔除样品20080001、20080029、200800042、200800045)各取20μl(各重复2份)，同时设生理盐水20μl作为空白对照，分别向上述溶液中依次加1.0ml邻-甲联苯胺溶液和1％过氧化氢溶液，充分混匀，放置10分钟，再分别加入10％乙酸溶液10ml，混合均匀，于435nm比色，以空白调零，读取各溶液吸光度，计算各溶液血红蛋白含量值(血红蛋白(mg/dl)＝测定管吸光度×10/标准管吸光度)，结果发现20080014、20080008、200800037血红蛋白含量分别为0.35mg％、0.37mg％、0.39mg％，超过国家标准。其余血清均在0.011mg％～0.033mg％之间，符合国标要求(国标要求范围为≤0.035mg％)。由于N14、08、37血清血红蛋白含量轻微超标，混入对血清血红蛋白含量影响小，因此，不剔除N14、08、37。

2.6血清抗体检测：ELISA方法。检测抗体谱包括牛腹泻病毒、口蹄疫病毒亚一抗体检测、口蹄疫病毒O型抗体检测、口蹄疫病毒非结构蛋白抗体检测(抗体自然感染则非结构蛋白抗体阳性)、细小病毒抗体、伪狂犬、猪瘟病毒抗体、乙型脑炎病毒抗体、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪流行性腹泻病毒病毒抗体抗体。

其中牛腹泻病毒抗体、口蹄疫(亚一、O型、非结构蛋白)抗体、细小病毒抗体、伪狂犬抗体检测采用美国IDEXX公司ELISA试剂盒；猪瘟病毒抗体、乙型脑炎病毒抗体、猪繁殖与呼吸综合征病毒病毒抗体抗体采用组装试剂。

2.6.1牛腹泻病毒、口蹄疫(亚一、O型和口蹄疫非结构蛋白抗体检测试剂盒)、细小病毒抗体、伪狂犬抗体检测：采用美国IDEXX公司试剂盒，按照说明书操作。

结果发现47份血清口蹄疫疫苗抗体(亚一、O型)均阳性，非结构蛋白抗体(自然感染抗体)阴性，表明动物均为疫苗接种获得抗体，无自然感染病史。同时未测到细小病毒抗体、伪狂犬病毒抗体，有12份标本血清测到BVDV抗体。

2.6.2猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒病毒、乙型脑炎病毒、猪流行性腹泻病毒抗体检测：采用组装试剂盒(实验室常用方法)：

①试剂盒的组装材料：

a酶标板：采用广州捷特高结合力酶标板。

b抗原：猪瘟病毒本科室自制：(采用通用猪瘟病毒培养方法)首先将猪瘟病毒接种兔，取其脾脏作为毒种接种于已经长成单层的牛睾丸细胞上，加维持液35℃、5％CO2培养，之后每5日换液一次，收集培养液，紫外线照射灭火后用作检测试剂；乙型脑炎病毒、猪流行性腹泻病毒抗原本科室自制：将乙型脑炎病毒、猪流行性腹泻病毒毒液分别接种于已经长成单层的BHK21和ST细胞上，加维持液35℃、5％CO2培养，3～5d后细胞变圆、坏死脱落，此时收集并冻融3次，5000r/min离心20min，取上清紫外线照射灭火后用作检测试剂；猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原外购。

c洗板液：为pH7.2的PBS：Na2HPO4.12H2O：2.9g，KCL0.2g，NaCL8g，KH2PO40.2g，加蒸馏水至1000ml。

d辣根过氧化物酶标记兔抗牛IgG、IgM：购自ICL lab公司。

e显色液：sigma公司产品，为A、B两液显色。

f终止液：10％H₂SO₄。

②包被酶标板：将猪瘟病毒、乙型脑炎病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒病毒、细小病毒、猪流行性腹泻病毒抗原分别用碳酸缓冲液(Na₂CO₃：1.5g NaHCO₃ 2.93g加水至1000ml)稀释，加入酶标板中(中国广州洁特生物科技有限公司产品)，每孔100微升，4℃、饱和湿度条件下过夜，洗版3次，甩干，加5％人血清白蛋白37℃封闭1小时，洗版备用。

③抗体检测：将血清留样④做1∶10稀释后分别加入酶标板板孔中，同时设计阴性对照和阳性对照各3孔，37℃孵育30分钟，用洗板液洗板3次并甩干，加酶标兔抗牛IgG37℃孵育30分钟后洗板三次并甩干，加显色液A、B各50微升室温显色10分钟，用终止液20微升终止反应后测定A450nm值。阴性对照3孔均值低于0.15条件下，试验孔OD值≥阴性对照OD值2.1者判为阳性。

结果发现，10份血清测到猪瘟病毒抗体，13份血清侧到乙型脑炎病毒抗体，见表1。

表1血清抗体检测结果

根据上述抗体检测结果，将血清分类如下：

a不适合猪瘟疫苗生产血清：04、、06、8、9、17、24、25、31、36、47、48、49、50；但可以作为其它病毒疫苗的生产；

b不适合乙型脑炎病毒疫苗生产的血清：05、07、08、10、13、15、22、24、33、35、47、48、49，但可以作为其它疫苗的生产；

a、b中47、48、49交叉阳性，该3份血清不适合做乙脑和猪瘟病毒疫苗的生产；

c所有血清不适合口蹄疫疫苗生产；

d未测得猪繁殖与呼吸综合征病毒病毒、伪狂犬病毒、细小疫苗病毒、猪流行性腹泻病毒抗体，因此，所有血清均可作为上述疫苗的生产原料。

3归类合并：上述血清微生物学指标、蛋白和血红蛋白指标均在国标规定范围，因此，合并归类主要以抗体检测结果为依据。

3.1归类：

第一类：猪瘟病毒等疫苗生产专用血清：不包括：猪瘟病毒抗体阳性和BVDB抗体阳性血清(04、06、8、9、14、17、24、25、29、31、36、37、42、45、47、48、49、50)，不包括乙型脑炎病毒抗体阳性血清(05、07、8、10、13、15、22、24、33、35、47、48、49)和已剔除血清01、29、42、45血清在内的11、12、16、18、19、20、21、23、26、27、28、30、32、34、38、39、40、41、43、44、46号血清，共21份血清。同时此类血清也可用于除口蹄疫病毒疫苗之外的多种疫苗的生产；

第二类：伪狂犬病毒等疫苗专用血清：包括05、07、10、13、15、22、33、35、49号。不能用于乙型脑炎病毒和口蹄疫病毒疫苗的生产之外，也可用于其他病毒疫苗的生产。共9头

第三类：乙型脑炎病毒疫苗专用血清包括04、06、9、14、17、25、29、31、36、37、42、45、50号血清。不能用于猪瘟病毒、口蹄疫疫苗之外、其它病毒可用血清，共13头

第四类：猪瘟病毒、乙型脑炎病毒抗体阳性和支原体、细菌污染血清：1、8、24、47、48、49。

3.2合并混合：在GMP车间进行。将四类原料血清先后于万级条件下用72-76％乙醇(V/V)浸泡外包装20min，杀灭采血袋表面细菌、支原体等微生物，然后传递窗进入百级车间，分别在百级条件下将袋中血清倾入无菌混合罐中，搅拌混匀，先后获得四类混合血清。

3.3将四类血清分别送入多级过滤和无菌灌装系统，每瓶450ml装。

4细胞培养谱检验分类和常规质量检测：

4.1细胞培养谱检测：

4.1.1第一类血清细胞培养谱检测：抗体检测提示，该类血清可用于多种疫苗的生产(不包括口蹄疫病毒疫苗)，因此，需做多种细胞增殖试验：ST细胞、Vero细胞、MARC145、BHK细胞、PK15和牛睾丸细胞。

①细胞培养液配制将抽检血清配制成血清含量为20％、10％的MEM，对照血清选用GIBICO产品，含量为20％、10％的MEM培养液备用。

②细胞增殖谱试验

a传代细胞培养增殖试验：将呈对数生长状态的瓶内细胞(ST细胞、Vero细胞、MARC145、BHK和PK15)用0.125％胰酶消化，用无血清培养液分散，加等倍体积的20％受试血清-MEM(血清终浓度为10％)传代6代，第7代时将细胞计数并接种于96孔板内，24h镜下观察结合中性红染色测定A540值计算细胞增值率，相对细胞增值率＞90％者判为合格，结果见表2。

表2第一类血清细胞增殖结果

从上述增殖试验可以看出，第一类血清能够支持各细胞连续传代6代，且细胞形态良好、24增殖相对效率超过90％，血清促进细胞增殖效果好。

b传代细胞贴壁效率和相对贴壁效率：将上述每种细胞用受试血清-细胞培养液配置成20个细胞/ml，分别接种于采用24孔培养中，每种细胞接种3孔，37℃±2℃、湿润5％二氧化碳培养箱培养7～10d，用结晶紫染色，计算着色细胞克隆，确定贴壁效率和相对贴壁效率，结果见表3。

贴壁效率(％)＝(每孔克隆平均数/每孔活存的培养细胞平均数)X100％

表3第一类血清贴壁效率观察

从上表可以看出，ST、MARC145、BHK、PK15相对贴壁率均达到90以上，但Vero相对贴比率低于90％。

c克隆效果测定采用SP2/0细胞。将SP2/0用RPMI-1640培养液(血清含量10％，用受试血清配置)配置成1.5个细胞/100μL，每孔接种100μL 37℃±2℃、湿润条件、5％二氧化碳培养7～10d后显微镜下观察细胞克隆效率和相对克隆效率。

克隆效率＝(阳性孔数/培养孔总数)×100％

相对克隆效率＝待测血清克隆效率/参考血清克隆效率

阳性对照血清采用它GIBICO产品血清。

结果见表4

表4第一类血清克隆形成观察

从上表可以看出，受试血清克隆相对形成率达到90％，表明第一类血清具有促进悬浮细胞克隆形成的作用。

d牛睾丸原代细胞培养试验：将2％碘酒灭菌的新生牛睾丸剥离，置平皿中用磷酸盐缓冲盐水洗3次，剪至约1m³以下，加0.25％胰酶37℃消化20min，1000r/min离心5min，弃胰酶，加含受试血清的培养液置37℃静止培养。分别于16h、48h观察形成单层情况。

原代牛睾丸细胞于24h长成单层，表明第一类血清适用于睾丸原代细胞的培养。

从上述增殖试验可以看出，第一类血清促进细胞增殖、贴壁和克隆形成效果好。但是，Vero细胞相对贴壁率87.5％，因此不建议用于Vero细胞培养。

综合抗体检测结果和细胞增殖试验结果，第一类血清适合如下疫苗的生产：

猪瘟病毒疫苗生产；

动物乙型脑炎病毒疫苗生产；

猪繁殖与呼吸综合征病毒病毒疫苗生产；

细小疫苗病毒疫苗生产；

猪流行性腹泻病毒疫苗生产；

细胞培养试验提示：慎用于以Vero为宿主细胞的病毒疫苗的生产，例如伪狂犬疫苗病毒生产(Vero贴壁效率低于90％)。

4.2.2第二类血清细胞培养谱检测：抗体检测结果提示，第二类类血清可用于多种疫苗的生产，不适合口蹄疫、乙型脑炎病毒疫苗的生产，因此，需做多种细胞增殖试验：ST细胞、Vero细胞、MARC145、牛睾丸细胞。

①细胞培养液配制将抽检血清配制成血清含量为20％、10％的MEM，阳性对照血清血清含量为20％、10％的MEM培养液备用。

②细胞增殖谱试验

a传代细胞培养增殖试验：细胞谱包括ST细胞、Vero细胞、MARC145、PK15，试验方法和结果判断方法同上。阳性对照血清采用它GIBICO产品血清。结果见表5

表5第二类血清细胞增殖结果

从上述增殖试验可以看出，第二类血清能够支持各细胞连续传代6代，且细胞形态良好、24增殖相对效率超过90％，血清促进细胞增殖效果好。但对MARC145增殖效果低于90％。

b传代细胞贴壁效率和相对贴壁效率：方法和计算方法按照第一类血清中叙述方法，结果见表6。

表6第二类血清贴壁效率观察

从上表可以看出，ST、Vero、MARC145、BHK、PK15相对贴壁率均达到90％以上。

c克隆效果测定采用SP2/0细胞。方法和计算方法按照第一类血清中叙述方法。结果见表7。

表7第二类血清克隆形成观察

从相对克隆形成率分析，第二类细胞具有促进悬浮细胞增殖、克隆形成的作用。

d牛睾丸原代细胞培养试验：操作方法和判断同上。原代牛睾丸细胞于24h长成单层，表明第二类血清适用于睾丸原代细胞培养。

从上述增殖试验可以看出，第一类血清促进细胞增殖、贴壁和克隆形成效果好。但是，MARC145增殖率低于90％，因此不建议用于MARC145细胞培养。

综和抗体检测结果和细胞增殖试验结果，第二类血清适合如下疫苗的生产：

猪瘟病毒疫苗生产；

伪狂犬疫苗病毒生产；

细小疫苗病毒疫苗生产；

猪流行性腹泻病毒疫苗生产。

慎用于猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗的生产。

4.2.3第三类血清细胞培养谱检测：

第三类血清细胞培养谱检测：抗体检测结果提示，可用于多种疫苗的生产，不适合不包括口蹄疫、猪瘟病毒疫苗的生产，因此，需做多种细胞增殖试验：ST细胞、Vero细胞、MARC145和BHK细胞。

②细胞增殖谱试验细胞谱包括ST、Vero、MARC145和PK15细胞，试验方法和结果判断方法同上。阳性对照血清采用它GIBICO产品血清。

结果见表8。

表8：第三类血清细胞增殖结果

从上述增殖试验可以看出，第三类血清能够支持各细胞连续传代6代，且细胞形态良好、24增殖相对效率超过90％，血清促进细胞增殖效果好。

b传代细胞贴壁效率和相对贴壁效率：方法和计算方法按照第一类血清中叙述方法，结果见表9。

表9第三类血清贴壁效率观察

从上表可以看出，ST、Vero、MARC145、PK15、BHK相对贴壁率均达到90以上。

c克隆效果测定采用SP2/0细胞。方法和计算方法按照第一类血清中叙述方法。结果见表10。

表10第三类血清克隆形成观察

从相对克隆形成率分析，第三类细胞具有促进悬浮细胞增殖、克隆形成的作用，效果不如对照血清。

从上述增殖试验可以看出，第三类血清促进细胞增殖、贴壁和克隆形成效果好，判为合格。

综合抗体检测结果和细胞增殖试验结果，第二类血清适合如下疫苗的生产：

乙型脑炎病毒疫苗生产；

伪狂犬疫苗病毒生产；

细小疫苗病毒疫苗生产；

第四类：猪瘟病毒、乙型脑炎病毒抗体阳性8、24、47、48、49。因量少，故待同类血清足够分组后做相应处理。

4.2常规指控检测：包括装量检验、微生物学检测(包括细菌、真菌、支原体、大肠杆菌噬菌体)、细菌内毒素检测、蛋白含量检测、血红蛋白含量检测。

检测发现，血清装量合格，微生物学检测和生化指标检测结果见表11：

表11：微生物学指标检测和生化指标检测结果

5赋予标签、档案、出厂。

5.1第一类血清：

1)标签：

●畜牧业疫苗生产专用血清

专用于猪瘟病毒疫苗生产、动物乙型脑炎病毒疫苗生产、猪繁殖与呼吸综合征病毒病毒疫苗生产、细小疫苗病毒疫苗生产、猪流行性腹泻病毒疫苗生产。慎用于以Vero细胞为宿主的疫苗生产(例伪狂犬病毒)。

●450ml装/瓶

●存放条件和存放时间：-20℃存放3年

●注意事项：血清如有混浊不能使用

●生产日期：2008.11.15。

●合格证号：2008.11.15

●生产厂家地址：山东省医学科学院基础所

●网址：www.microbiology-sd.cn

●E-mail：menghyky@yahoo.com.cn

●联系电话：0531-82919701

●质检员号：01

2)第一类血清档案

a新生牛血清编号：11、12、16、18、19、20、21、23、26、27、28、30、32、34、38、39、40、41、43、44、46号血清，共21份血清组成。

b新生牛的隶属关系：济南佳宝乳业有限公司

c出生地：济南佳宝乳业有限公司长青乳牛养殖基地

d出生时间：2008年3～12月

e取血时间：出生后2小时以内

f一般情况：体重70～100kg，精神状况良好，无进食，无腹泻，体表布满粘液；

g新生牛母亲的健康状况：健康

h母牛疫苗接种史：1年内接种过布氏杆菌菌苗、口蹄疫疫苗

i母牛病史：1年来有无发生明显疾病

j周围牛群的疫情发生情况：3年来有无发生疫情

k周围畜牧养殖动物3年来未发生明显疫情

l抗体背景：口蹄疫病毒亚一、O型阳性，非结构蛋白抗体阴性；猪瘟病毒抗体、牛腹泻病毒抗体、细小病毒抗体、乙型脑炎病毒抗体、猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体、猪流行性腹泻病毒抗体阴性。

m细胞增殖谱：ST细胞、MARC145、BHK细胞、PK15贴壁、增殖良好，SP20细胞克隆形成良好，牛睾丸细胞原代生长良好。Vero细胞相对增值率低于90％。

5.2第二类血清：

1)第二类血清标签：

●畜牧业疫苗生产专用血清

专用于猪瘟病毒疫苗生产、伪狂犬病毒疫苗生产、细小疫苗病毒疫苗生产、猪流行性腹泻病毒疫苗生产。不适合用于乙型脑炎病毒疫苗、口蹄疫疫苗的生产，慎用于以MARC145细胞为宿主的疫苗生产(例如猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗的生产)。

●450ml装/瓶

●存放条件和存放时间：-20℃存放3年

●注意事项：血清如有混浊不能使用

●生产日期：2008.11.18。

●合格证号：2008.11.18。

●生产厂家地址：山东省医学科学院基础所

●网址：www.microbiology-sd.cn

●E-mail：menghyky@yahoo.com.cn

●联系电话：0531-82919701

●质检员号：01

2)赋予档案

a新生牛血清编号：05、 07、10、13、15、22、33、35、49号，共9份血清组成。

b新生牛的隶属关系：济南佳宝乳业有限公司

c出生地：济南佳宝乳业有限公司长青乳牛养殖基地

d出生时间：2008年3～12月

e取血时间：出生后2小时以内

g新生牛母亲的健康状况：健康

h母牛疫苗接种史：1年内接种过布氏杆菌菌苗、口蹄疫疫苗

i母牛病史：1年来有无发生明显疾病

j周围牛群的疫情发生情况：3年来有无发生疫情

k周围畜牧养殖动物3年来的疫情情况

l抗体档案：口蹄疫病毒亚一、O型阳性，非结构蛋白抗体阴性；乙型脑炎病毒抗体阳性；猪瘟病毒抗体、牛腹泻病毒抗体、细小病毒抗体、猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体、猪流行性腹泻病毒抗体阴性。

m细胞增殖谱：ST、Vero细胞增殖、贴壁良好，牛睾丸原代细胞生长良好。MARC145细胞增殖率低于90％。

5.3第三类血清

1)标签

●畜牧业疫苗生产专用血清

专用于伪狂犬病毒疫苗生产、动物乙型脑炎病毒疫苗生产、猪繁殖与呼吸综合征病毒病毒疫苗生产、细小疫苗病毒疫苗生产、猪流行性腹泻病毒疫苗生产。不用于猪瘟病毒疫苗、口蹄疫病毒疫苗的生产。慎用于以Vero细胞为宿主的疫苗生产。

●450ml装/瓶

●存放条件和存放时间：-20℃存放3年，4℃存放1个月

●注意事项：血清如有混浊不能使用

●生产日期：2008.11.18

●合格证号：2008.11.18

●生产厂家地址：山东省医学科学院基础所

●网址：www.microbiology-sd.cn

●E-mail：menghyky@yahoo.com.cn

●联系电话：0531-82919701

●质检员号：01

2)赋予档案

a新生牛血清编号：04、06、9、14、17、25、29、31、36、37、42、45、50号血清，共13份血清组成。

b新生牛的隶属关系：济南佳宝乳业有限公司

c出生地：济南佳宝乳业有限公司长青乳牛养殖基地

d出生时间：2008年3～12月

e取血时间：出生后2小时以内

f一般情况：体重、精神情况，有无进食，有无腹泻，体表粘液；70～100kg。

g新生牛母亲的健康状况：健康

h母牛疫苗接种史：1年内接种过布氏杆菌菌苗、口蹄疫疫苗。

i母牛病史：1年来有无发生明显疾病；j周围牛群的疫情发生情况：3年来有无发生疫情；k周围畜牧养殖动物3年来的疫情情况。

l抗体档案：口蹄疫病毒亚一、O型阳性，非结构蛋白抗体阴性；猪瘟病毒抗体阳性；乙型脑炎病毒抗体、细小病毒抗体、猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体、猪流行性腹泻病毒抗体阴性。

m细胞增殖谱：ST、Vero细胞增殖、贴壁良好。MARC145细胞增殖率低于90％。

附：表12为国家现有新生牛血清的质量检测标准。

表12：产品质量、检测标准

Claims

1.一种新生牛血清的分类生产工艺，其特征在于，包括以下步骤：

(1)原料新生牛血清的生产：采用无支原体采血法采取新生牛血清；

(2)检验：对上述采取的新生牛血清进行蛋白、血红蛋白、细菌内毒素定量检测、微生物学检测和抗体检测；

(3)第一次分类：将相同抗体背景者归类；

(4)合并混匀：将上述抗体背景相同的血清在无菌混合罐中合并混匀；

(5)将上述混匀的血清打入终末滤网为0.3μm的多级过滤系统，无菌罐装系统罐装；

(6)抽样进行细胞增殖谱检验和基础质控；

所述细胞增殖谱检验包括传代细胞培养增殖试验和原代细胞培养试验；

所述传代细胞培养增殖试验包括MARC145细胞增殖试验、Vero细胞增殖试验、ST细胞增殖试验、PK15细胞增殖试验和BHK细胞增殖试验；能够连续传代6代并细胞形态良好、增殖效率高于90％、贴壁效率和克隆效率与对照血清相当者，进行下一步分类；

所述原代细胞培养试验为牛睾丸原代细胞培养试验：对新生牛睾丸进行培养，原代牛睾丸细胞培养16或48h长成单层者，进行下一步分类；

所述基础质控包括微生物学检测、细菌内毒素检测、pH检测、病毒抗体检测；对于细胞增殖谱检验；

(7)分类：根据上述传代细胞培养试验结果和原代细胞培养结果，结合抗体检测结果，将血清进行总分类；

(8)赋予档案和标签。

2.根据权利要求1所述的一种新生牛血清的分类生产工艺，其特征在于：所述步骤(2)中的抗体检测包括牛腹泻病毒抗体检测、口蹄疫抗体检测、猪瘟病毒抗体检测、乙型脑炎病毒抗体检测、PRRSV病毒抗体检测、伪狂犬病毒抗体检测、细小病毒抗体检测和猪流行性腹泻病毒抗体检测。

3.根据权利要求1所述的一种新生牛血清的分类生产工艺，其特征在于：所述步骤(4)具体为：在GMP车间内，将装有原料新生牛血清的采血袋在十万级条件下浸泡体积比为72～78％的乙醇10～20min，杀灭容器表面细菌、支原体等微生物，然后传递窗进入百级车间，在百级条件下晾干并将袋中血清倾入无菌混合罐中，搅拌混匀。

4.根据权利要求1所述的一种新生牛血清的分类生产工艺，其特征在于：所述步骤(7)中的分类包括以下几类：

①猪瘟疫苗病毒生产专用血清：牛睾丸细胞生长良好、不含猪瘟病毒抗体和BVDV抗体的血清；

③猪PRRSV病毒疫苗生产专用血清：MARC145细胞生长良好，不含有PRRSV病毒抗体的血清；

5.根据权利要求1所述的一种新生牛血清的分类生产工艺，其特征在于：所述步骤(8)中的档案包括：①本批次新生牛血清的混合档案：由哪些新生小牛的血清组成；②每只新生牛血清编号、新生牛的隶属关系、出生地、出生时间、取血时间、体重、精神情况、进食情况、有无腹泻，体表粘液、新生牛母亲的健康状况；母牛疫苗接种史、母牛病史：1年来有无发生明显疾病；周围牛群的疫情发生情况：3年来有无发生疫情、周围畜牧养殖动物3年来的疫情情况、细胞增殖谱、病毒抗体背景。