CN108318681A - 一种库波热病毒的检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents

一种库波热病毒的检测试剂盒及其检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种库波热病毒的检测试剂盒及其检测方法。该试剂盒包括氨基酸序列为SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6所示的6条多肽。该检测方法包括步骤：(1)用分离液分离待测样本，将分离好的细胞重悬于无血清培养基中；(2)向重悬后的细胞中加入氨基酸序列为SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6所示的6条多肽进行共孵育，然后向共孵育的体系中加入高特异性鼠抗人IgG抗体进行抗原抗体反应；(3)对抗原抗体反应后的体系进行洗涤，再加入显色底物进行显色反应，计数反应生成的斑点数。本发明的试剂盒能够人工全序列合成，生产方便快捷，稳定性和特异性高，且试剂盒操作简便，极大地降低了成本。

Description

一种库波热病毒的检测试剂盒及其检测方法
技术领域
本发明属于医疗检测技术领域，具体涉及一种库波热病毒的检测试剂盒及其检测方法。
背景技术
库波热病毒(Ekpoma virus)是2015年在西非尼日利亚新发现的病毒，分1 型(EKV1)和2型(EKV2)两个亚型，主要感染牛，媒介为库蠓，全球仅有1次报道。同时该病毒与另外一种引起出血热病死率高的下刚果热病毒(Bas-congo virus)高度同源，且因病例少，病源生物形状不明。发热表现为上午体温正常，下午有低热，凌晨高烧至40℃，早晚体温有波动。库蠓是一种寄生在灌木林的吸血小虫，容易传播人畜共患疾病。因为是库蠓传播、体温波动，所以我们把它中文命名为库波热。
根据案例的流行病学调查表明，患者携带病毒时间长达3周以上，而在我国存在该病的传播媒介——库蠓，且分布种类多、地区广，一旦传入可能造成流行风险。检验检疫部门一直都在关注其生物学性状和致病机制的研究。
可以通过抗原与抗体的特异性结合，根据循环外周血中库波热病毒的抗体的数量，可以判断是否感染库波热病毒，用于库波热病毒感染的临床辅助诊断，可以快速、敏感的检测出人体的感染情况。现有对库波热病毒的检测试剂盒存在制备方法复杂、耗时长、价格昂贵等问题。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种库波热病毒的检测试剂盒及其检测方法，以期解决上述现有技术中存在的至少部分技术问题。
为了实现上述目的，本发明提供一种库波热病毒的检测试剂盒，其包括氨基酸序列为SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6所示的6条多肽，分别为：
SEQ ID NO.1：Gly Ala Glu Ala Ala Val Leu Glu Glu Leu Ala Ala Ala GlyIle Gln Gly Ser Thr Ala；
SEQ ID NO.2：Gln Glu Ala Gly Gly Glu Leu Glu Ser Ile Arg Val Thr AlaSer Ala Arg Thr Gly Gly；
SEQ ID NO.3：Thr Met Gly Ala Gly Glu Thr Ala Ile Glu Arg Arg Ala ProAla Thr Ala Thr Gly Ala；
SEQ ID NO.4：Ser Glu Ala Glu Glu Ala Met Asp Leu Leu Ala Thr Ile AlaSer Thr Gly Gly Ala Ala；
SEQ ID NO.5：Gly Leu Thr Ile Val Gly Glu Leu Lys Ala Gly Gly Ser AlaAla Thr Ala Ile Gly Glu；
SEQ ID NO.6：Thr Ala Ser Ala Thr Gly Leu Ile Glu Gly Asp Glu Ala AlaMet Ser Ala Ile Gly Ala。
本发明中，氨基酸序列为SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6所示的6条多肽在试剂盒中作为TB刺激物，用于检测反应。
优选地，在所述库波热病毒的检测试剂盒中，氨基酸序列为SEQ ID NO.1～ SEQID NO.6所示的6条多肽中的每一条的含量为10mg。
优选地，所述库波热病毒的检测试剂盒还包括无血清培养基。
优选地，所述库波热病毒的检测试剂盒还包括分离液。
优选地，所述库波热病毒的检测试剂盒还包括高特异性鼠抗人IgG抗体和/ 或库波热病毒感染阳性刺激物。
优选地，所述库波热病毒的检测试剂盒还包括用于酶联免疫斑点法的显色试剂，如NBT/BCIP显色系统，最终显色蓝紫色斑点，或AEC显色系统，最终显色红色斑点。
本发明还提供利用前述库波热病毒的检测试剂盒对库波热病毒进行检测的方法，包括如下步骤：
(1)用分离液分离待测样本，将分离好的细胞重悬于无血清培养基中；
(2)向重悬后的细胞中加入氨基酸序列如进行共孵育，然后向共孵育的体系中加入高特异性鼠抗人IgG抗体进行抗原抗体反应；
(3)对抗原抗体反应后的体系进行洗涤，再加入显色底物进行显色反应，计数反应生成的斑点数。
步骤(1)中，所述将分离好的细胞重悬于无血清培养基中优选保持细胞浓度为1.0×105～3.0×105细胞/mL。
步骤(2)中，所述重悬后的细胞优选加入96孔板中，所述加入氨基酸序列为SEQ IDNO.1～SEQ ID NO.6所示的6条多肽优选加入96孔板中与重悬后的细胞混合以进行共孵育。所述重悬后的细胞的添加量更优选每个反应孔为100 μL，所述氨基酸序列为SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6所示的6条多肽的添加量优选每个反应孔中的终浓度为5μL。所述共孵育的时间优选16～20小时。
如本领域常规，步骤(2)在操作时，优选设置阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为库波热病毒阳性刺激物；所述阴性对照为无血清培养基留白，即反应孔中只添加无血清培养基，不添加任何其他试剂。
必须要指出的是，本发明所述的对库波热病毒进行检测的方法属于针对体外分离样本进行鉴定定性的检测方法，仅以获得待测样本中是否被库波热病毒刺激而感染的数量为直接结果和目的，并不涉及对人体健康状况的判断，不属于与疾病诊断相关的方法。
本发明中，上述优选条件在符合本领域常识的基础上可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明除特别说明之外，所用的百分比都是体积百分比。
本发明的有益效果为：本发明提供的包括氨基酸序列为SEQ ID NO.1～SEQ IDNO.6所示的6条多肽的检测试剂盒能够人工全序列合成，生产方便快捷，稳定性和特异性高，且相比传统方法检测的过程大大简化，极大地降低了成本。利用该试剂盒对分离的体外样本进行检测方便快捷，可控性和精确性均非常理想，且试剂盒操作简便。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明作进一步的详细说明。
本发明基于库波热病毒的免疫应答机制对传统的检测方法进行了创新，研发出了能够人工全序列合成的6条多肽作为检测物(即序列表中的多肽1～多肽 6，氨基酸编码序列对应为SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6)，经过大量的实验验证，并经和现有的检测方法对比，具有明显优势，本发明的包括氨基酸序列为SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6所示的6条多肽的试剂盒及利用其对体外库波热病毒感染待测样本进行检测的方法具有方便快捷、准确度高、成本低等优势，具有良好的应用前景。
氨基酸序列为SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6的6条多肽，具体分别为：
SEQ ID NO.1：Gly Ala Glu Ala Ala Val Leu Glu Glu Leu Ala Ala Ala GlyIle Gln Gly Ser Thr Ala；
SEQ ID NO.2：Gln Glu Ala Gly Gly Glu Leu Glu Ser Ile Arg Val Thr AlaSer Ala Arg Thr Gly Gly；
SEQ ID NO.3：Thr Met Gly Ala Gly Glu Thr Ala Ile Glu Arg Arg Ala ProAla Thr Ala Thr Gly Ala；
SEQ ID NO.4：Ser Glu Ala Glu Glu Ala Met Asp Leu Leu Ala Thr Ile AlaSer Thr Gly Gly Ala Ala；
SEQ ID NO.5：Gly Leu Thr Ile Val Gly Glu Leu Lys Ala Gly Gly Ser AlaAla Thr Ala Ile Gly Glu；
SEQ ID NO.6：Thr Ala Ser Ala Thr Gly Leu Ile Glu Gly Asp Glu Ala AlaMet Ser Ala Ile Gly Ala。
下面是具体的实施例，用于进一步阐述本发明的技术方案及技术效果。
实施例1
人外周血(PBMC)样本来源于库波热病毒感染性病人及非库波热病毒感染性人群，数量为127个待测样本。
每人采样个体身上用肝素钠收集管采集10mL血液，室温条件下6小时内运至实验室。
各待测样本的检测步骤如下：
(1)用分离液将PBMC分离，分离好的细胞重悬于无血清培养基中，细胞浓度为1.5×105细胞/mL；将重悬的细胞加入PVDF96孔板中，每个反应孔加入 100μL，每个样品加入10孔中，即做10个重复；
(2)向各反应孔中加入由无血清培养基和终浓度分别达到5μM的6条多肽组成的混合物50μL，混合均匀进行共孵育；设置阳性对照和阴性对照，向共孵育的体系中加入高特异性鼠抗人IgG抗体进行抗原抗体反应；
(3)6％二氧化碳培养箱36℃孵育16小时；
(4)对抗原抗体反应后的体系用PBS缓冲液进行洗涤；
(5)再加入显色底物进行显色反应，室温孵育25分钟，孵育过程中观察斑点形成，计数反应生成的斑点数。
使用斑点分析仪计数斑点形成细胞的数量，根据阴性和阳性判定标准的判定，分别统计检测阴性和阳性例数，如下表所示。
阳性符合率：73/(73+6)＝92.41％
阴性符合率：44/(44+4)＝91.67％
实施例2
人外周血(PBMC)样本来源于库波热病毒感染性病人及非库波热病毒感染性人群，数量为127个待测样本。
每人采样个体身上用肝素钠收集管采集10mL血液，室温条件下6小时内运至实验室。
各待测样本的检测步骤如下：
(1)用分离液将PBMC分离，分离好的细胞重悬于无血清培养基中，细胞浓度为3.5×105细胞/mL；将重悬的细胞加入PVDF96孔板中，每个反应孔加入 100μL，每个样品加入10孔中，即做10个重复；
(2)向各反应孔中加入由无血清培养基和终浓度分别达到5μM的6条多肽组成的混合物50μL，混合均匀进行共孵育；设置阳性对照和阴性对照，向共孵育的体系中加入高特异性鼠抗人IgG抗体进行抗原抗体反应；
(3)5％二氧化碳培养箱36℃孵育20小时；
(4)对抗原抗体反应后的体系用PBS缓冲液进行洗涤；
(5)再加入显色底物进行显色反应，室温孵育30分钟，孵育过程中观察斑点形成，计数反应生成的斑点数。
使用斑点分析仪计数斑点形成细胞的数量，根据阴性和阳性判定标准的判定，分别统计检测阴性和阳性例数，如下表所示。
阳性符合率：75/(75+5)＝93.75％
阴性符合率：43/(43+4)＝91.49％
实验结果表面，与现有使用相同方法的产品相比较，有相类似的灵敏度及特异性，可以作为一种库波热病毒检测试剂盒使用，且成本低廉，操作简单。
综上所述，本发明的多肽混合物、检测试剂盒及其相应的检测方法用于检测库波热病毒，具有方便快捷、稳定性高、特异性强的特点，且极大地降低了成本。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效结构变化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。

Claims (7)

1.一种库波热病毒的检测试剂盒，其特征在于，其包括氨基酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6所示的6条多肽：
SEQ ID NO.1：Gly Ala Glu Ala Ala Val Leu Glu Glu Leu Ala Ala Ala Gly IleGln Gly Ser Thr Ala；
SEQ ID NO.2：Gln Glu Ala Gly Gly Glu Leu Glu Ser Ile Arg Val Thr Ala SerAla Arg Thr Gly Gly；
SEQ ID NO.3：Thr Met Gly Ala Gly Glu Thr Ala Ile Glu Arg Arg Ala Pro AlaThr Ala Thr Gly Ala；
SEQ ID NO.4：Ser Glu Ala Glu Glu Ala Met Asp Leu Leu Ala Thr Ile Ala SerThr Gly Gly Ala Ala；
SEQ ID NO.5：Gly Leu Thr Ile Val Gly Glu Leu Lys Ala Gly Gly Ser Ala AlaThr Ala Ile Gly Glu；
SEQ ID NO.6：Thr Ala Ser Ala Thr Gly Leu Ile Glu Gly Asp Glu Ala Ala MetSer Ala Ile Gly Ala。
2.根据权利要求1所述的库波热病毒的检测试剂盒，其特征在于，在所述库波热病毒的检测试剂盒中，氨基酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6所示的6条多肽中的每一条的含量为10mg。
3.根据权利要求1所述的库波热病毒的检测试剂盒，其特征在于，所述库波热病毒的检测试剂盒还包括无血清培养基。
4.根据权利要求1所述的库波热病毒的检测试剂盒，其特征在于，所述库波热病毒的检测试剂盒还包括分离液。
5.根据权利要求1所述的库波热病毒的检测试剂盒，其特征在于，所述库波热病毒的检测试剂盒还包括高特异性鼠抗人IgG抗体和/或库波热病毒感染阳性刺激物。
6.根据权利要求1所述的库波热病毒的检测试剂盒，其特征在于，所述库波热病毒的检测试剂盒还包括用于酶联免疫斑点法的显色试剂。
7.利用如权利要求1-6中任一项所述的库波热病毒的检测试剂盒对库波热病毒进行检测的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)用分离液分离待测样本，将分离好的细胞重悬于无血清培养基中；
(2)向重悬后的细胞中加入氨基酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6所示的6条多肽进行共孵育，然后向共孵育的体系中加入高特异性鼠抗人IgG抗体进行抗原抗体反应；
(3)对抗原抗体反应后的体系进行洗涤，再加入显色底物进行显色反应，计数反应生成的斑点数。
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