CN108872605A - 一种美洲锥虫病的检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents

一种美洲锥虫病的检测试剂盒及其检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种美洲锥虫病的检测试剂盒及其检测方法。该试剂盒包括氨基酸序列为SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6所示的6条多肽。该检测方法包括步骤：(1)用分离液分离待测样本，将分离好的细胞重悬于无血清培养基中；(2)向重悬后的细胞中加入氨基酸序列为SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6所示的6条多肽进行共孵育，然后向共孵育的体系中加入高特异性鼠抗人IgG抗体进行抗原抗体反应；(3)对抗原抗体反应后的体系进行洗涤，再加入显色底物进行显色反应，计数反应生成的斑点数。本发明的试剂盒能够人工全序列合成，生产方便快捷，稳定性和特异性高，且试剂盒操作简便，极大地降低了成本。

Description

一种美洲锥虫病的检测试剂盒及其检测方法
技术领域
本发明属于医疗检测技术领域，具体涉及一种美洲锥虫病的检测试剂盒及其检测方法。
背景技术
美洲锥虫病病由克鲁斯锥虫引起，主要传播媒介为吸血猎蝽虫，于1908年由Chagas医生发现，故又称Chagas病。主要流行于中、南美洲，所以称美洲锥虫病。该病急性期有发热、颜面水肿、淋巴结炎、贫血等。慢性期常有心肌炎、心力衰竭、巨食管炎、巨结肠及肺、脑栓塞，猝死等发生。
克氏锥虫寄生于人和哺乳动物的血液和多种组织细胞内。其生活史中有锥鞭毛体与无鞭毛体两种形态。锥鞭毛体经皮肤创口感染侵入人体血液。该病也可通过母乳、胎盘、输血或食入传染性锥蝽粪便污染的食物而感染。估计在中、南美洲有2000万受染者。该病的潜伏期被锥蝽叮咬受染者为6～10天，由输血受染者为10～20天。临床可分急性期、隐匿期和慢性期。
美洲锥虫病隐匿期长达20-30年，难以被发现，重症患者预后不良。
美国科学公共图书馆PLoS发表的一篇文章，美国贝勒医学院的热带病专家称，由于这种疾病目前在美洲的爆发形态十分类似于早期艾滋病的传播，因此也被叫作了“新型艾滋病”。
为快速准确检测出美洲锥虫病，可以通过抗原与抗体的特异性结合，根据循环外周血中美洲锥虫病的抗体的数量，可判断是否感染美洲锥虫病，用于美洲锥虫病感染的临床辅助诊断，可以快速、敏感的检测出人体的感染情况。目前还没有比较有效的专门针对美洲锥虫病的精确检测手段。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种美洲锥虫病的检测试剂盒及其检测方法，以期解决上述现有技术中存在的至少部分技术问题。
为了实现上述目的，本发明提供一种美洲锥虫病的检测试剂盒，其包括氨基酸序列为SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6所示的6条多肽，分别为：
SEQ ID NO.1：Glu Glu Gly Ala Glu Ala Ala Val Leu Leu Ala Ala Ala GlyIle Gln Gly Ser Ala；
SEQ ID NO.2：Gln Glu Leu Glu Ser Glu Ala Gly Gly Ile Arg Val Thr AlaSer Ala Arg Thr Gly；
SEQ ID NO.3：Thr Met Gly Ala Gly Ile Glu Arg Arg Glu Thr Ala Ala ProAla Thr Ala Thr Ala；
SEQ ID NO.4：Glu Ala Met Asp Leu Leu Ser Glu Ala Glu Ala Thr Ile AlaSer Thr Gly Gly Ala；
SEQ ID NO.5：Gly Leu Thr Ile Val Gly Glu Gly Ser Leu Lys Ala Gly AlaAla Thr Ala Ile Glu；
SEQ ID NO.6：Thr Ala Ile Glu Gly Asp Ser Ala Thr Gly Leu Glu Ala AlaMet Ser Ala Ile Ala。
本发明中，氨基酸序列为SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6所示的6条多肽在试剂盒中作为TB刺激物，用于检测反应。
优选地，在所述美洲锥虫病的检测试剂盒中，氨基酸序列为SEQ ID NO.1～SEQ IDNO.6所示的6条多肽中的每一条的含量为10mg。
优选地，所述美洲锥虫病的检测试剂盒还包括无血清培养基。
优选地，所述美洲锥虫病的检测试剂盒还包括分离液。
优选地，所述美洲锥虫病的检测试剂盒还包括高特异性鼠抗人IgG抗体和/或美洲锥虫病感染阳性刺激物。
优选地，所述美洲锥虫病的检测试剂盒还包括用于酶联免疫斑点法的显色试剂，如NBT/BCIP显色系统，最终显色蓝紫色斑点，或AEC显色系统，最终显色红色斑点。
本发明还提供利用前述美洲锥虫病的检测试剂盒对美洲锥虫病进行检测的方法，包括如下步骤：
(1)用分离液分离待测样本，将分离好的细胞重悬于无血清培养基中；
(2)向重悬后的细胞中加入氨基酸序列如进行共孵育，然后向共孵育的体系中加入高特异性鼠抗人IgG抗体进行抗原抗体反应；
(3)对抗原抗体反应后的体系进行洗涤，再加入显色底物进行显色反应，计数反应生成的斑点数。
步骤(1)中，所述将分离好的细胞重悬于无血清培养基中优选保持细胞浓度为1.0×105～3.0×105细胞/mL。
步骤(2)中，所述重悬后的细胞优选加入96孔板中，所述加入氨基酸序列为SEQ IDNO.1～SEQ ID NO.6所示的6条多肽优选加入96孔板中与重悬后的细胞混合以进行共孵育。所述重悬后的细胞的添加量更优选每个反应孔为100μL，所述氨基酸序列为SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6所示的6条多肽的添加量优选每个反应孔中的终浓度为5μL。所述共孵育的时间优选16～20小时。
如本领域常规，步骤(2)在操作时，优选设置阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为美洲锥虫病阳性刺激物；所述阴性对照为无血清培养基留白，即反应孔中只添加无血清培养基，不添加任何其他试剂。
必须要指出的是，本发明所述的对美洲锥虫病进行检测的方法属于针对体外分离样本进行鉴定定性的检测方法，仅以获得待测样本中是否被美洲锥虫病刺激而感染的数量为直接结果和目的，并不涉及对人体健康状况的判断，不属于与疾病诊断相关的方法。
本发明中，上述优选条件在符合本领域常识的基础上可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明除特别说明之外，所用的百分比都是体积百分比。
本发明的有益效果为：本发明提供的包括氨基酸序列为SEQ ID NO.1～SEQ IDNO.6所示的6条多肽的检测试剂盒能够人工全序列合成，生产方便快捷，稳定性和特异性高，且相比传统方法检测的过程大大简化，极大地降低了成本。利用该试剂盒对分离的体外样本进行检测方便快捷，可控性和精确性均非常理想，且试剂盒操作简便。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明作进一步的详细说明。
本发明基于美洲锥虫病的免疫应答机制，设计出能够人工全序列合成的6条多肽作为检测物(即序列表中的多肽1～多肽6，氨基酸编码序列对应为SEQ ID NO.1～SEQ IDNO.6)，经过大量的实验验证，并经和现有的检测方法对比，具有明显优势，本发明的包括氨基酸序列为SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6所示的6条多肽的试剂盒及利用其对体外美洲锥虫病感染待测样本进行检测的方法具有方便快捷、准确度高、成本低等优势，具有良好的应用前景。
氨基酸序列为SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6的6条多肽，具体分别为：
SEQ ID NO.1：Glu Glu Gly Ala Glu Ala Ala Val Leu Leu Ala Ala Ala GlyIle Gln Gly Ser Ala；
SEQ ID NO.2：Gln Glu Leu Glu Ser Glu Ala Gly Gly Ile Arg Val Thr AlaSer Ala Arg Thr Gly；
SEQ ID NO.3：Thr Met Gly Ala Gly Ile Glu Arg Arg Glu Thr Ala Ala ProAla Thr Ala Thr Ala；
SEQ ID NO.4：Glu Ala Met Asp Leu Leu Ser Glu Ala Glu Ala Thr Ile AlaSer Thr Gly Gly Ala；
SEQ ID NO.5：Gly Leu Thr Ile Val Gly Glu Gly Ser Leu Lys Ala Gly AlaAla Thr Ala Ile Glu；
SEQ ID NO.6：Thr Ala Ile Glu Gly Asp Ser Ala Thr Gly Leu Glu Ala AlaMet Ser Ala Ile Ala。
下面是具体的实施例，用于进一步阐述本发明的技术方案及技术效果。
实施例1
马外周血样本来源于美洲锥虫病感染性家马及非感染家马，数量为127个待测样本。
每个采样个体用肝素钠收集管采集10mL血液，室温条件下6小时内运至实验室。
各待测样本的检测步骤如下：
(1)用分离液将PBMC分离，分离好的细胞重悬于无血清培养基中，细胞浓度为1.5×105细胞/mL；将重悬的细胞加入PVDF96孔板中，每个反应孔加入100μL，每个样品加入10孔中，即做10个重复；
(2)向各反应孔中加入由无血清培养基和终浓度分别达到5μM的6条多肽组成的混合物50μL，混合均匀进行共孵育；设置阳性对照和阴性对照，向共孵育的体系中加入高特异性鼠抗人IgG抗体进行抗原抗体反应；
(3)6％二氧化碳培养箱36℃孵育16小时；
(4)对抗原抗体反应后的体系用PBS缓冲液进行洗涤；
(5)再加入显色底物进行显色反应，室温孵育25分钟，孵育过程中观察斑点形成，计数反应生成的斑点数。
使用斑点分析仪计数斑点形成细胞的数量，根据阴性和阳性判定标准的判定，分别统计检测阴性和阳性例数，如下表所示。
阳性符合率：73/(73+6)＝92.41％
阴性符合率：44/(44+4)＝91.67％
实施例2
马外周血样本来源于美洲锥虫病感染性家马及非感染家马，数量为127个待测样本。
每个采样个体用肝素钠收集管采集10mL血液，室温条件下6小时内运至实验室。
各待测样本的检测步骤如下：
(1)用分离液将PBMC分离，分离好的细胞重悬于无血清培养基中，细胞浓度为3.5×105细胞/mL；将重悬的细胞加入PVDF96孔板中，每个反应孔加入100μL，每个样品加入10孔中，即做10个重复；
(2)向各反应孔中加入由无血清培养基和终浓度分别达到5μM的6条多肽组成的混合物50μL，混合均匀进行共孵育；设置阳性对照和阴性对照，向共孵育的体系中加入高特异性鼠抗人IgG抗体进行抗原抗体反应；
(3)5％二氧化碳培养箱36℃孵育20小时；
(4)对抗原抗体反应后的体系用PBS缓冲液进行洗涤；
(5)再加入显色底物进行显色反应，室温孵育30分钟，孵育过程中观察斑点形成，计数反应生成的斑点数。
使用斑点分析仪计数斑点形成细胞的数量，根据阴性和阳性判定标准的判定，分别统计检测阴性和阳性例数，如下表所示。
阳性符合率：75/(75+5)＝93.75％
阴性符合率：43/(43+4)＝91.49％
实验结果表面，与现有使用相同方法的产品相比较，有相类似的灵敏度及特异性，可以作为一种美洲锥虫病检测试剂盒使用，且成本低廉，操作简单。
综上所述，本发明的多肽混合物、检测试剂盒及其相应的检测方法用于检测美洲锥虫病，具有方便快捷、稳定性高、特异性强的特点，且极大地降低了成本。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效结构变化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。
序列表
<110> 李梅秀
<120> 一种美洲锥虫病的检测试剂盒及其检测方法
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Glu Glu Gly Ala Glu Ala Ala Val Leu Leu Ala Ala Ala Gly Ile Gln
1 5 10 15
Gly Ser Ala
<210> 2
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Gln Glu Leu Glu Ser Glu Ala Gly Gly Ile Arg Val Thr Ala Ser Ala
1 5 10 15
Arg Thr Gly
<210> 3
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Thr Met Gly Ala Gly Ile Glu Arg Arg Glu Thr Ala Ala Pro Ala Thr
1 5 10 15
Ala Thr Ala
<210> 4
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Glu Ala Met Asp Leu Leu Ser Glu Ala Glu Ala Thr Ile Ala Ser Thr
1 5 10 15
Gly Gly Ala
<210> 5
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Gly Leu Thr Ile Val Gly Glu Gly Ser Leu Lys Ala Gly Ala Ala Thr
1 5 10 15
Ala Ile Glu
<210> 6
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Thr Ala Ile Glu Gly Asp Ser Ala Thr Gly Leu Glu Ala Ala Met Ser
1 5 10 15
Ala Ile Ala

Claims (7)

1.一种美洲锥虫病的检测试剂盒，其特征在于，其包括氨基酸序列为SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6所示的6条多肽：
SEQ ID NO.1：Glu Glu Gly Ala Glu Ala Ala Val Leu Leu Ala Ala Ala Gly IleGln Gly Ser Ala；
SEQ ID NO.2：Gln Glu Leu Glu Ser Glu Ala Gly Gly Ile Arg Val Thr Ala SerAla Arg Thr Gly；
SEQ ID NO.3：Thr Met Gly Ala Gly Ile Glu Arg Arg Glu Thr Ala Ala Pro AlaThr Ala Thr Ala；
SEQ ID NO.4：Glu Ala Met Asp Leu Leu Ser Glu Ala Glu Ala Thr Ile Ala SerThr Gly Gly Ala；
SEQ ID NO.5：Gly Leu Thr Ile Val Gly Glu Gly Ser Leu Lys Ala Gly Ala AlaThr Ala Ile Glu；
SEQ ID NO.6：Thr Ala Ile Glu Gly Asp Ser Ala Thr Gly Leu Glu Ala Ala MetSer Ala Ile Ala。
2.根据权利要求1所述的美洲锥虫病的检测试剂盒，其特征在于，在所述美洲锥虫病的检测试剂盒中，氨基酸序列为SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6所示的6条多肽中的每一条的含量为10mg。
3.根据权利要求1所述的美洲锥虫病的检测试剂盒，其特征在于，所述美洲锥虫病的检测试剂盒还包括无血清培养基。
4.根据权利要求1所述的美洲锥虫病的检测试剂盒，其特征在于，所述美洲锥虫病的检测试剂盒还包括分离液。
5.根据权利要求1所述的美洲锥虫病的检测试剂盒，其特征在于，所述美洲锥虫病的检测试剂盒还包括高特异性鼠抗人IgG抗体和/或美洲锥虫病感染阳性刺激物。
6.根据权利要求1所述的美洲锥虫病的检测试剂盒，其特征在于，所述美洲锥虫病的检测试剂盒还包括用于酶联免疫斑点法的显色试剂。
7.利用如权利要求1-6中任一项所述的美洲锥虫病的检测试剂盒对美洲锥虫病进行检测的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)用分离液分离待测样本，将分离好的细胞重悬于无血清培养基中；
(2)向重悬后的细胞中加入氨基酸序列为SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6所示的6条多肽进行共孵育，然后向共孵育的体系中加入高特异性鼠抗人IgG抗体进行抗原抗体反应；
(3)对抗原抗体反应后的体系进行洗涤，再加入显色底物进行显色反应，计数反应生成的斑点数。
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WO2022091531A1 (ja) * 2020-10-28 2022-05-05 国立大学法人北海道大学 抗腫瘍ペプチド及びその利用

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