KR101138343B1 - 알츠하이머 질병의 진단을 위한 신속한 시험법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 알츠하이머 질병, 또는 이러한 질병의 초기 단계 또는 이에 대한 소인을 진단하기 위한 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 유사분열 자극 전(a) 및 후(b)에, 말초적으로 접근가능한 세포, 예를 들어 표피 세포 또는 림프구의 유사분열로 발현가능한 표면 마커, 특히 CD69를 정량적으로 측정하는 것을 기초로 한다. 특정 자극 지수 a:b는 알츠하이머 질병, 또는 이러한 질병의 초기 단계 또는 이에 대한 소인을 지시하는 것이다. 본 발명은 또한 본 발명의 진단 방법을 수행하기 위해 적합한 키트에 관한 것이다.

Description

알츠하이머 질병의 진단을 위한 신속한 시험법 {QUICK TEST FOR THE DIAGNOSIS OF ALZHEIMER'S DISEASE}
본 발명은 알츠하이머 질병, 또는 이러한 질병의 초기 단계 또는 이에 대한 소인(predisposition)을 진단하는 방법에 관한 것으로, 이러한 방법은 유사분열 자극 전 (a) 및 후 (b)에 말초적으로 접근하기 용이한 세포, 예를 들어 표피 세포 또는 림프구의, 유사분열적으로 발현가능한 표면 마커, 바람직하게는 CD69를 정량하는 것을 기초로 한 것이며, 특정 자극 지수 a:b는 알츠하이머 질병, 또는 이러한 질병의 초기 단계 또는 이에 대한 소인의 징후(sign)이다. 또한, 본 발명은 본 발명에 따른 진단 방법을 수행하기에 적합한 키트에 관한 것이다.
알츠하이머 질병은 임상 수단 및 이용가능한 파라클리닉 방법(paraclinic method) 및 별도의 장치 및 기술을 기초로 하는 방법에 의해 궁극적인 확실성으로 진단될 수 없다. 이는 항상 부검 확인(autopsy verification)을 필요로 한다. 다른 치매 원인과 관련한 진단적 구분(diagnostic differentiation)은 특히 상기 질병의 초기 단계에서 흔히 어렵다. 그러나, 이러한 질병의 아주 초기 단계에서, 확실한 진단법은 두가지 이유에서 중요하다. 한편으로는, 이는 잠재적으로 치료가능한 치매 형태의 진단적 구분을 가능하게 하여 이를 효과적으로 치료할 수 있게 하며, 다른 한편으로는, 이는 알츠하이머 질병의 신경퇴행 과정에서 임의의 형태의 치료적 간섭(therapeutic intervention)을 위한 전제 조건으로서, 치료적 간섭은 이러한 질병의 초기 단계에서만 성공적일 수 있다. 이러한 진단상의 확실성은 단지 알츠하이머 질병의 바이오마커(biomarker)에 의해서, 즉 이러한 질병에 대한 충분한 특이성 및 감도를 갖는 용이하게 측정가능한 생물학적 변형체(biological changes)에 의해서 보장될 수 있다.
따라서, 알츠하이머 질병의 바이오마커는 진단적 가치를 지니고, 특히 임상전 단계 및 임상 초기 단계에서 위험군 및 환자를 안전하게 식별하는데 도움이 될 것이다. 바이오마커는 또한 후속 조치(follow-up)를 제공하여, 치료적 간섭에 대한 반응성을 예측하고 조절한다. 모델 바이오마커는 특정한 이론적 및 실제적 요건들을 따라야 한다. 이러한 것들은 특히 높은 특이성 및 감도, 임상전 단계를 식별하는 능력, 및 높은 양성 및 음성 예측도를 포함한다. 바이오마커는 가능한 한, 환자를 괴롭게 하거나 두렵게 하지 않게 비침습적 방법으로 측정되어야 한다. 분석은 저렴하고, 가능한한 주치의의 시술로 용이하게 수행되기에 적합하여야 한다. 불행하게도, 현재 알려진 어떠한 알츠하이머 질병의 바이오마커도 상술된 요건에 적합하지 않다. 특히, 공지된 바이오마커의 작은 감도 및 특이성으로 인해, 이들은 진단 수단으로서는 부적합하다. 보다 큰 감도 및 특이성을 갖는 다른 진단 시험법은 복잡한 기술적 전제 조건을 요구하여, 많은 환자 군에서 국소적으로 사용하기에 적합하지 않다.
따라서, 본 발명은 실질적으로, 적당한 감도 및 특이성을 가지면서 알츠하이머 질병을 진단하고, 임상전 질병 단계를 검출하고, 다른 치매로부터 알츠하이머 질병을 진단적으로 구분할 수 있는 알츠하이머 질병을 진단하기 위한 단순한 방법을 제공함에 있어서의 기술적 문제점을 기초로 한 것이다.
이러한 기술적 문제점은 청구범위에서 특징된 구체예를 제공함으로써 해결된다.
예를 들어, 면역자성(immunomagnetic) 세포 분리 후에 유사분열 자극되고 유사분열 자극되지 않은 말초적으로 접근가능한 환자 세포, 예를 들어 표피 세포 또는 혈액 림프구를 이용하여 유사분열 지수(활성 지수)를 결정함을 기초로 하는 진단 방법을 개발하는 것이 가능하였다. 이러한 세포의 활성화는 바람직하게는 항원-항체 상호작용을 이용하여 정량적으로 검출될 수 있는 활성 마커의 표면 표현(surface presentation)에 의해 달성되며, 바람직하게는 항체가 코팅된 자성 세포가 사용되는데, 이는 자성 세포 분리를 가능하고 하고 이후 유사분열 자극 전 및 후에 이러한 표면 마커를 지닌 세포의 수의 정량화를 가능하게 한다. 이러한 특성은 정상 소견(normal finding)으로부터의 질병-특이적 편차를 나타낸다. 이에 따라, 본 발명에 따른 방법은 알츠하이머 질병의 진단, 임상전 질병 단계의 검출 및 다른 치매로부터의 알츠하이머 질병의 진단적 구분을 가능하게 한다.
따라서, 본 발명은 환자의 샘플을 이용하여 알츠하이머 질병, 또는 이러한 질병의 초기 단계 또는 이에 대한 소인을 진단하는 방법에 관한 것으로, 이러한 방법은
(a) 샘플에서 말초적으로 접근하기 용이한 세포를 유사분열 자극시키는 단계;
(b) 유사분열 자극 후에 발현된 하나 이상의 표면 마커(surface marker)를 이용하여 단계 (a) 전 및 단계 (a) 후에 세포 집단내의 유사분열적으로 자극된 세포를 정량하는 단계로서, 여기서 표면 마커를 지닌 세포는 표면 마커에 대해 특이적인 항체를 이용하여 표면 마커를 지니지 않는 세포로부터 분리되는 단계; 및
(c) 단계 (a) 전 및 단계 (a) 후에, 표면 마커를 지니는 세포의 수의 관계로서 자극 지수를 결정하는 단계를 포함하며;
자극되지 않은 대조군 샘플의 10 배 내지 100 배에 달하는 자극 지수는 알츠하이머 질병, 또는 이러한 질병의 초기 단계 또는 이에 대한 소인의 징후인 방법에 관한 것이다.
당업자에게는 본 발명에 따른 방법에 적합한, 유사분열적으로 자극가능한 세포를 충분히 함유한 환자의 샘플을 수득하기 위해 제공되는 적합한 측정법이 공지되어 있다. 예를 들어, 적합한 샘플은 피부 조직 샘플, 혈액 샘플, 바람직하게는 정맥 혈액으로부터의 혈액 샘플, 뇌척수액으로부터의 세포, 및 소변으로부터의 세포이다.
본 발명에 따른 진단 방법의 바람직한 구체예에서, 예를 들어 혈액 샘플이 사용되는 경우, 다른 방법의 단계 전에 안정화시킬 목적으로 항응고 화합물, 예를 들어 소듐 시트레이트 또는 헤파린이 첨가된다.
본원에서 사용되는 용어 "알츠하이머 질병의 진단"은 또한 후속 조치를 포함하여, 이에 따라 진단, 치료적 간섭 효능의 조절, 및 다른 치매로부터 본 질병의 진단적 구분을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "말초적으로 접근가능한 세포(peripherally accessible cell)"는 인간 유기체로부터 수술 없이 또는 (최소한의) 침습적 방법으로 제거될 수 있는 세포를 칭하는 것으로서, 이들은 예를 들어 표피 세포 및 말초 혈액의 림프구를 포함하며, 본 발명에 따른 방법에 대해 말초 혈액의 림프구가 바람직하다.
표면 마커의 발현을 얻기 위한 유사분열 자극은 공지된 자극제, 예를 들어 피토헤마글루티닌(PHA), 단백질 A, PWM, 또는 영양 또는 유사분열 효과(tropic or mitogenic effect)를 갖는 기타 화합물에 의해 달성될 수 있다.
당업자에게는 예를 들어, 사용되는 유사분열 물질의 농도, 자극 시간 및 기타 인큐베이션 조건과 관련한 이러한 자극에 대한 적합한 실험 조건이 공지되어 있다. 자극은 적절한 가스 교환이 가능한 적합한 용기에서 수행된다. 개개의 자극 제제의 농도는 생리학적 범위 내이어야 하며, PHA에 대해 1 ㎍/ml 내지 20 ㎍/ml, PWM에 대해 1 ㎍/ml 내지 50 ㎍/ml, 단백질 A에 대해 10 ㎍/ml 내지 200 ㎍/ml이다. 자극 시간은 시험되는 분자의 발현 속도에 의존적이다. 그러나, 특정 시험에 대해서는 2 내지 24 시간의 자극 시간이 필수적일 수 있다. CD69의 경우에서, 최적의 자극 시간은 4 시간이다. 자극은 생리학적 조건하에서 수행되어야 하며, 예를 들어, 37℃ 및 5% CO2로 채워진 인큐베이터에서 수행될 수 있다.
당업자에게는 또한 그 자체로 유사분열 자극을 나타내는 적합한 표면 마커, 예를 들어 CD69, CD25, CD45RO, CD63 및 HLA-Dr이 공지되어 있으며, 바람직한 표면 마커는 CD69이다. 본 발명의 목적을 위하여, 표면 마커의 조합, 또는 추가 서브집단과 관련하여, 특정 표면 마커, 예를 들어 CD69에 의해, 예를 들어, (예를 들어, CD4+ 및/또는 CD8+ 및/또는 CD19+ 및/또는 CD56+) 서브집단에 의해 분리된 추가 사양을 측정할 수 있다.
자극 지수(활성 지수)는 자극 전 및 후에 표면 마커를 지닌 세포의 수의 관계로부터 뒤따른다. 자극되지 않은 대조군 샘플의 10 배 내지 100 배에 달하는 자극 지수는 알츠하이머 질병, 또는 이러한 질병의 초기 단계 또는 이에 대한 소인의 징후이다. 자극되지 않은 대조군 샘플의 10 배 미만의 자극 지수는 알츠하이머 질병 또는 이러한 질병의 초기 단계 또는 이에 대한 소인의 징후가 없는 것이다. 표면 마커를 지닌 세포는 통상적인 방법, 예를 들어 웨스턴 블롯, ELISA, RIA, FACS, LSC 등에 따라 측정될 수 있다.
표면 마커를 지닌 세포를 측정하기 위하여, 이들은 바람직하게는 특징적인 세포 특성을 이용하여 표면 마커를 지니지 않거나 다른 표면 마커를 지닌 세포로부터 분리된다.
본 발명의 진단 방법에서, 표면 마커를 지닌 세포는 요망되는 표면 마커에 대해 특이적인 항체에 의해 표면 마커를 지니지 않는 세포로부터 분리된다. 이러한 목적에 적합한 항체는 모노클론, 폴리클론 또는 합성 항체 또는 이들의 분절일 수 있다. 이와 관련하여, 용어 "분절"은 완전한 항체의 것과 동일한 에피토프 특이성을 갖는 모노클론 항체의 모든 부분(예를 들어, Fab, Fv 또는 단일 사슬 Fv 분절)을 의미한다. 이러한 분절의 생산은 당업자에게 공지되어 있으며, 또한 표면 마커에 대해 특이적인 많은 항체는 상업적으로 입수가능하다.
본 발명에 따른 진단 방법의 가장 바람직한 구체예에서, 표면 마커에 특이적인 항체는 자성 입자, 예를 들어 상자성 비드 (예를 들어, DYNAL A.S.(P.O.Box 158 SkΦyen, N-0212 Oslo, Norway)로부터 입수가능함)에 결합되며, 이는 현존하는 방법에 따라 면역자성 분리에 의해 상응하는 표면 마커를 갖는 세포를 분리시킬 수 있다.
이후, 자극 지수는 현존하는 방법을 이용하여, 핵산 함량 및/또는 단백질 함량을 기초로 하여 요망되는 표면 마커에 의해 분리된 세포의 양을 결정함으로써, 예를 들어 세포의 용해 후에 핵산 또는 단백질 함량을 분광학적으로 측정함으로써, 또는 특정 염료, 예를 들어 에티듐 브로마이드, 프로피듐 요오드, 아크리딘 오렌지, DAPI 등을 이용하여 핵산을 착색시킨 후에 광학적 정량화를 이용함으로써 특정될 수 있다. 세포 수는 보정 곡선을 이용하여 샘플 중의 단백질 및/또는 핵산 함량으로부터 계산될 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 진단 방법을 수행하기에 적합하고 적어도 하기 성분을 함유하는 키트에 관한 것이다:
(a) 유사분열 자극용 화합물;
(b) 유사분열 자극 후에 발현된 표면 마커에 대해 특이적인 하나 이상의 항체, 바람직하게는 자성 입자에 결합된 하나 이상의 항체.
또한, 본 발명에 따른 키트는 바람직하게는 하기 성분을 함유한다:
(a) 하나 이상의 반응 용기;
(b) 항응고 화합물 및/또는 세포 용해용 완충액;
(c) 세포 고정용 완충액;
(d) DNA 및/또는 단백질 농도의 정량화를 위해 요망되는 물질 및 보정 곡선을 제작하기 위한 이미 제조된 용액;
(e) 자성 입자에 결합된 세포를 분리하기 위한 자석(자성 입자에 결합된 항체가 사용되는 경우 포함됨) ; 및
(f) 결합된 자성 입자를 제거하기 위한 시약(자성 입자에 결합된 항체가 사용되는 경우 포함됨) .
본 발명에 따른 키트의 바람직한 구체예에서, 항체는 항-CD69 항체이다. 또한, 키트는 항-CD4 및/또는 항-CD8 항체를 추가적으로 함유하거나, 이를 항-CD69 항체 대신에 함유시킬 수 있다.
마지막으로, 본 발명에 따른 키트는 적절한 경우, 하나 이상의 적합한 추가 검출 시약, 예를 들어, 형광-커플링된 1차 항체, 2차 항체, 단백질 및/또는 핵산을 위한 검출 시약, 예를 들어 인터칼레이팅(intercalating) 염료 등과 조합하여 존재할 수 있다.
알츠하이머 질병에 걸린 환자에게서 CD69를 이용한 유사분열 자극 지수의 결정
최근까지 알려진 생존 환자(바이오마커)에게서 수행될 수 있는 알츠하이머 질병의 특징 결정법은 충분치 않은 감도 및 특이성을 나타내거나 비용 또는 매우 복잡한 시험 배치의 이유로 매우 많은 케이스의 검사에 대해 적합하지 않다. 임상적 의미로, 진단 확실성은 단지 80% 내지 90%이며, 진단적 구분에 관하여 질병의 초기 단계에서 특히 어렵다. 질병 전임상 단계의 검출은 일반적으로 적합한 바이오마커의 부족으로 가능하지 않다.
신경퇴행성 변화는 알츠하이머 질병의 경우에 영양 및 유사분열 신호의 세포내 조정의 불안한 공정을 기초로 한 것이다. 이러한 세포간 신호 변환의 기능장애는 신경계에 제한되지 않는다. 이러한 것은 또한 이러한 환자들의 표피 세포 및 말초 혈액의 림프구에서 유사하게 발견될 수 있다. 이러한 질병 특이성으로 인해, 이러한 변화(alteration)는 진단적 가치를 지니며, 바이오마커로서 적합하다.
하기 실시예에서, 통상적으로 알츠하이머 질병에서의 영양 및 유사분열 신호(tropic and mitogenic signal)의 세포내 조정의 기능장애가 존재하는 지의 여부에 대한 의문은 유사분열 자극 전 및 후에 림프구에 존재하는 CD69의 면역자성 세포 분리에 의해 결정되었다.
혈액을 사르스테트(SARSTEDT)사의 체혈 시스템을 이용하여 정맥 천자로 수집하였다. 혈액을 체혈 동안 체혈 시스템에 통합된 항응집제, 예를 들어 소듐 시트레이트 또는 소듐 헤파린으로 고정시켰다. 이러한 형태로, 실온에서 24 시간 내지 48 시간 동안 저장시킬 수 있다. 공기가 잘 통할 수 있는 반응 용기, 예를 들어 그래이너 바이오-원(Greiner bio-one)사의 24 웰 현탁액 배양판에서 자극 실험을 수행하였다. 이를 위해, 미토겐(mitogen) 피토헤마글루티닌(PHA), 단백질 A 및 포우크위드(pokeweed) 미토겐(PWM)을 400 ㎕의 고정된 전혈에 대해 각각 개별적으로 또는 상이한 조합으로 사용하였다. 개개의 미토겐의 최종 농도는 생리학적 범위내였으며, 본 실시예에서 PHA에 대해 12 ㎍/㎖, 단백질 A에 대해 50 ㎍/㎖ 및 PWM에 대해 4 ㎍/㎖이었다. 생리학적 조건하에서 37℃ 및 5% CO2 농도로 가스가 주입된 인큐베이터에서 4 시간 동안 자극을 수행하였다. 100 ㎕의 개개의 자극된 전혈을 자성 입자로 코팅된 상이한 항체와 함께 인큐베이션하였다. 본 실시예에서, 디날(DYNAL)사의 자성 입자로 코팅된 항-CD8 및 항-CD4를 사용하였다. 상응하는 림프구 서브집단을 완전하게 분리하기 위해, 상응하는 자성 입자를 과량(10 ㎕ 자성 입자 현탁액)으로 특정 샘플에 첨가하였다. 4℃에서 30 분 동안 인큐베이션한 후에, 상응하는 림프구 서브집단을 자성으로 분리하고, 후속의 세척 단계 후에 1% 송아지 혈청(FCS)과 혼합된, 100 ㎕의 규정된 배지, 본 실시예에서, RPMI1640으로 바꾸었다. 본 실시예에서 결합된 자성 입자를 각각 디날사의 10㎕의 DETACHaBEAD를 이용하여 제거하였다. 실온에서 45 분 동안 인큐베이션한 후에, 제거된 자성 입자를 분리하고, 여러번의 세척 단계 후에 세포 현탁액을 규정된 배지, 본 실시예에서 RPMI1640에서 처리하였다. 특정 용해 완충액을 첨가하여, 세포를 깨뜨리고, DNA를 특정 DNA 염료, 예를 들어, 에티듐 브로마이드, 프로피듐 아오다이드(iodide), 아크리딘 오렌지 또는 DAPI로 표지한 후 광학적으로 정량하였다. 샘플 중 단백질 함량을 브래드포드(Bradford)에 따른 단백질 결정 방법을 이용하여 비교하였다. 세포 수를 검정 곡선을 이용하여 샘플 중 DNA 및/또는 단백질 함량으로부터 계산하였다. 이러한 과정은 세포 수에 대한 직접적인 결정을 가능하게 하였다. 유사분열 자극 전 및 후에 세포에 존재하는 CD69의 수로부터의 지수(자극 지수) 계산은 이러한 세포들의 유사분열 자극능력(mitogenic stimulability)의 변경에 대한 정보를 제공하였다.
자극되지 않은 대조군 샘플의 적어도 10 배, 최대 100 배에 달하는 자극 지수는 알츠하이머 질병, 또는 이러한 질병의 초기 단계 또는 이에 대한 소인의 징후이다. 자극되지 않은 대조군 샘플의 10 배 미만의 자극 지수는 알츠하이머 질병, 또는 이러한 질병의 초기 단계 또는 이에 대한 소인의 징후가 아니다.
다른 실험에서, 샘플의 단백질 함량을 측정하였으며, 세포에 존재하는 CD69의 정량화를 위한 DNA-염색 물질의 첨가 없이, DNA 함량을 측정하였다. 이러한 경우에, DNA 또는 단백질에 의한 특정 파장(예를 들어, 260 nm 또는 280 nm)을 갖는 광의 흡수를 측정하였다.

Claims (13)

  1. 환자 혈액 샘플을 이용하여 알츠하이머 질병을 진단하는 시험관내(in-vitro) 방법으로서,
    (a) 혈액 샘플에서 말초적으로 접근하기 용이한 림프구(peripherally accessible lymphocyte)를 유사분열 자극시키는(mitogenic stimulation) 단계;
    (b) 유사분열 자극 후에 발현된 CD69 표면 마커를 이용하여 단계 (a) 전 및 단계 (a) 후에 세포 집단 내에서 유사분열 자극된 림프구를 정량하는 단계로서, 여기서 CD69 표면 마커를 지닌 림프구는 면역자성 분리(immunomagnetic separation)에 의해 자성 입자에 결합된 항-CD69 항체를 이용하여 CD69 표면 마커를 지니지 않은 림프구로부터 분리되는 단계; 및
    (c) 단계 (a) 전 및 단계 (a) 후에, CD69 표면 마커를 지닌 림프구의 수의 관계로서 자극 지수(stimulation index)를 결정하는 단계를 포함하며;
    자극되지 않은 대조군 샘플의 10 배 이상, 최대 100 배에 달하는 자극 지수가 알츠하이머 질병의 징후(sign)인 시험관내 방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제 1항에 있어서, CD69+ 세포가 CD4+ 또는 CD8+ 서브집단과 관련하여 추가로 특정되는 방법.
  5. 제 1항에 있어서, 혈액이 단계 (a) 전에 하나 이상의 항응고 화합물에 의해 안정화되는 방법.
  6. 제 1항에 있어서, 림프구가 PHA, 단백질 A 또는 PWM에 의해 자극되는 방법.
  7. 삭제
  8. 제 1항에 있어서, 자극 지수가 단계 (a) 전 및 단계 (a) 후에, 표면 마커를 지니는 세포 중의 단백질 함량 또는 핵산 함량을 측정함으로써 결정되는 방법.
  9. 알츠하이머 질병을 진단하기 위한 키트로서,
    (a) 유사분열 자극용 화합물; 및
    (b) 자성 입자에 결합된 하나 이상의 항-CD63 항체를 함유하는 키트.
  10. 제 9항에 있어서, (c) 항응고 화합물; 및 (d) 세포 용해용 완충액을 추가로 함유하는 키트.
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 제 9항에 있어서, 항-CD4 또는 항-CD8 항체를 추가로 함유하는 키트.
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