KR20130052923A - 나노 물질에 의한 세포 독성 검출용 조성물, 키트 및 나노물질에 의한 세포 독성 검출방법 - Google Patents

나노 물질에 의한 세포 독성 검출용 조성물, 키트 및 나노물질에 의한 세포 독성 검출방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 나노물질에 의한 세포 독성에 특이적인 검출 마커에 대한 것으로, 나노물질에 의한 세포 독성 존재시 특이적으로 과발현되는 ERK 유전자, 그에 의해 활성화되는 Egr-1 유전자, 그 mRNA 또는 이의 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 나노물질에 의한 세포 독성 검출용 조성물, 키트 및 이를 이용하여 나노 물질에 의한 세포 독성을 검출하는 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 조성물, 키트 및 검출방법은 나노 물질의 세포 등에 포함된 나노물질에 의한 세포 독성을 간단하고 정확하게 검출할 수 있다.

Description

나노 물질에 의한 세포 독성 검출용 조성물, 키트 및 나노물질에 의한 세포 독성 검출방법{A COMPOSITION, KIT AND METHOD FOR DETECTING TOXICITY BY NANOMATERIALS}
본 발명은 생물학적 시료의 나노 물질에 의한 세포 독성 검출용 조성물, 키트 및 검출방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 생물학적 시료에 포함된 나노 물질에 의한 세포 독성을 빠른 시간 내에 간단하게 검출할 수 있는 방법에 관한 것이다.
나노 물질은 최근 들어 그 효용성으로 인하여 사회적으로 과학적으로 많은 이슈가 되고 있다. 세탁기나 세제 등에 은 나노 물질이 첨가되는 것과 같이, 실제 많은 상품들에 나노 물질이 응용되고 있으며, 그 중 형광발산(Fluorescence Emission) 값을 가지는 나노 물질은 의학계에서 새로운 진단 기술로 연구가 활발히 진행되고 있다. 그러나, 나노 물질이 정말 안전한가 하는 물음을 가지기 시작하면서 사회적으로도 나노 물질이 들어간 상품들의 사용권한을 두고 문제가 계속적으로 생기자 나노 물질 독성의 연구가 진행되어 왔다. 그러나, 그 연구 수준이 매우 미비한 상태이며, 특히 나노 물질의 독성을 평가할 수 있는 기준이 없어 더욱 문제가 커지고 있다.
따라서, 나노 물질의 독성을 평가하는 방법으로 세포를 이용한 실험적 방법으로 세포 노출된 나노 물질의 독성에 따른 단백질 및 RNA를 조사하여 단시간 내에 보다 간단하고, 보다 정확하게 측정할 수 있는 방법의 개발이 요구되고 있다.
대한민국 특허 KR 2009-0003356 대한민국 특허 KR 2008-0094939
전술한 종래 기술의 문제를 해결하기 위하여, 본 발명은 세포 내 나노 물질에 의한 세포 독성을 간단하고 정확하게 검출할 수 있는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 나노물질 존재 시 특이적으로 과발현되는 ERK 유전자, 그에 의해 활성화되는 Egr-1 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 나노물질에 의한 세포 독성 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 단백질의 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다.
본 발명은 상기 조성물을 포함하는 나노물질에 의한 세포 독성 검출용 키트 를 제공한다.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트 또는 단백질 칩 키트일 수 있다.
또한, 본 발명은 생체 외(ex vivo)에서 생물학적 시료의 ERK 유전자 또는 ERK에 의해 활성화되는 Egr-1 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준을 측정하는 단계; 및
상기 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준을 정상 대조구 시료의 해당 유전자의 발현 수준 또는 단백질 수준과 비교하는 단계를 포함하는 나노물질에 의한 세포 독성 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 유전자의 발현 수준은 상기 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 것일 수 있다. 예컨대, 상기 상기 mRNA 수준을 측정하는 방법은 역전사효소 중합효소반응, 경쟁적 역전사효소 중합효소반응, 실시간 역전사효소 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅 또는 DNA 칩에 의한 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 단백질 수준을 측정하기 위한 방법은 항체를 이용한 방법, 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS 또는 단백질 칩 방법 중 어느 하나를 이용하는 것일 수 있다.
본 발명은 나노 물질에 의한 독성을 간단하고 정확하게 검출할 수 있는 장점이 있다.
도 1은 ZnO를 농도별 (dose-dependent)로 처리한 세포의 흡광도 측정결과를 나타낸 도이다. 가로축은 농도(Concentration)을 나타내며, 세로축은 세포생존도 (Cell Viability )를 나타낸다.
도 2는 ZnO를 처리한 세포에서의, 시간에 따른 Egr-1, p-ERK, ERK 및 b-actin 단백질 band를 나타낸 도이다.
도 3은 ZnO를 처리한 세포에서의 Egr-1의 발현량을 시간대별로 나타낸 도이다.
도 4는 ZnO를 처리한 세포에서의 P-ERK의 발현량을 시간대별로 나타낸 도이다.
도 5는 ZnO(-)와 MAPK 억제제를 동시에 처리한 경우 Egr-1의 시간대별 단백질 band를 나타낸 도이다.
도 6는 ZnO(+)와 MAPK 억제제를 동시에 처리한 경우 Egr-1와 B-actin의 시간대별 단백질 band를 나타낸 도이다.
도 7은 ZnO(+)와 MAPK 억제제를 동시에 처리한 세포에서의, Egr-1의 발현량을 나타낸 도이다.
도 8은 ZnO(-)와 MAPK 억제제를 동시에 처리한 세포에서의, Egr-1의 발현량을 나타낸 도이다.
이하에서 본 발명에 대하여 상세히 설명한다.
본 발명은 ERK 유전자 또는 ERK에 의해 활성화되는 Egr-1 유전자의 나노물질에 의한 세포 독성 검출 마커에 대한 것이다.
본 발명에서, "검출"은 본 발명의 목적상, 검출은 시료에 나노물질에 의한 세포 독성이 있는지 여부를 확인하는 것이다.
본 발명에서,"나노 물질"은 나노 스케일인 재료의 총칭으로 3차원적으로 볼 때 적어도 한 변의 길이가 100나노미터 이하 크기의 물질을 의미한다. 구체적으로, ZnO, TiO2 , Gold nanoparticle, Silver nanoparticle, Quantum Dots, Polystylene, nano silica 등 일 수 있으며, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에서 "검출용 마커, 검출하기 위한 마커 또는 검출마커"란 '나노물질에 의한 세포 독성이 있는 세포'를 '세포 독성이 없는 세포'와 구분할 수 있는 물질로, 나노물질에 의한 세포 독성을 나타내는 세포에서 증가양상을 보이는 폴리펩타이드 또는 핵산(예: mRNA 등), 지질 , 당지질, 당단백질, 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다. 본 발명의 목적상, 나노물질 검출 마커는 ERK 유전자 또는 ERK에 의해 활성화되는 Egr-1 유전자로, 나노물질 존재시 발현이 증가하는 유전자들이다.
구체적으로, 본 발명은 나노물질에 의한 세포 독성이 있을 경우 특이적으로 ERK 유전자 또는 ERK에 의해 활성화되는 Egr-1 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 나노물질 검출용 조성물에 대한 것이다.
본 발명에서 "mRNA 발현수준 측정"이란 나노물질을 검출하기 위하여 생물학적 시료에서 나노물질 마커 유전자들의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로 mRNA의 양을 측정한다. 이를 위한 분석 방법으로는 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(RealtimeRT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting), DNA 칩 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서 "단백질 발현수준 측정"이란 나노물질에 의한 세포 독성을 검출하기 위하여 생물학적 시료에서 나노물질 마커 유전자로부터 발현된 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 바람직하게는, 상기 유전자의 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인할 수 있다. 이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블랏 등을 사용할 수 있다.
본 발명에서, "항체"란 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 마커 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다.
상기한 바와 같이 나노물질 마커 단백질이 규명되었으므로, 이를 이용하여 항체를 생성하는 것은 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다.
다클론 항체는 상기한 나노물질 마커 단백질 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조 가능하다.
단클론 항체는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법(hybridoma method)(Kohler 및 Milstein (1976)European Jounral of Immunology 6:511-519 참조), 또는 파지 항체 라이브러리(Clackson et al, Nature,352:624-628, 1991; Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 상기 방법으로 제조된 항체는 겔 전지영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 분리, 정제할 수 있다.
또한 본 발명의 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 나노물질에 의한 세포 독성 검출용 키트에 대한 것이며, 상기 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트 또는 단백질 칩 키트일 수 있다.
바람직하게, 상기 나노물질에 의한 세포 독성 검출 키트는 분석방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함하여 구성될 수 있다.
상기 진단 키트는 독성 검출에 이용되는 일반적인 키트 일 수 있으며, 역전사 중합효소반응을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 나노물질 검출용 조성물 또는 상기 나노물질에 의한 세포 독성 검출키트를 이용한 나노물질에 의한 세포 독성 검출방법을 제공한다.
구체적인 일 양태로써, 본 발명은 생체 외(ex vivo) 또는 생체 내(in vivo)에서 생물학적 시료의 ERK 유전자 또는 ERK에 의해 활성화되는 Egr-1 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준을 측정하는 단계; 및
상기 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준을 정상 대조구 시료의 해당 유전자의 발현 수준 또는 단백질 수준과 비교하는 단계를 포함하는 나노물질에 의한 세포 독성 검출 방법에 대한 것이다.
본 발명에서 용어 "생물학적 시료"란 나노물질에 의해 나노물질 마커의 유전자 발현 수준이 차이나는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
mRNA 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로는 역전사효소 중합효소반응, 경쟁적 역전사효소 중합효소반응, 실시간 역전사효소 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅, DNA 칩 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.
상기 검출 방법들을 통하여, 정상 대조군에서의 mRNA 발현량과 검출대상 시료의 mRNA 발현량을 비교할 수 있고, 나노물질 마커 유전자에서 mRNA로의 유의한 발현량의 증가여부를 판단하여 나노물질에 의한 세포 독성을 검출 수 있다.
mRNA 발현수준 측정은 바람직하게는, 나노물질 마커로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머를 이용하는 역전사효소 중합효소반응법 또는 DNA 칩을 이용하는 것이다.
상기의 역전사효소 중합효소반응은 반응 후 전기영동하여 밴드 패턴과 밴드의 두께를 확인함으로써 나노물질 검출 마커로 사용되는 유전자의 mRNA 발현 여부와 정도를 확인 가능하고 이를 대조군과 비교함으로써, 시료에 포함된 나노물질이 정상수준 이상인지 간편하게 확인할 수 있다.
한편, DNA 칩은 상기 나노물질 진단 유전자 또는 그 단편에 해당하는 핵산이 유리 같은 기판에 고밀도로 부착되어 있는 DNA 칩을 이용하는 것으로서, 시료에서 mRNA를 분리하고, 그 말단 또는 내부를 형광 물질로 표지된 cDNA 프로브를 조제하여, DNA 칩에 혼성화시킨 다음 시료에 포함된 나노물질에 의한 세포 독성이 있는지 여부를 판독할 수 있다.
생물학적 시료에서 단백질을 분리하는 과정은 공지의 공정을 이용하여 수행할 수 있으며 단백질 수준은 다양한 방법으로 측정할 수 있다.
상기 단백질 수준을 측정하기 위한 방법은 항체를 이용한 방법, 웨스턴 블랏, 방사선면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS 또는 단백질 칩 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 나노물질 마커에 대한 하나 이상의 항체를 이용한 웨스턴 블랏을 이용할 수 있다. 시료에서 전체 단백질을 분리하고, 이를 전기영동하여 단백질을 크기에 따라 분리한 다음, 니트로셀루로즈 막으로 이동시켜 항체와 반응시킨다. 생성된 항원-항체 복합체의 양을 표지된 항체를 이용하여 확인하는 방법으로 유전자의 발현에 의해 생성된 단백질의 양을 확인하여, 나노물질을 확인할 수 있다. 상기 검출 방법은 대조군에서의 마커 유전자의 발현량과 나노물질이 과량 포함된 세포에서의 마커 유전자의 발현량을 조사하는 방법으로 이루어진다. mRNA 또는 단백질 수준은 상기한 마커 단백질의 절대적(예: /) 또는 상대적(예: 시그널의 상대강도) 차이로 나타낼 수 있다.
또한, 바람직하게는, 상기 나노물질 마커에 대한 하나 이상의 항체를 이용한 면역조직 염색을 실시하는 것이다.
정상 조직 및 나노물질이 과량 함유되어 있을 것으로 의심되는 조직을 채취 및 고정한 후, 당업계에서 널리 공지된 방법으로 파라핀 포매 블록을 제조한다. 이들을 수 um 두께의 절편으로 만들어 유리 슬라이드에 붙인 후, 이와 상기의 항체 중 선택된 1개와 공지의 방법에 의하여 반응시킨다. 이후, 반응하지 못한 항체는 세척하고, 상기에 언급한 검출 라벨 중의 하나로 표지하여 현미경 상에서 항체의 표지 여부를 판독한다.
또한, 바람직하게는, 상기 나노물질 마커에 대한 하나 이상의 항체가 기판 위의 정해진 위치에 배열되어 고밀도로 고정화되어 있는 단백질 칩을 이용하는 것이다. 단백질 칩을 이용하여 시료를 분석하는 방법은, 시료에서 단백질을 분리하고, 분리한 단백질을 단백질 칩과 혼성화시켜서 항원-항체 복합체를 형성시키고, 이를 판독하여, 단백질의 존재 또는 발현 정도를 확인하여, 시료에 나노물질 과량 함유 여부를 확인할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하기로 하지만, 하기 실시예가 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니며, 이는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것으로 해석되어야 할 것이다.
실시예 1. 세포독성측정실험 ( cell viability assay )
Human Keratinocyte (HaCaT) 세포를 96well culture plate에 1X103cell/100ul의 농도로 준비하고, 10% FBS 및 1% penicillin/streptomycin가 첨가된 DMEM 배지를 100ul 첨가한 후, CO2배양기(incubator)에서 24시간 동안 배양한 후, ZnO를 농도별 (dose-dependent)로 처리하였다. 그 후, MTT 용액 CCK-8(Dojindo 회사 제품)을 각 well에 10ul씩 첨가하고, 4시간 동안 CO2배양기(incubator)에서 배양한 후, ZnO가 흡광도 측정 시에 측정을 방해하는 것을 감안하여 새로운 96well plate로 조심스럽게 옮긴 후, microplate reader기를 이용하여 450nm 파장 값으로 흡광도를 측정하였다. 흡광도 측정 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1을 참고하면, ZnO가 세포에게 있어 독성을 발현하는 것임을 알 수 있다.
실시예 2. 웨스턴 블랏법 ( western blot assay )
HaCaT 세포를 60X15 mm cell culture dish에 분주한 후, 10% FBS 및 1% penicillin/streptomycin (P/S)를 첨가한 DMEM 배지를 처리한 후, CO2배양기(incubator)에서 24시간 배양하였다. 그 후, FBS와 P/S가 들어있지 않은 DMEM배지(hyclone 회사제품) 를 2ml 첨가한 후, 18시간 동안 CO2배양기(incubator)에서 배양하였다. 이 후, ZnO를 20ug/ml의 농도로 처리하고 시간대별 (time-dependent; 0, 5, 15, 60, 120, 240 분)로 plate 내의 배지를 제거하고 4 1x PBS 1ml을 처리한 후 scrapper를 이용하여 plate 내의 세포를 긁어내어 1.5 ml tube에 옮긴 후, 원심분리(centrifuge)하여 상층액은 버리고 알갱이(pellet)만 모았다. 시간대 별로 모은 세포 알갱이(pellet)에 RIPA cell lysis buffer를 알갱이(pellet) 양에 맞추어 처리를 하고, ice에 10분간 3번씩 voltexing을 한 후 14000rpm에서 30분간 원심분리(centrifuge)하였다. 이때 수득한 상층액을 다른 1.5 ml tube에 옮기고 BCA 정량법(gendepot 회사제품)을 이용하여 정량하였다.
정량된 샘플은 정량값에 맞추어 동일한 양의 샘플이 되도록 다시 다른 1.5 ml tube로 만들고, 총량이 동일하도록(total 1X) 로딩버퍼(5X loading buffer)를 첨가한 후, 각 샘플을 95에서 5분간 배양(incubation)하였다. 이 후, 단백질 분리를 위한 비스아크릴아미드 겔(bisacrylamide gel)에 상기 샘플을 각각 27 ug씩 로딩(loading)하고, 전기영동 (electrophoresis) 하였다. (Bio-rad 회사제품)
전기영동이 끝난 상기 샘플을 PVDF membrane(bio-rad 회사제품)에 투과 시키고(transfer), 탈지유(skim-milk;non-fat 5%) 및 TBST가 1:1의 중량비로 혼합된 혼합물에 20분간 blocking을 하였다. Blocking이 끝난 후, Egr-1, β-actin primary antibody (sigma 제품), p-ERK, ERK primary antibody (cell signaling 제품)를 각각 2000:1로 탈지유(skim-milk;non-fat 5%) 및 TBST가 1:1의 중량비로 혼합된 혼합물에 넣고, 4에서 overnight 시켰다. 다음날 1x TBST 에 5분간 3번씩 세척(washing)을 하고, Egr-1, p-ERK, ERK는 2000:1 rabbit secondary antibody를 β-actin은 2000:1 mouse secondary antibody를 탈지유(skim-milk;non-fat 5%) 및 TBST가 1:1의 중량비로 혼합된 혼합물에서 1시간 동안 배양(incubation)한 후 10분간 3번씩 세척(washing) 하고, film을 이용하여 각각의 단백질 band를 얻었다. Egr-1, p-ERK, ERK 및 b-actin에 대한 시간대별 단백질 band를 도 2에 나타내었다. 또한, 도 3 및 도 4에 Egr-1의 발현량 및 P-ERK의 시간대별 발현량을 각각 나타내었다.
도 2 내지 도 4를 참고하면, 20nm ZnO를 처리한 경우, Egr-1 단백질 및 ERK 단백질의 발현이 시간대별로 증가하는 것을 확인할 수 있다. 따라서, 나노물질에 의한 세포 독성 검출의 스크린 단백질로 Egr-1 또는 ERK이 유용함을 확인하였다.
실시예 3. MAPK 억제제 분석 ( MAPK inhibitor assay )
ZnO를 처리하기 30분 전에 MAPK(mitogen-activated proteinkinase) 억제제 (U0126: ERK inhibitor, SB600125: p38 inhibitor, SP239063: JNK inhibitor- sigma 제품)를 먼저 처리하고, ZnO를 처리한 후 30분 후 다시 새로운 FBS와 P/S가 들어있지 않은 DMEM배지를 2ml 처리하고, ZnO를 처리한 후 2시간 후에 배지를 제거하고, 1x PBS를 1ml 처리하여 scrapper를 이용하여 긁어낸 후 1.5ml tube에 옮긴 것을 제외하고, 실시예 2와 같은 방법으로 western blot assay를 시행하였다.
ZnO와 MAPK 억제제의 동시 처리에 따른 Egr-1 및 b-actin의 시간대별 단백질 band를 도 5 및 도 6에 나타내었다. 또한, ZnO와 MAPK 억제제의 동시 처리에 따른 Egr-1의 발현량을 도 7 및 도 8에 나타내었다.
도 5 내지 도 8을 참고하면, ERK 억제제인 U0126을 처리한 군의 Egr-1 단백질 발현이 현저히 감소하는 것을 확인할 수 있다. 따라서, 스크린 단백질인 Egr-1 발현 증가는 ERK 시그널에 의한 것임을 알 수 있다.

Claims (8)

  1. ERK 유전자 또는 ERK에 의해 활성화되는 Egr-1 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 나노물질에 의한 세포 독성 검출용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 단백질의 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적인 항체를 포함하는 것인 나노물질에 의한 세포 독성 검출용 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항의 조성물을 포함하는 나노물질에 의한 세포 독성 검출용 키트.
  4. 청구항 3에 있어서,
    RT-PCR 키트, DNA 칩 키트 또는 단백질 칩 키트인 것을 특징으로 하는 나노물질에 의한 세포 독성 검출용 키트.
  5. 생체 외(ex vivo)에서 세포 내 ERK 유전자 또는 ERK에 의해 활성화되는 Egr-1 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준을 측정하는 단계; 및
    상기 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준을 정상 대조구 시료의 해당 유전자의 발현 수준 또는 단백질 수준과 비교하는 단계를 포함하는 세포 내 나노물질에 의한 세포 독성 검출 방법.
  6. 청구항 5에 있어서,
    상기 유전자의 발현 수준은 상기 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 것인 세포 내 나노물질에 의한 세포 독성 검출 방법.
  7. 청구항 6에 있어서,
    상기 mRNA 수준을 측정하는 방법은 역전사효소 중합효소반응, 경쟁적 역전사효소 중합효소반응, 실시간 역전사효소 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅 또는 DNA 칩에 의한 것인 세포 내 나노물질에 의한 세포 독성 검출 방법.
  8. 청구항 5에 있어서,
    상기 단백질 수준을 측정하기 위한 방법은 항체를 이용한 방법, 웨스턴 블랏, 방사선면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS 또는 단백질 칩 방법 중 어느 하나를 이용하는 것인 세포 내 나노물질에 의한 세포 독성 검출 방법.
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