CN108593930A - 一种刚地弓形虫的检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种刚地弓形虫的检测试剂盒及其检测方法。该试剂盒包括氨基酸序列为SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6所示的6条多肽。该检测方法包括步骤：(1)用分离液分离待测样本，将分离好的细胞重悬于无血清培养基中；(2)向重悬后的细胞中加入氨基酸序列为SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6所示的6条多肽进行共孵育，然后向共孵育的体系中加入高特异性鼠抗人IgG抗体进行抗原抗体反应；(3)对抗原抗体反应后的体系进行洗涤，再加入显色底物进行显色反应，计数反应生成的斑点数。本发明的试剂盒能够人工全序列合成，生产方便快捷，稳定性和特异性高，且试剂盒操作简便，极大地降低了成本。
Description
技术领域
本发明属于医疗检测技术领域，具体涉及一种刚地弓形虫的检测试剂盒及其检测方法。
背景技术
刚地弓形虫(Toxoplasama gondii)是一种呈世界性分布的专性寄生于温血动物的顶复门寄生原虫。弓形虫专门寄生在有核细胞内，其中间宿主普遍而且无特异性，可以感染所有的哺乳动物，也包括人，引起人畜共患弓形虫病。因此，需要快速有效的检测方法用于该病的防控。
弓形虫的多种蛋白均可刺激机体产生免疫反应致密颗粒蛋白10(dense granuleprotein 10,GRA10)是弓形虫致密颗粒分泌的一种蛋白，他表达量高，而且其在弓形虫缓殖子和速殖子时期均可表达。
GRA10具有较好的免疫原性，可以通过抗原与抗体的特异性结合，根据循环外周血中刚地弓形虫的抗体的数量，可以判断是否感染刚地弓形虫，用于刚地弓形虫感染的临床辅助诊断，可以快速、敏感的检测出人体的感染情况。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种刚地弓形虫的检测试剂盒及其检测方法，以期解决上述现有技术中存在的至少部分技术问题。
为了实现上述目的，本发明提供一种刚地弓形虫的检测试剂盒，其包括氨基酸序列为SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6所示的6条多肽，分别为：
SEQ ID NO.1：Gly Ala Glu Ala Ala Val Leu Glu Glu Leu Ala Ala Ala GlyIle Gln Gly Ser Thr Ala Ala；
SEQ ID NO.2：Gln Glu Ala Gly Gly Glu Leu Glu Ser Ile Arg Val Thr AlaSer Ala Arg Thr Gly；
SEQ ID NO.3：Thr Met Gly Ala Gly Glu Thr Ala Ile Glu Arg Arg Ala ProAla Thr Ala Thr Gly；
SEQ ID NO.4：Ser Glu Ala Glu Glu Ala Met Asp Leu Leu Ala Thr Ile AlaSer Thr Gly Gly Ala；
SEQ ID NO.5：Gly Leu Thr Ile Val Gly Glu Leu Lys Ala Gly Gly Ser AlaAla Thr Ala Ile Gly；
SEQ ID NO.6：Thr Ala Ser Ala Thr Gly Leu Ile Glu Gly Asp Glu Ala AlaMet Ser Ala Ile Gly。
本发明中，氨基酸序列为SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6所示的6条多肽在试剂盒中作为TB刺激物，用于检测反应。
优选地，在所述刚地弓形虫的检测试剂盒中，氨基酸序列为SEQ ID NO.1～SEQ IDNO.6所示的6条多肽中的每一条的含量为10mg。
优选地，所述刚地弓形虫的检测试剂盒还包括无血清培养基。
优选地，所述刚地弓形虫的检测试剂盒还包括分离液。
优选地，所述刚地弓形虫的检测试剂盒还包括高特异性鼠抗人IgG抗体和/或刚地弓形虫感染阳性刺激物。
优选地，所述刚地弓形虫的检测试剂盒还包括用于酶联免疫斑点法的显色试剂，如NBT/BCIP显色系统，最终显色蓝紫色斑点，或AEC显色系统，最终显色红色斑点。
本发明还提供利用前述刚地弓形虫的检测试剂盒对刚地弓形虫进行检测的方法，包括如下步骤：
(1)用分离液分离待测样本，将分离好的细胞重悬于无血清培养基中；
(2)向重悬后的细胞中加入氨基酸序列如进行共孵育，然后向共孵育的体系中加入高特异性鼠抗人IgG抗体进行抗原抗体反应；
(3)对抗原抗体反应后的体系进行洗涤，再加入显色底物进行显色反应，计数反应生成的斑点数。
步骤(1)中，所述将分离好的细胞重悬于无血清培养基中优选保持细胞浓度为1.0×105～3.0×105细胞/mL。
步骤(2)中，所述重悬后的细胞优选加入96孔板中，所述加入氨基酸序列为SEQ IDNO.1～SEQ ID NO.6所示的6条多肽优选加入96孔板中与重悬后的细胞混合以进行共孵育。所述重悬后的细胞的添加量更优选每个反应孔为100μL，所述氨基酸序列为SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6所示的6条多肽的添加量优选每个反应孔中的终浓度为5μL。所述共孵育的时间优选16～20小时。
如本领域常规，步骤(2)在操作时，优选设置阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为刚地弓形虫阳性刺激物；所述阴性对照为无血清培养基留白，即反应孔中只添加无血清培养基，不添加任何其他试剂。
必须要指出的是，本发明所述的对刚地弓形虫进行检测的方法属于针对体外分离样本进行鉴定定性的检测方法，仅以获得待测样本中是否被刚地弓形虫刺激而感染的数量为直接结果和目的，并不涉及对人体健康状况的判断，不属于与疾病诊断相关的方法。
本发明中，上述优选条件在符合本领域常识的基础上可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明除特别说明之外，所用的百分比都是体积百分比。
本发明的有益效果为：本发明提供的包括氨基酸序列为SEQ ID NO.1～SEQ IDNO.6所示的6条多肽的检测试剂盒能够人工全序列合成，生产方便快捷，稳定性和特异性高，且相比传统方法检测的过程大大简化，极大地降低了成本。利用该试剂盒对分离的体外样本进行检测方便快捷，可控性和精确性均非常理想，且试剂盒操作简便。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，，对本发明作进一步的详细说明。
本发明基于刚地弓形虫的免疫应答机制对传统的检测方法进行了创新，研发出了能够人工全序列合成的6条多肽作为检测物(即序列表中的多肽1～多肽6，氨基酸编码序列对应为SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6)，经过大量的实验验证，并经和现有的检测方法对比，具有明显优势，本发明的包括氨基酸序列为SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6所示的6条多肽的试剂盒及利用其对体外刚地弓形虫感染待测样本进行检测的方法具有方便快捷、准确度高、成本低等优势，具有良好的应用前景。
氨基酸序列为SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6的6条多肽，具体分别为：
SEQ ID NO.1：Gly Ala Glu Ala Ala Val Leu Glu Glu Leu Ala Ala Ala GlyIle Gln Gly Ser Thr Ala Ala；
SEQ ID NO.2：Gln Glu Ala Gly Gly Glu Leu Glu Ser Ile Arg Val Thr AlaSer Ala Arg Thr Gly；
SEQ ID NO.3：Thr Met Gly Ala Gly Glu Thr Ala Ile Glu Arg Arg Ala ProAla Thr Ala Thr Gly；
SEQ ID NO.4：Ser Glu Ala Glu Glu Ala Met Asp Leu Leu Ala Thr Ile AlaSer Thr Gly Gly Ala；
序列表
<110> 梁洪捐，侯彪，李真，程勤勤
<120> 一种刚地弓形虫的检测试剂盒及其检测方法
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gly Ala Glu Ala Ala Val Leu Glu Glu Leu Ala Ala Ala Gly Ile Gln
1 5 10 15
Gly Ser Thr Ala Ala
20
<210> 2
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Gln Glu Ala Gly Gly Glu Leu Glu Ser Ile Arg Val Thr Ala Ser Ala
1 5 10 15
Arg Thr Gly
<210> 3
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Thr Met Gly Ala Gly Glu Thr Ala Ile Glu Arg Arg Ala Pro Ala Thr
1 5 10 15
Ala Thr Gly
<210> 4
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Ser Glu Ala Glu Glu Ala Met Asp Leu Leu Ala Thr Ile Ala Ser Thr
1 5 10 15
Gly Gly Ala
<210> 5
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Gly Leu Thr Ile Val Gly Glu Leu Lys Ala Gly Gly Ser Ala Ala Thr
1 5 10 15
Ala Ile Gly
<210> 6
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Thr Ala Ser Ala Thr Gly Leu Ile Glu Gly Asp Glu Ala Ala Met Ser
1 5 10 15
Ala Ile Gly
Claims (7)
1.一种刚地弓形虫的检测试剂盒，其特征在于，其包括氨基酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6所示的6条多肽：
SEQ ID NO.1：Gly Ala Glu Ala Ala Val Leu Glu Glu Leu Ala Ala Ala Gly IleGln Gly Ser Thr Ala Ala；
SEQ ID NO.2：Gln Glu Ala Gly Gly Glu Leu Glu Ser Ile Arg Val Thr Ala SerAla Arg Thr Gly；
SEQ ID NO.3：Thr Met Gly Ala Gly Glu Thr Ala Ile Glu Arg Arg Ala Pro AlaThr Ala Thr Gly；
SEQ ID NO.4：Ser Glu Ala Glu Glu Ala Met Asp Leu Leu Ala Thr Ile Ala SerThr Gly Gly Ala；
SEQ ID NO.5：Gly Leu Thr Ile Val Gly Glu Leu Lys Ala Gly Gly Ser Ala AlaThr Ala Ile Gly；
SEQ ID NO.6：Thr Ala Ser Ala Thr Gly Leu Ile Glu Gly Asp Glu Ala Ala MetSer Ala Ile Gly。
2.根据权利要求1所述的刚地弓形虫的检测试剂盒，其特征在于，在所述刚地弓形虫的检测试剂盒中，氨基酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6所示的6条多肽中的每一条的含量为10mg。
3.根据权利要求1所述的刚地弓形虫的检测试剂盒，其特征在于，所述刚地弓形虫的检测试剂盒还包括无血清培养基。
4.根据权利要求1所述的刚地弓形虫的检测试剂盒，其特征在于，所述刚地弓形虫的检测试剂盒还包括分离液。
5.根据权利要求1所述的刚地弓形虫的检测试剂盒，其特征在于，所述刚地弓形虫的检测试剂盒还包括高特异性鼠抗人IgG抗体和/或刚地弓形虫感染阳性刺激物。
6.根据权利要求1所述的刚地弓形虫的检测试剂盒，其特征在于，所述刚地弓形虫的检测试剂盒还包括用于酶联免疫斑点法的显色试剂。
7.利用如权利要求1-6中任一项所述的刚地弓形虫的检测试剂盒对刚地弓形虫进行检测的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)用分离液分离待测样本，将分离好的细胞重悬于无血清培养基中；
(2)向重悬后的细胞中加入氨基酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6所示的6条多肽进行共孵育，然后向共孵育的体系中加入高特异性鼠抗人IgG抗体进行抗原抗体反应；
(3)对抗原抗体反应后的体系进行洗涤，再加入显色底物进行显色反应，计数反应生成的斑点数。
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN108593930A true CN108593930A (zh) | 2018-09-28 |
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ID=63619710
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| CN (1) | CN108593930A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2022091531A1 (ja) * | 2020-10-28 | 2022-05-05 | 国立大学法人北海道大学 | 抗腫瘍ペプチド及びその利用 |
-
2018
- 2018-05-02 CN CN201810411643.3A patent/CN108593930A/zh not_active Withdrawn
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2022091531A1 (ja) * | 2020-10-28 | 2022-05-05 | 国立大学法人北海道大学 | 抗腫瘍ペプチド及びその利用 |
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