JPH02233700A - 結合蛋白質に結合した分析質を分離する方法及び血清中のビタミンｂ１２測定用試料準備試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利珀分野〕 本発明は、８Ｈ−４蛾脱注のテオールによりＨ′＆責白
實を分解丁ることによタ、結曾蛋臼質にＩＩＩＸ曾した
分析員を、この結台虞自負から分離する万法に関する。

〔従来の技何〕

多くの３［要な分析７ｊｔ例えばビタミン又はステロイ
ドは、待＾的又は非ｔ＃異的にＭ台蛋白賞例えば血清蛋
白質又は個の天然ｌ１ｉ！ｉ曾物負に結台している。こ
れらを測定する前に、これら分析負は、そのＭ曾鑞白貴
から又は他の結曾物負から＃一ざせるべきでめる。多く
のｍ曾に、このことは、競争原埋ｔ使用することによク
、例えはチオキシンｌＢ会グロプリン（　ＴＢＧ　）か
らＴ４ｋ＃離するために、分ｆｒＸの交又反応性頑縁体
の過剰の添加によシ、又はより温和な解離条件の保持、
例えば８−７ニリノ−１−ナフタリンースルホンａｉ　
（ＡＮ８）の添加により達成することができる。い《つ
かの場合に、このＭ会は、例えばビタミンＢ１２ｔ−分
離する丸めには強力な破壊法が必袂でめる程直に堅固で
るる。

看るしく稀釈嘔れた水性ｓｇｃ例えば血清）中の分析質
例えばビタミンＢ１２（シアノコパラミン）を測定する
ための現在貞用ざれている万法は、固有の７ァクター（
工Ｆ）ｔＭ曾試系として使用する放射能標織物員の使用
下における万法に基づｉでいる。これら其用の技術は、
マーカーとしての６′ＩＣｏ−Ｂ１２の使用下κ、遊離
の分析買と襟織付き分析質とが、ＩＦとの結曾に関して
朧争する競争原理の基本のもとで操作する。＃１！曾し
た試料と遊旙試科の分離（ＷＩ曾／遊一一分ｉ４１）は
、活性炭、固相結曾１ｍＦ又は４Ｉａ気分離（ここでは
工ｔが永久憾性粒子に結会している〕の使用下における
万伝に基づいて行なう。

血清一結合蛋白質から分析質例えはビタミンＢ１２ｔ−
分罐させる九めの現在償用の万法は、通例アルカリ性領
域（ｐ｝１１３．５）で、８Ｈ碁離脱性テオールジチオ
スレイトール（ＤＴＴ）の作用下に（アルカリ領域でＤ
’ｌ”Ｊ’　ｔ用いて血清ｇ科をインキエベーション）
Ｎｉ曾蛋白負ｔ分解することにｉｔづ《か、又は３ｕ〜
６ｕ分蕉沸及び引続く遠心分離することによる。有機物
質例えば７セトン、アルコールの添加によるか又は競争
性の又又Ｍ曾性物質例えば＝ピン７ミドの−茄によク、
この分解は増強することができる。ビタミンＢ１２の抽
出ｔｆｉｋｌｉ６め、コパラミンｔ同一形状の、安定で
横出可匝な形即ちシアノコバラミンに変えるための全て
の償用の試験法は、史にシ７冫化カリウムｔ含有する。

ζの双万Ｏ塊在眞用の試料準備法の欠点は、殊に、Ｄ’
ｌ”ｌ’ｌ２）使用の際の低一浴牌作用（甑かに約６０
〜８　０％　）、限られた安定性及び不快臭でめる●こ
の加熱分解は、冥験富中で、煮沸のための必喪な技術的
経費及び時間によシ、かつ遠心分離によシ、実用不可能
である。

〔発明の解決しようとする課題〕

従って、本発明の課題は、前記の従来慣用の試料準備法
の欠点を克服することのできるｇ科．１４絢法を提供す
ることであった。

〔課Ｍを解決する手段〕

この課聴は、本発明Ｋよク解決される。

本発明の目的は、ＷＩ台蛋白質にｍ曾し九分析質を１ア
ルカリ性憤域内で８Ｈ一橋離脱性チオールによりＮ！曾
歳白買を分解することに１９分−ざせる方法であり、こ
れは、８Ｈ一碁緒脱注チオールとして、式（１）： 〔式中ｎは１〜８の整数有利に６〜５でるる〕の１．２
−ジチオラン−３一カルボンＶｔ使用することより成る
。

１式の酸としては、有利に、リボン酸 （　Ｌｉｐｏｎａａａｕｒｅ　）が使用される。アルカ
リ注媒体としては、水酸化アルカリ溶液、殊κ、ＮａＯ
Ｈ一又はＫＯＨ　−　溶液を使用するのが有利である。

この際、アルカリの＃尻は、有利に０．０５〜１モル／
ｔｏ範囲内にある。■式のカルボン酸の有利な一置は、
１〜２ｕ啼／祷時に４〜１υＩダ／祷（ｎ＝４ｋ有する
リボン酸に対して計算）である。

不発明の方法は、原則的に、特異的耐曾歳白質に結会し
て介在する分析質の分離のため、妹にとタｔン、甲状腺
ホルモン又はステクイドの分離のために好適でめる。分
析質としてのビタミンＢ１２．ｔ−ａ離δせるために、
本発明の方法は特に好適であろことが判明した． 本発明の有利．な夾施形によれば、この方法を、Ｋ備の
存在で実施する．ＫＯＮＯ一匿は、１〜１ｕダ／ｍｔＯ
間が有利であるが、よタ＾い又はよク低い磯度が分＃１
ｔ−更に改良することもできる● （１）式中でｎは特に３〜５、殊に４（リボンａｌ）で
ある。

アルカリ性媒体としては、有利に、水酸化アルカリ殊に
ＮａＯ｝ｉ又はＫＯＨが使用される。この際１　アルカ
リＩ１反は、ＬＩ．Ｌｌ５　〜１−Ｔ：ル／Ｊ％ＫＯ．
２〜Ｕ．７モル／ｌの範囲にあるのが有利である。この
媒体のｐｋ１１直は、最低１υ、一般に１Ｕ〜１４Ｉ＃
に１３〜１４で６夕、殊に１３．６が有利でるる。

（１）式の１．２−ジチオール−６−カルボン酸は、（
ｎ＝４ｆ：有するリボンｍｒｃ関してｔｉ算して）、侍
に１　〜ＱｔＪｍ？７ｍｌ殊に４〜１ｕ＝４ｉ’／一の
軛囲で、Ｍ１に５〜８９／祷で使用δルる。

ビタミンＢ１２を測定するために、シアン化物例えばシ
アン化カリウムの存在で操作するのが有利ｔ６る。ｃｏ
シ７ｙ化’Ｉｐａｕ、ｕ．５　〜Ｓｕｖｉ編殊に１９／
腐の童で使用するのが有利である。

試料準備のための本兄明の方法は、手による測定法にも
、自動分析装置の使用下における方法にも好適である。

本発明方法の利点は、殊に久のとおりである：結合蛋白
質の分解は非常に迅速に進行し、一般に、１５分よク短
かく、この方法は、８０〜９５優の分離で非常に有効で
６夕、試料準備用の試薬ｆＢ液は非常に安定（意温での
貯蔵性は８週間以上）であク、本発明による分離試薬の
使用下では不快臭が塊われず、Ｃの試系は児全に無害で
めタ、この試薬は、汎用可能でｔｂク、リボン戚が、蛋
白質ｔ−分解する間に蛋白質にＭ会することに基づき、
このテストの影響は非常に低く、一一櫃の中和の際の蛋
白質一及び分析質−錯体の進形成の町能性は、看るしく
限定ざれる。

ＷＩ会蛋白質にＩＭ仕した分析質をこの超什蛋白質から
分離する本発明の方法は、多くの測定法の丸めの試料準
備の丸めに好適である。特に、本発明方＠は、分析５Ｋ
偽えはビタミン、甲状腺ホルモン及びステロイドに対し
て、例，ｔはテストステロンＮ会グロプリンからのテス
トステロンの分離、チロキシンＩｌｉ！曾グａプリン（
ＴＢＧ）からのＴ，、Ｔ，の分離の丸めに、史に、分析
員が蛋白質例えば細胞マ｝　ＩＪツクス又は結酋蛋白質
に結合したｍ瘍マーカーに結会している池の系に対して
も、殊にビタミンＢ１２側定法における試料準備のため
に好適である。

このような分析質の側定法は、例えばｘ．リュプケ（　
Ｌｕｅｂｋｅ　）のイムノロイッシェ・テスト・フェア
−二一ダーモレ卆ユラーレ●ヴイルクストッフエ（　Ｉ
ｍｍｕｎｏｌｏｇｉａｏｈｅ　Ｔａｓｔｅ　ｆｕｅｒｎ
ｉｅｄ＠ｒｍｏｌｅｋｕｌａｒｅ　　ＷＬｒｋａｔｏｆ
ｆｅ　　，　　　Ｇｅｏｒｇ　　ＴｈｉｅｍｅＶｅｒｌ
ａｇ，　　８ｔｕｔｔｇａｒｔ　（　１　９　７　８　
）　）　、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｎ．　Ａｏｔａ２２（１　
９６８）％　５１〜６９；Ｂ，　ｏスフエルド（　Ｒｏ
ｔｈｆｅｌｄ　）　ａｄ．の＝ａ．クレア●メデイシン
●リピンコット−７イラデル７イア（　Ｎｕｏλｅａｒ
　Ｍｅｄｉｃｉｎ＠Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ　，Ｐｈｉｌ
ａｄｅｌｐｈｉａ　）　６　９〜８４、１９７４ｉびに
殊にＴｅａｔｏａｔ＠ｒｏｎ　ｉｎ　Ｊ．　Ｉｎ（ＬＯ
Ｏｒ＊　Ｉ　Ｕ　Ｏ　（１９８４ハ５　６　７　〜３　
７　６　、７．　８ｔ＠ｒｏｉｄ．　Ｂｉｏｏｈａｍ．
　ｌ　９（１９７３）、１６０５〜１６１ｕ並びにＪ．
８ｔｅｒｏｉｄ　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　　２　２　（　１
　　９　８　５　）　、１　　６　９〜１７５及び西ド
イツ特許（ＤＪＩｆ−Ａ）第３５４５２５３号明細書に
記載されている。

Ｔ３及びＴ４の＃Ｊ定法は、例えば、Ｂｉｏｃｈｅｍ．
Ｂｉｏｐｈｙａ．Ｒａ８．Ｃｏｍｍ．４　６　（　　１
　　９　７　２　　）、２１０７〜２１１３に記載され
ている。ピタミ／Ｂ１２の創定法は、例えばクリニカル
・ピオケミストリイ（　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　ＢｉＯＯｂ
ｅｍｉａｔｒ７　）　１　８（１９８５）、２６１　〜
２６６、Ｊ．Ｃ１１ｎ．Ｐａｔｈ．　２　０　（　１　
９　６　７　）　、６　８　３　〜６　Ｂ　６、Ｂｒｉ
ｔ．　Ｈａｅｍａｔ．　２　２　（　１　９　７　２　
）、２　１〜６１、ＢｉｏＯｈｅｍ＊　Ｂｉｏｐｈｙａ
．　Ｒａａ．　Ｃｏｍｍ．　４　６　（　１　９７２　
）２１Ｕ７〜２１１３、ｉびに１町日出ＲＡ待顔号（西
ドイｙ出１ｔ４ＮＰ　３９［ＪＵ６５（Ｊ．６号）明細
書に記ｇδれている● 本発明のも５１つの目的物は、血清中のビタミンＢ１２
ｔ−測定するための試料準備用の、一１０〜１４でリボ
ン＠１〜２０ダ／一及びシアン化アルカリ１〜ｉ　ｕｉ
ｎｙ／ｔａｔ−含有する試楽である。

試料準備用のこの試Ｍｔ−、賦科に加え、これを、有利
に１ｕ〜２０殊に１５分間嵐温でインキュベートナる。

引続き、一値を７〜９ｉＣ低下させる。このことは、殊
に、適当な緩衝液の使用下に２工程でゆつくＤ実施する
のが有利でるる。さもないと沈殿が生じうる。

この試料準備は、本発明万法によシ、殊に、リボン欧（
ｌ式でｎ＝４）の使用下に行なう。

ＫＣ’Ｎ　（特にＫＣＮ　１〜１０Ｉク／−、殊に１〜
５〜／−の磯度で）の仔狂で操作するのが有利である。

このインキエペーションは、傅利に、憲温で、アルカリ
性領域で有利に１５分間実施し、工程Ｃ）の＊ｍの前に
中和する。Ｋ（’ＮＯ代りに、ＮａＣＮ又は他のＪ＃ｂ
ｍ一往のシアン化物も、この方法に影書しない陽イオン
と共に使用でさる。

工程ｄ）における競争性椰臓Ｂ１２（マーカー）として
は、例えばｌｓ？ｃｏ−Ｂ１２ｔ−便用することができ
る。この放射能マーカーに付随する欠点ｔさけるために
、（Ｍ）式： Ｂ１２−Ｃｏ−ＮＨ％ＮＨ−Ｒ−ＣＯ−隅θｙＮ躊ＧＰ
　　　（わ〔式中８１２は、シアノコパラミン（ピタξ
ンＢ１２）から、−ＣＯＮＨ，一基の離脱により形成さ
れたｆｉ基ｔ−表わし、Ｒは、結合基（スベーサー）を
表わし、ＸはＵ又は１であ夛、ＧＰは、１個のグリコシ
ル碁ｔ−弁して一ＮＨ−Ｎ■基にＭＯＬているグリコシ
ル碁含有マーカー酵素の残基ｔ表わす〕の８１２一複曾
体ｔ−使用するのが有利である。

（鳳）式中で一〇〇ＮＨ−　Ｍは、有利に８１２一残基
のｄ一位に存在し、第一に、Ｂ１２−４−Ｃｏ−Ｎ｝ｆ
−Ｎ−ＧＰ殊に、Ｂ１２−（Ｌ−Ｃｏ−ＮＨ−冊−Ｃｏ
−Ｃ’Ｈ．＋０−ＣＨ，−ＣＨ２−｝３−０−ＣＨ，−
ＣＯ−ＮＨ−Ｎ−ＧＰ　（ここでＧＰはベルオキシダ−
　ｔ’　ｊｉ＆　（ＰＯＤ）でめる）が使用される。

ＣＭ）式の８１２一値合体は、西ドイツ待肝出願弟５９
ＵＥＪ６４Ｂ．４号（発明の名称：新規コパラミンー酸
ヒドラジド及ひこれからｄ４ざれたコバラミンー複合体
）の目的物である。これは、式： Ｂ　１　２−Ｃｏ−ＮＨ−ＮＨ％　Ｒ−　Ｃｏ−ＮＨ−
Ｎ｝｛汀Ｈ（式中８１２、Ｒ及びＸは前記のものｔ−表
わす）のコパラミン−酸ヒドラジドとグリコ蛋白質のグ
リコシル碁のＯＨ一基との結曾により、その酸化及びヒ
ドラゾン基−ＮＨ−Ｎ−ＣＨ−グリコプロテインの形成
後に、自体公知の乗沖下で製造することができる。

標識分析質として殊に、 Ｂ１２−ｄ−猾■｛ナα２４４＜馬｛馬力｝島一■噌臣
刺ωが使用される。

ＰＯＤの測定は、自体公知の方法で行なうことができる
。ＰＯＤの測定ｔ−色原体としての２．２′−７ジノジ
ー（６−エチルベンズチアゾリン−６−スルホ／　ａＮ
　）　（ＡＢＴ８７　′ｆｔ用いるＰＯＤの＊ｐを介し
て行なうのが有利でるる。

試料の前処理（ｂ工程）は、外部で又は、自動的Ｂ１２
一副定プログラムの範囲でも、例えば前記の自動分析装
置を用いて行なうこともできる。溶液中で、磯縮物とし
て又は凍結乾燥された形でも使用することのできるＢ１
２一嶺曾体の１は、殊に、試料の種類及ひその中で予期
されるＢ１２一含分に依９決ｌる。最適麓は、特定の予
期されるＢ１２一含分に対して予め測定するのが有利で
ある。

殊に、前記の抗体をビタミンＢ１２の結合試薬として同
時に使用して、本発明の試料準備法を用いてビタミンＢ
１２ｔ−創定ナる万法によク、従来慣用の試料準備の使
用の際に放射能儂織Ｂ１２と結ひついて生じた問題が避
けらルるテスト系が提供される。仁の本発明による系は
、艶康上の害がなく、この試薬は、従米懺用のテスト系
のｍ曾よυも者るしく大きい保存性を有する。便用試栗
の取扱い容易性及び無書性及びこのテストの笑画容易性
によク、この系は、全体的に非常に使用し易い。使用七
ノクローナル抗体は、従来使用１れた１１１ｔＭ曾又は
達助丁ることのできる血清抗体によって影響されない。

本発明による分鳩法（試料準備）の使用は、試験正確性
を改良し、テストの多大の認容性に寄与する．ビタミン
Ｂ１２一分離の良好な再現性及び多大な効果が得られる
。

〔夷施例〕

次の実施例及び自付図面につき、本発明を詳述するが、
これらは本発明を限定するものではない。呈温（ＲＴ）
とは、２５℃±２℃である。

「係」は「重量係」である。

第１図は、例３による、添加物なし（曲ａ１人リボ／ｊ
１１０＃／ｆｆｉｊｍ加（曲線２）％Ｄ’ｌ’Ｔ１０ダ
／Ｉｌｌ添加（曲線６）の際のビタミンｎ１２１１ｊ定
用の標準曲巌である。

例　　１ リボン酸での試料前処理 μト血清２　５　（Ｊ　Ａｌに分鵬ｉＥ　系（　ＮａＯ
Ｈ　Ｕ−　５　％ル／ｌ中に浴かされたリボンｔｌＬ８
ダ／　ａＪ　，　　シアン化カリウムＩ　ＩＲ９／Ｊａ
Ｊよυ成る〕１２５μｅと混什し、嵐温で１５分間イン
キュベートナる。

引続き２００ｍ七ル／ｌ燐酸塩緩衝液（　ｐＨ　４．１
　）１　２５／ｄｋ加える。２υ（ｌｍモル／ｌ＠ｔｌ
ｔＪＭ稜倫液（Ｐｌｉ．１）の代クに、燐酸（　Ｈ３Ｐ
Ｏ４、１．５Ｎ）２５μｌ％Ｈ用できる。このことは、
この際に、試料の稀釈が威少される利点を有する。

もう１つの変法で、中和のために燐酸塩緩衝液（２００
ｍモル／ｌ，Ｈ７．２）８υυＡＩ　Ｙｒ加えることが
できる． 例　　２ ＤＴＴでの試料前処理（比較） ヒト血清２　５　ＬＩ　ＡｔにＤＴＴ一分離試薬（ｏ．
５モル／　ｌ　ＮａＯＨ中に浴かしたＤＴＴ　１　０　
’ｉ　／　ａｌｚシ７ノ化カリウム１１９／Ｉｌｌ）１
２５μノと混曾し、憲亀で１５分間インキエベートする
。引続き、燐酸塩緩｛１液（２０Ｌｊｍモル／！、ｐｉ
１　４．１　）１２５ｓｌｔｍＬる。

例　　３ ピタｉンＢ１２の創定 ａ）試痛癲： テーモ（　Ｔｈｅｒｍｏ　）　−　ＲＳＡストレプト７
ピジンで塗被δれたポリスチロール管（欧州特奸！０２
６９０９２号によク表造） 試ＩＩ＆１ ビタミンＢ１２に対するピチオン化されたＭＡ！Ｃ　（
　ｌｃＡｃｃ８　８１　０　１　３ＬＩ　２　）　９５
　ｎｊＦ／７１７（ピチオン化は；Ａｃｓ　（　１　９
　７　８　）　３　５　８　５〜３５９０によるノ ４Ｑｍモル／ｊ＠酸塩緩衝液（…７．２）試薬２ Ｂ１２　−ｄ−　ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ−　Ｃｏ　−ＣＨ，
１−（０−ＣＨ２　−　Ｃｋｌ２＋３０−ＣＨ２　−Ｃ
Ｏ−ＮＨ−Ｎ−ＰＯＤ　（活性約６０ｍｌＪ／ｔｔｔｌ
）４（Ｊｍモル／ノ＃酸塩＆１１液Ｃ　Ｐ８　７．２　
）試痛３ 燐酸塩一クエン酸塩綾南液（ｐｉ４４．４）　　　１０
（Ｉｎモル／ｌ４細酸ナトリウム　　　　　　　３．２
ｍモル／ｊ１））　＃Ｊ足の実施 この測定の英ｊｏ九めに、例１又は例２にょク前処理さ
れ九試科２　ｏＬＩ　ＩＡｌを試殖１　　８ＬＩＵμｊ
と共にストレプトアピジン管中に入れ、富龜で６Ｕ分間
インキュベートナる。引続き、洗紗＃液（塩化ナトリウ
ム２　５　ｏｙｖ／ｍ，　ｆｌｔｌｌｔｍ１ダ／１００
＃ｌＪ）で洗浄し、試系２　　　１０（Ｊ［Ｊ〃ｊｔ−
加，ｔ％重温で３０分間インキエベートナる。洗浄浦ａ
（塩化ナトリウム２　５　０ｉｔｖ／ｔｒｉｅｓ硫酸鋼
１１１；ｌ／ＩＥＪＣＪｍｌ）で洗浄し、試渠３ｔ加え
、室温で３０分間イン中エベートし、生じる色ｔビタミ
ンＢ１２の尺度として４　２　０　ｎｍで測定する。

纂１表は、例３によるテストにおける分離試薬としての
リボン酸もしくはＤＴＴの使用下での種々のヒト血清に
関する結果の比較を示す。

ｍ１　表 リボン蹴 Ｉ　ＣＪＭ’９７Ｍ Ｂ　１　　２（ｌｌｊｌｌｉｔ　　　（　　ｐＩ／ＩＬ
Ｉ）ＤＴＴ １υ〜／編 これから、リポン酸の使用の際Ｋ高い測定値が得られ、
従って良好な分離が達成式れることが判る。

第１図は、シアノコパラミンー標準（塩化ナカリ？Ａ０
．１１ｔ−有すｂ　４　Ｕ　ｍ　％ル／　ｌ　Ｉｌｉａ
ｌａ衝液（　ｐｉ−１　７．［Ｊ　）中のシアノコパラ
ミン〕の使用の際の較正曲一に対するＤＴＴ　（　１　
０ダ／ＩＬＩ）もし《はリボンｍ（１０ダ／紅）の影響
ｔ示している。これによれば、蚊止曲線線リボン酸によ
り非常に１かにのみ影ｗされる。

Ｂ１２に対するＨＡＸとしてセルラインＮＣＡＣＣ８　
８　１　Ｕ　１　３　Ｕ　１　カラノ！ＡＸｉ−使用ｆ
ルＭＫ４一様な結果が得られる。

ｆｉ４ テストステロンー測定 試薬類： 試験緩衝＠　： テストステロンに対するモノクローナル抗体（ＥＩＣＡ
ＣＣ８５１　２　１　７０１　）３５ｎ＃／”ｓ　４０
ｍモル／ｌ燐酸ナトリウム（一６．８）処ｊ！溶液： マウスνａ−ｒに対するポリクローナル羊一抗体（Ｉｇ
　（｝）１０μ＆／ＩＪ 炭酸ナトリウム緩衝液（ｐｉ−１９．６　）洗浄液： 塩化ナトリウム 硫酸銅 基質溶液： ２０ｍモル／ｌ ２５０　１９７　１００　ａＪ １１１９／１１ＪＵｍｌ 燐酸塩−クエン飯塩駿伽液（ｐｊ’１４．４）　　　１
０Ｌｌｍモル／ｊ過硼酸ナトリウム　　　　　　　６．
２ｍモル／ｌ賦科： 例１によクリボン故で前処理し友か又は例２によＤＤＴ
Ｔで前処理したヒト血清。

この測定夷施のために、処理俗液１ｔｚｌ　ｆ昆温でル
ラン管中で３Ｕ＃−間インキエベートした。

引続き、洗浄溶液で２回洗浄した。試験稜衡敵１ａｊｔ
−加え、嵐温で６０分間インキエベートし、ｕｇ３ａ．
ｓａｉ４９号Ｋ！ｊ）裏造、８　Ｕ　ＮＵ／ｕｔｌ）１
ａに、４０ｍモル／ｌ燐酸ナトリウム緩衝液（　ｐｉ−
１６．８　）中で、プルａ＝ツ／Ｐ６８　　Ｌｌ．２１
ｔ−銚加し、寛温で３ｕ分間インキエベートし、洗浄額
で２回洗苧した。その後、基質静液１ｄｔ加え、璽温で
３ｕ分間インキエペー｝Ｌ、４　ｕ　５　ｎｍでの秋元
友を測定した。

【図面の簡単な説明】

ＷＸ１図は、シアノコパラミン標準の使用下におけるＤ
Ｔ？及びリボン酸による較正曲様に対する影ｔ＃ｔ示ナ
曲一図である。 Ｂｔ２１ｐｇ／ｍｌ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、アルカリ性領域内でのＳＨ基離脱性チオールによる
   結合蛋白質の分解のより結合蛋白質に結合した分析質を
   分離する方法において、ＳＨ基離脱性チオールとして、
   式（ I ）： ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） 〔式中ｎは１〜８の整数を表わす〕の１，２−ジチオラ
   ン−３−カルボン酸を使用することを特徴とする、結合
   蛋白質に結合した分析質を分離する方法。 ２、ｐＨ１０〜１４で、 リボン酸１〜２０ｍｇ／ｍｌ シアン化アルカリ１〜１０ｍｇ／ｍｌ を含有する、血清中のビタミンＢ１２測定用試料準備試
   薬。