CN103091494A - 黄曲霉毒素m1的化学发光酶联免疫检测试剂盒及使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种黄曲霉毒素M₁的化学发光酶联免疫检测试剂盒及使用方法，属于化学发光酶联免疫检测技术领域。该检测试剂盒包括包被有黄曲霉毒素M₁抗原的化学发光酶标板，黄曲霉毒素M₁标准品，黄曲霉毒素M₁抗体，酶标抗抗体，化学发光液A液和B液。该试剂盒的使用方法包括如下步骤：（1）待测样品的前处理；（2）依次加入黄曲霉毒素M₁标准品溶液或样品、黄曲霉毒素M₁抗体，竞争反应后加入酶标抗抗体，最后加入化学发光液通过化学发光免疫分析仪进行黄曲霉毒素M₁的定量检测；（3）结果处理与分析。本发明提供的检测试剂盒灵敏度高、稳定性好，适合大量样品的筛查，具有重要的实际应用推广意义。

Description

黄曲霉毒素M1的化学发光酶联免疫检测试剂盒及使用方法

技术领域

本发明涉及化学发光酶联免疫检测技术领域，特别涉及一种黄曲霉毒素M₁的化学发光酶联免疫检测试剂盒及使用方法。

背景技术

黄曲霉毒素（Aflatoxins）是真菌产生的毒性代谢产物，广泛存在于各种粮食、食品和饲料中，对人类和动物表现出很强的毒性。黄曲霉毒素1993年被世界卫生组织（WHO）的癌症研究机构划定为Ⅰ类致癌物。黄曲霉毒素M₁（Aflatoxin M₁，缩写AFM₁）属于黄曲霉毒素一类结构相似的化合物中的一种，该类毒素是由常见的黄曲霉菌（Asperillus Flavus）和寄生曲霉菌（AsperillusParasiticus）产生的代谢产物，在湿热地区食品和饲料中出现黄曲霉毒素的机率最高。AFM₁物理化学性质相当稳定，不被巴氏消毒破坏。黄曲霉毒素M₁的危害主要表现在致癌性和致突变性，对人及动物肝脏组织有破坏作用，可导致肝癌甚至死亡。

动物的AFM₁中毒主要表现为食欲不振、体重下降、生长迟缓、繁殖能力降低、产蛋及产奶量减少等。中毒病变主要在肝脏，表现为肝细胞变性、坏死、出血、胆管增生等。急性中毒后期，动物出现体温升高、血性腹泻、心脏出现出血瘀点和瘀斑、胆囊壁增厚、门静脉周围纤维化、肝淋巴结节形成及空泡形成、胆管增生等。黄曲霉毒素M₁是动物摄入黄曲霉毒素B₁后在体内经羟基化代谢的产物，一部分从尿和乳汁排出，一部分存在于动物的可食部分，如乳、肝、蛋类、肾、血和肌肉中，其中以乳最为常见。黄曲霉毒素M₁的毒性和致癌性与黄曲霉毒素B₁的基本相似。由于牛乳及其制品是人类、特别是婴儿的主要食品，所以被黄曲霉毒素M₁污染的牛乳及其制品危害性更大。很多国家已经对牛奶和乳制品中的黄曲霉毒素M₁含量有了明确的限量标准。美国、中国以及日本对乳及乳制品中AFM₁的限量标准为0.5μg/kg，而欧盟国家及瑞士对鲜乳中的AFM₁限量标准则更低，分别为0.05μg/kg、0.01μg/kg。

AFM₁毒性主要表现在致癌性和致突变性，生理学致癌机制的研究表明：AFM₁的远端呋喃环环氧结构可与体内DNA嘌呤残基共价结合，从而产生DNA的某些损伤，引起DNA结构和功能的改变，产生癌变。AFM₁致癌性与AFB₁的致癌性基本相似，但毒性低于AFB₁，然而与氰化钾和砒霜相比，仍属剧毒物质，为强致癌剂。流行病学研究结果表明：肝癌高发区的肝癌发病率与AFB₁的摄入以及转化为尿中的AFM₁的转化率有密切关系。随着人们对黄曲霉毒素认识的不断深入以及监控力度的加大，人体直接摄入AFB₁的机会越来越少，而动物乳中AFM₁的存在对人类的危害变得至关重要。由于黄曲霉毒素M₁相当稳定，巴氏灭菌法也无法将其杀灭，所以检测黄曲霉毒素M₁不仅要在饲料原料中检测，而且在最终产品中也需要进行鉴定。

由于黄曲霉毒素M₁在牛奶等食品中的残留、在饲料中的污染都很微量，检测很困难，因此需建立一种高度灵敏、低检测限的检测方法。目前黄曲霉毒素M₁比较常用的检测方法有高效液相色谱法（HPLC），气相色谱法（GC），薄层层析法（TLC），高效液相色谱-质谱联用法（HPLC-MS）以及免疫分析检测法等。TLC的特异性较差，灵敏度也相对较低，因此需要的AFM₁标准品浓度较高，存在潜在的高操作污染性；仪器法所需仪器设备投资大，操作技术要求高，净化柱消耗较多，检测成本较高。它们都各有优缺点，但这些方法因有的具有特异性差、灵敏度低、样品预处理繁琐、需价格昂贵的精密仪器、费时、一次不能检测大量的样品等缺点，不易推广，ELISA方法虽具有简单、快速、灵敏的特点，也适宜大规模的筛查工作，但其灵敏度有一定的制约。因此，建立一种经济、可靠、特异、敏感、快速有效的检测方法有很大的实际意义和应用前景。化学发光免疫分析（CLIA）是化学发光和免疫分析结合的产物,将发光物质直接标记到抗原或抗体上，与抗体或抗原发生特异性免疫反应后，通过测定标记物的化学发光强度确定被测抗体或抗原的含量。具有高通量检测、灵敏度高、检测范围宽、分析速度快、价廉经济等优点，是免疫分析的重要发展方向，并被逐渐引入食品安全领域有毒有害物质的检测。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种黄曲霉毒素M₁的化学发光酶联免疫检测试剂盒。

本发明的另一目的在于提供上述黄曲霉毒素M₁的化学发光酶联免疫检测试剂盒的使用方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种黄曲霉毒素M₁的化学发光酶联免疫检测试剂盒，包括包被有黄曲霉毒素M₁抗原的化学发光酶标板，黄曲霉毒素M₁标准品，黄曲霉毒素M₁抗体，酶标抗抗体，化学发光液和洗涤液。

所述的化学发光酶标板优选为96孔可拆不透明白色发光板；所述的黄曲霉毒素M₁抗原为黄曲霉毒素M₁与牛血清白蛋白（BSA）的偶联物；包被黄曲霉毒素M₁抗原的包被液优选为将1.69g碳酸钠和2.95g碳酸氢钠溶于1L双蒸水中得到，黄曲霉毒素M₁抗原的包被浓度为0.625mg/L；封闭液优选为取0.1g BSA（牛血清白蛋白）、5g甘氨酸溶于100mL PBS（0.01mol/L pH7.4）溶液得到。

所述的黄曲霉毒素M₁标准品浓度为1mg/mL，使用时用0.01mol/L PBST（配方为NaH₂PO₄·12H₂O2.9g、NaCl8.5g、KCl0.2g、KH₂PO₄0.2g、Tween-200.5mL，定容至1L）将标准品稀释成浓度为0.0、0.01、0.03、0.1、0.3、1、3μg/L的一系列黄曲霉毒素M₁标准品溶液。

所述的黄曲霉毒素M₁抗体为黄曲霉毒素M₁单克隆抗体或兔多克隆抗体。所述的黄曲霉毒素M₁单克隆抗体为商业化的黄曲霉毒素M₁单克隆抗体（如北京为康惠华生物技术有限公司的黄曲霉毒素M₁单克隆抗体）。所述的黄曲霉毒素M₁兔多克隆抗体为商业化的黄曲霉毒素M₁多克隆抗体（如北京为康惠华生物技术有限公司的黄曲霉毒素M₁多克隆抗体）。优选的，所述的黄曲霉毒素M₁抗体为黄曲霉毒素M₁单克隆抗体，其原浓度为2mg/mL，使用时优选为0.01mol/L PBST稀释6000倍。

所述的酶标抗抗体优选为辣根过氧化酶标记的羊抗鼠IgG或羊抗兔IgG。更优选的，所述的酶标抗抗体为辣根过氧化酶标记的羊抗鼠IgG，其原浓度为10mg/mL，使用时优选为0.01mol/L PBST稀释6000倍。

所述化学发光液由A液和B液组成，A液优选为将20mg对碘苯酚、8mg鲁米诺、1.21g Tris溶于100mL去离子水，用盐酸调pH至8.4得到；B液优选为将体积分数0.40%H₂O₂、1.21g Tris溶于100mL去离子水，用盐酸调pH至7.0得到；使用时将A液和B液按体积比1:1的比例混合。

所述的洗涤液优选为20倍浓缩洗涤液，20倍浓缩洗涤液是含有体积分数0.5%Tween20的pH7.40.4mol/L的磷酸盐缓冲液，使用时用去离子水稀释成1倍洗涤液。

所述的黄曲霉毒素M₁的化学发光酶联免疫检测试剂盒最大检测范围为18～130pg/mL，灵敏度48pg/mL，检出限40pg/mL。

上述黄曲霉毒素M₁的化学发光酶联免疫检测试剂盒的使用方法，包括如下步骤：

（1）将试剂盒置于15～35℃平衡30min以上。

（2）取出化学发光酶标板，往标准孔中加入不同浓度的黄曲霉毒素M₁标准品溶液，样品孔中加入待测样品，然后每孔加入黄曲霉毒素M₁抗体，盖上盖板膜振摇混匀，孵育。

（3）吸除板孔中的反应液，加入洗涤液洗涤，将酶标板拍干。

（4）往各孔中加入酶标抗抗体，轻拍混匀，孵育。

（5）每孔加入化学发光反应液，轻拍混匀，盖上盖板膜，1～2min后用化学发光免疫分析仪测定各孔的发光值RLU。

（6）检测结果计算与分析：抑制率（%）=B/B₀×100（%），式中：B—不同浓度黄曲霉毒素M₁标准溶液孔（或样品孔）的发光值；B₀—0浓度黄曲霉毒素M₁标准溶液发光值；以抑制率为纵坐标，黄曲霉毒素M₁浓度的对数为横坐标绘制标准曲线，从而确定样品中黄曲霉毒素M₁的含量。

步骤（2）中所述的待测样品为液态乳或乳粉，其处理方法如下：

液态乳：将待测液态乳摇匀，称取5.0g试样到10mL离心管中，2～8℃以4000rpm的转速离心10min，用脱脂棉签除去上层脂肪。加入150μL0.36mol/L亚铁氰化钾溶液，短暂涡旋混合后加入150μL1.04mol/L硫酸锌溶液，涡旋振荡3min后，于10～15℃以4000rpm的转速离心10min，上清液即可用于检测；

乳粉：称取10.0g待测乳粉于小烧杯中，加50℃热水溶解，转移到100mL容量瓶中，定容至刻度，以下处理同液态乳。

优选的，所述的黄曲霉毒素M₁的化学发光酶联免疫检测试剂盒的使用方法，其特征在于包含如下步骤：

（1）将试剂盒置于室温平衡30min以上，用0.01mol/L PBST将黄曲霉毒素M₁标准品稀释成浓度分别为0.0、0.01、0.03、0.1、0.3、1、3μg/L的黄曲霉毒素M₁标准品溶液。

（2）取出化学发光酶标板，在标准孔加入50μL不同浓度的黄曲霉毒素M₁标准品溶液，样品孔加入50μL待测样品，然后每孔加入50μL稀释好的黄曲霉毒素M₁单克隆抗体，盖上盖板膜在微量振荡器上振摇10min后，置于37℃孵育50min。

（3）吸除板孔中的反应液，各孔加入洗涤液约300μL，静置20秒左右，除去其中液体，如此共洗5次，最后一次将板拍干；也可用自动洗板机洗板5次，洗完后将微孔架倒置在吸水纸上拍打以保证完全除去孔中的液体。

（4）往各孔中加入100μL稀释好的辣根过氧化酶标记的羊抗鼠IgG酶标抗抗体，轻拍混匀后，置于37℃孵育30min。

（5）每孔加入100μL A液与B液等体积混合后的化学发光液，轻拍混匀，盖上盖板膜，1～2min后用化学发光免疫分析仪测定各孔的发光值RLU，保存数据。

（6）检测结果计算与分析：抑制率（%）=B/B₀×100（%），式中：B—不同浓度黄曲霉毒素M₁标准溶液孔（或样品孔）的发光值；B₀—0浓度黄曲霉毒素M₁标准溶液发光值；以抑制率为纵坐标，黄曲霉毒素M₁浓度的对数为横坐标绘制标准曲线，从而确定样品中黄曲霉毒素M₁的含量。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

（1）环保经济：与现有的检测黄曲霉毒素M₁的ELISA试剂盒相比，不需要再使用具有腐蚀性的硫酸、以及大部分有毒或为致癌物质的底物，更加环保经济。

（2）高灵敏度、高特异性：与现有的检测黄曲霉毒素M₁的ELISA试剂盒相比，克服了试剂盒检测过程中易受到内源性酶干扰、吸光度的检测也易受到多种外在因素的影响的弊端，本发明采用高特异性、高亲合力的抗体，检测黄曲霉毒素M₁的化学发光酶免疫试剂盒灵敏度更高，可达到0.048ng/mL。

（3）高精密度、高稳定性：采用包被抗原进行酶标板的包被，相对于抗体包被，更有利于达到较好的包被效果与较长的保存时间，从而提高了试剂盒检测的精密度与稳定性。

（4）快速、准确：前处理方法简单快速、符合试剂盒的快速、准确的检测要求。

基于以上优点本试剂盒非常适用于黄曲霉毒素M₁残留的痕量分析与批量检测，具有重要的现实意义。

附图说明

图1是黄曲霉毒素M₁标准曲线图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例中所使用试剂如下：

包被液：将1.69g碳酸钠和2.95g碳酸氢钠溶于1L双蒸水中得到。

20倍浓缩洗涤液：体积分数0.5%Tween20的pH7.40.4mol/L的磷酸盐缓冲液，使用时用去离子水稀释成1倍。

封闭液：取0.1g BSA（牛血清白蛋白）、5g甘氨酸溶于100mL PBS溶液（0.01mol/L pH7.4）得到。

黄曲霉毒素M₁标准溶液：用色谱级乙腈将黄曲霉毒素M₁标准品稀释成1mg/mL备用；再用0.01mol/L PBST稀释为浓度分别为0.0、0.01、0.03、0.1、0.3、1、3μg/L的黄曲霉毒素M₁标准品溶液，4℃保存。

化学发光液：化学发光液由A液和B液组成，A液为将20mg对碘苯酚、8mg鲁米诺、1.21gTris溶于100mL去离子水，用盐酸调pH至8.4得到；B液为将体积分数0.40%H₂O₂、1.21gTris溶于100mL去离子水，用盐酸调pH至7.0得到；使用时将A液和B液按体积比1:1的比例混合。

黄曲霉毒素M₁单克隆抗体（2mg/mL）：购自北京为康惠华生物技术有限公司。

辣根过氧化酶标记的羊抗鼠IgG（10mg/mL）：购自武汉博士德生物工程有限公司。

实施例1黄曲霉毒素M₁单克隆抗体、包被抗原的制备

（1）包被抗原的制备

0.3mg AFM₁溶于400μL无水吡啶中，加入1mg羟甲氧基羟氨半盐酸（CMO），37℃避光振摇反应，每4h取出微量进行薄层层析定性分析，直至AFM₁完全转化为AFM₁肟；取6mg AFM₁肟溶于20mL25%（V/V）甲醇水溶液中，加入367mg EDAC（乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺），再加入1mL10mg/mL BSA，室温下避光振荡48h。反应过程中，两次分别再加入367mg EDAC。反应结束后，将混合物用去离子水透析5天，每天换水，取透析完的溶液，过0.45μm滤膜得到黄曲霉毒素M₁与牛血清白蛋白的偶联物（包被抗原），于-20℃冻存。

（2）黄曲霉毒素M₁单克隆抗体的制备

购自北京为康惠华生物技术有限公司。

实施例2化学发光酶免疫方法的建立

（1）包被抗原与抗体浓度的优选

1）将包被抗原按2.5mg/L、1.25mg/L、0.833mg/L、0.625mg/L、0.5mg/L用包被液（0.05mol/L pH5.0碳酸盐缓冲液）稀释并纵向包被不透明白色发光板，100μL/孔，37℃24h，用洗液洗涤2次，在吸水纸上拍干。

2）加入配制好的封闭液150μL/孔进行封闭，37℃过夜，甩干后放入烘箱烘干。

3）加入50μL/孔用0.01mol/L PBST稀释的黄曲霉毒素M₁标准品系列溶液

4）加入50μL/孔用0.01mol/L PBST系列稀释的黄曲霉毒素M₁单克隆抗体（1:4000、1:5000、1:6000、1:7000、1:8000），37℃60min，洗板5次，在吸水纸上拍干。

5）加入100μL/孔已稀释的辣根过氧化酶标记的羊抗鼠IgG，37℃30min，用洗液洗板5次，在吸水纸上拍干。

6）加入现配的化学发光液，100μL/孔，用化学发光免疫分析仪测定发光值。以发光值随包被抗原浓度有明显梯度变化的包被抗原浓度和抗体稀释度为最佳浓度进行特异性测定。得到包被抗原最佳浓度为0.625mg/L，抗体（浓度2mg/mL）稀释倍数为1:6000。

（2）抗体灵敏度的测定

以包被抗原浓度为0.625mg/L，黄曲霉毒素M₁单克隆抗体（浓度2mg/mL）稀释倍数为1：6000，进行抗体灵敏度的测定。

1）取96孔不透明白色发光板，将包被抗原用包被液稀释至0.625mg/L，每孔内加入100μL，37℃过夜，用洗涤液洗涤2次，在吸水纸上拍干。

2）加入封闭液150μL/孔进行封闭，37℃过夜，甩干后放入烘箱烘干。

3）加稀释倍数为1:6000的黄曲霉毒素M₁单克隆抗体50μL/孔与不同浓度的黄曲霉毒素M₁溶液50μL/孔于相应孔内，37℃60min，洗板5次，在吸水纸上拍干。

4）加入100μL/孔稀释度为1:6000的辣根过氧化酶标记的羊抗鼠IgG，37℃30min，洗板5次，在吸水纸上拍干。

5）加入现配的化学发光反应液，100μL/孔，测定发光值。

检测结果以抑制率计算，抑制率（%）=B/B₀×100（%），B是不同浓度标准溶液竞争的发光值，B₀是不加标准品的发光值。计算50%抑制率时标准品的浓度即为黄曲霉毒素M₁单克隆抗体的灵敏度，为0.048ng/mL。

实施例3黄曲霉毒素M₁化学发光酶联免疫检测试剂盒

（1）试剂盒的组成

1）包被有黄曲霉毒素M₁抗原的化学发光酶标板：酶标板为96孔可拆不透明白色发光板，已包被黄曲霉毒素M₁抗原和封闭液；黄曲霉毒素M₁抗原为黄曲霉毒素M₁与牛血清白蛋白的偶联物，包被浓度为0.625mg/L。

酶标板的制备：取96孔可拆不透明白色发光板，包被抗原用包被液稀释至0.625mg/L，每孔内加入100μL，37℃过夜，倾去孔内液体，洗涤液洗涤2次，在吸水纸上拍干。然后每孔加入封闭液150μL，37℃孵育过夜，倾去孔内液体，置于37℃烘箱中烘干后用铝箔袋真空密封4℃保存。

2）黄曲霉毒素M₁系列标准品溶液（浓度0.0、0.01、0.03、0.1、0.3、1、3μg/L）。

3）黄曲霉毒素M₁单克隆抗体2mg/mL，其工作浓度为1:6000。

4）辣根过氧化酶标记的羊抗鼠IgG10mg/mL：其工作浓度为1:6000。

5）化学发光液：由A液和B液组成。

6）20倍浓缩洗涤液。

（2）试剂分装：将各试剂测定合格后无菌分装，黄曲霉毒素M₁标准品（10μg/mL）l mL/瓶，已稀释的黄曲霉毒素M₁单克隆抗体7mL/瓶，已稀释的辣根过氧化酶标记的羊抗鼠IgG7mL/瓶，A液7mL/瓶，B液7mL/瓶，20倍浓缩洗涤液50mL/瓶。分装后贴标签，注明批号和有效期，4℃保存。

（3）试剂盒的组装：分别将步骤（1）的包被有黄曲霉毒素M₁抗原的化学发光酶标板1块和黄曲霉毒素M₁标准品、黄曲霉毒素M₁单克隆抗体、辣根过氧化酶标记的羊抗鼠IgG、A液、B液、20倍浓缩洗涤液各1瓶及使用说明书1份置试剂盒内指定位置，试剂盒检验合格后封装，4℃保存。

实施例4黄曲霉毒素M₁化学发光酶联免疫检测试剂盒的使用方法

（1）样品前处理

1）液态乳将待测样品摇匀，称取5.0g试样到10mL离心管中，2～8℃以4000rpm的转速离心10min，用脱脂棉签除去上层脂肪。加入150μL0.36mol/L亚铁氰化钾溶液，短暂涡旋混合后加入150μL1.04mol/L硫酸锌溶液，涡旋振荡3min后，于10～15℃以4000rpm的转速离心10min，上清液即可用于检测。

2）乳粉称取10.0g待测乳粉于小烧杯中，加50℃热水溶解，转移到100mL容量瓶中，定容至刻度，以下同液态乳处理。

（2）试剂盒的检测方法

1）取出试剂盒，置于室温（20～24℃）平衡30min以上，取出化学发光酶标板，用0.01mol/L PBST将黄曲霉毒素M₁标准品稀释成一系列不同浓度的黄曲霉毒素M₁标准品溶液（0.0、0.01、0.03、0.1、0.3、1、3μg/L）。

2）在标准孔加入50μL不同浓度的黄曲霉毒素M₁标准品溶液，样品孔加入50μL待测样品，然后每孔加入50μL用0.01mol/L PBST稀释好的黄曲霉毒素M₁单克隆抗体，盖上盖板膜在微量振荡器上振摇10min后，置于37℃孵育50min。

3）吸除板孔中的反应液，各孔加入洗涤液约300μL，静置20秒左右，除去其中液体，如此共洗5次，最后一次将板拍干；也可用自动洗板机洗板5次。洗完后将微孔架倒置在吸水纸上拍打（每轮洗板拍打3次）以保证完全除去孔中的液体。

4）在酶标板中加入100μL稀释好的辣根过氧化酶标记的羊抗鼠IgG，轻拍混匀后，置于37℃孵育30min。

5）每孔加入100μL底物缓冲液与底物液等体积混合后的化学发光反应液，轻拍混匀，盖上盖板膜，1～2min后用化学发光免疫分析仪测定各孔的发光值RLU，保存数据。

（3）检测结果计算与分析

抑制率（%）=B/B₀×100（%）

式中：B—不同浓度标准溶液孔（或样品孔）的发光值；B₀—0浓度标准溶液发光值。

以抑制率为纵坐标，黄曲霉毒素M₁标准品溶液浓度的对数为横坐标绘制标准曲线，从而确定样品中黄曲霉毒素M₁的含量。

实施例5试剂盒精密度与准确度试验

（1）黄曲霉毒素M₁标准品溶液的重复性试验

从3批按照实施例3中的方法制备的酶标板中，各抽出20个微孔，按照实施例4中试剂盒的检测方法测定0.1μg/L黄曲霉毒素M₁标准溶液的发光值，重复20次，计算变异系数CV%，结果见表1。

表1黄曲霉毒素M₁标准溶液重复性试验

（2）样本重复性与准确度试验

准确度是指测得值与真值的符合程度，在酶联免疫测定中，准确度常以回收率表示，精密度常以变异系数来表示。在空白乳粉或液态奶样品中，添加黄曲霉毒素M₁至终浓度为0.05、0.5、1.5μg/L，每个浓度各10个平行，测定3批。计算平均值、添加回收率及批内与批间变异系数。结果见表2。

$\mathrm{CV}(\%)=\frac{\mathrm{SD}}{X}\×100$

表2样本重复性与准确度试验结果

结果表明纯牛奶、乳粉样本的添加回收率在77～108%之间，批内变异系数在2.5～8.5%之间，批间变异系数在7.9～12.1%之间，符合国家对于试剂盒各项指标的标准。

实施例6保存期试验

（1）将实施例3的试剂盒放置于2～8℃，分别取放置0、2、4、6、8、9、10、11和12个月的试剂盒，对黄曲霉毒素M₁标准品（0.1μg/L）的发光值、50%抑制浓度、添加回收率、批内变异系数各参数进行测定。

（2）将试剂盒在37℃保存的条件下放置12天，每天对黄曲霉毒素M₁标准品0.1μg/L的发光值、50%抑制浓度、添加回收率、批内变异系数各参数进行测定。

（3）将试剂盒在-20℃冰箱保存12天，每天对黄曲霉毒素M₁标准样品（0.1μg/L）的发光值、50%抑制浓度、添加回收率、批内变异系数各参数进行测定。

从结果可看出，经过三种条件保存试验，黄曲霉毒素M₁标准品（0.1μg/L）的发光值下降小于6%，50%抑制率在0.03～0.06μg/L之间添加回收率在77～108%之间；批内变异系数小于10%；各项指标均符合质量要求，因此，试剂盒可以在2～8℃保存12个月。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种黄曲霉毒素M₁的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述检测试剂盒包括包被有黄曲霉毒素M₁抗原的化学发光酶标板，黄曲霉毒素M₁标准品，黄曲霉毒素M₁抗体，酶标抗抗体，化学发光液和洗涤液。

2.根据权利要求1所述的黄曲霉毒素M₁的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述的化学发光酶标板为96孔可拆不透明白色发光板；所述的黄曲霉毒素M₁抗原为黄曲霉毒素M₁与牛血清白蛋白的偶联物；所述的黄曲霉毒素M₁抗原的包被浓度为0.625mg/L。

3.根据权利要求1所述的黄曲霉毒素M₁的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述的黄曲霉毒素M₁标准品的浓度为1mg/mL，使用时用0.01mol/L PBST将标准品稀释成浓度为0.0、0.01、0.03、0.1、0.3、1、3μg/L的一系列黄曲霉毒素M₁标准品溶液。

4.根据权利要求1所述的黄曲霉毒素M₁的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：

所述的黄曲霉毒素M₁抗体为黄曲霉毒素M₁单克隆抗体或兔多克隆抗体；

所述的酶标抗抗体为辣根过氧化酶标记的羊抗鼠IgG或羊抗兔IgG。

5.根据权利要求4所述的黄曲霉毒素M₁的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：

所述的黄曲霉毒素M₁抗体为黄曲霉毒素M₁单克隆抗体，其原浓度为2mg/mL，使用时用0.01mol/L PBST稀释6000倍；

所述的酶标抗抗体为辣根过氧化酶标记的羊抗鼠IgG，其原浓度为10mg/mL，使用时用0.01mol/L PBST稀释6000倍。

6.根据权利要求1所述的黄曲霉毒素M₁的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述的化学发光液由A液和B液组成，A液为将20mg对碘苯酚、8mg鲁米诺、1.21g Tris溶于100mL去离子水，用盐酸调pH至8.4得到；B液为将体积分数0.40%H₂O₂、1.21g Tris溶于100mL去离子水，用盐酸调pH至7.0得到；使用时将A液和B液按体积比1:1的比例混合。

7.根据权利要求1所述的黄曲霉毒素M₁的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述的洗涤液为20倍浓缩洗涤液，为含有体积浓度0.5%Tween20的pH7.40.4mol/L的磷酸盐缓冲液，使用时用去离子水稀释成1倍洗涤液。

8.权利要求1～7任一项所述的黄曲霉毒素M₁的化学发光酶联免疫检测试剂盒的使用方法，其特征在于包含如下步骤：

（1）将试剂盒置于15～35℃平衡30min以上；

（2）取出化学发光酶标板，往标准孔中加入不同浓度的黄曲霉毒素M₁标准品溶液，样品孔中加入待测样品，然后每孔加入黄曲霉毒素M₁抗体，盖上盖板膜振摇混匀，孵育；

（3）吸除板孔中的反应液，加入洗涤液洗涤，将酶标板拍干；

（4）往各孔中加入酶标抗抗体，轻拍混匀，孵育；

（5）每孔加入化学发光反应液，轻拍混匀，盖上盖板膜，1～2min后用化学发光免疫分析仪测定各孔的发光值RLU；

（6）检测结果计算与分析：抑制率（%）=B/B₀×100（%），式中：B—不同浓度黄曲霉毒素M₁标准溶液孔或样品孔的发光值；B₀—0浓度黄曲霉毒素M₁标准溶液发光值；以抑制率为纵坐标，黄曲霉毒素M₁浓度的对数为横坐标绘制标准曲线，从而确定样品中黄曲霉毒素M₁的含量。

9.根据权利要求8所述的黄曲霉毒素M₁的化学发光酶联免疫检测试剂盒的使用方法，其特征在于步骤（2）中所述的待测样品为液态乳或乳粉，其处理方法如下：

液态乳：将待测液态乳摇匀，称取5.0g试样到10mL离心管中，2～8℃以4000rpm的转速离心10min，用脱脂棉签除去上层脂肪；加入150μL0.36mol/L亚铁氰化钾溶液，短暂涡旋混合后加入150μL1.04mol/L硫酸锌溶液，涡旋振荡3min后，于10～15℃以4000rpm的转速离心10min，上清液即可用于检测；

乳粉：称取10.0g待测乳粉于小烧杯中，加50℃热水溶解，转移到100mL容量瓶中，定容至刻度，以下处理同液态乳。

10.根据权利要求8所述的黄曲霉毒素M₁的化学发光酶联免疫检测试剂盒的使用方法，其特征在于包含如下步骤：

（1）将试剂盒置于室温平衡30min以上，用0.01mol/L PBST将黄曲霉毒素M₁标准品稀释成浓度分别为0.0、0.01、0.03、0.1、0.3、1、3μg/L的黄曲霉毒素M₁标准品溶液；

（2）取出化学发光酶标板，在标准孔加入50μL不同浓度的黄曲霉毒素M₁标准品溶液，样品孔加入50μL待测样品，然后每孔加入50μL稀释好的黄曲霉毒素M₁单克隆抗体，盖上盖板膜在微量振荡器上振摇10min后，置于37℃孵育50min；

（3）吸除板孔中的反应液，各孔加入洗涤液约300μL，静置20秒左右，除去其中液体，如此共洗5次，最后一次将板拍干；也可用自动洗板机洗板5次，洗完后将微孔架倒置在吸水纸上拍打以保证完全除去孔中的液体；

（4）往各孔中加入100μL稀释好的辣根过氧化酶标记的羊抗鼠IgG酶标抗抗体，轻拍混匀后，置于37℃孵育30min；

（5）每孔加入100μL A液与B液等体积混合后的化学发光液，轻拍混匀，盖上盖板膜，1～2min后用化学发光免疫分析仪测定各孔的发光值RLU，保存数据；

（6）检测结果计算与分析：抑制率（%）=B/B₀×100（%），式中：B—不同浓度黄曲霉毒素M₁标准溶液孔或样品孔的发光值；B₀—0浓度黄曲霉毒素M₁标准溶液发光值；以抑制率为纵坐标，黄曲霉毒素M₁浓度的对数为横坐标绘制标准曲线，从而确定样品中黄曲霉毒素M₁的含量。