CN101556284A - 甲型肝炎病毒抗原检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种甲型肝炎病毒抗原检测方法。即采用长臂生物素标记HAV－IgG，以辣根过氧化物酶标记链霉亲和素作放大系统，对甲型肝炎病毒抗原进行检测时，由于长臂生物素比一般生物素有更长的间臂，能减少空间位阻，使几个生物素化分子能同时与一个亲和素复合物结合，加之长臂生物素为水溶性生物素，直接标记抗甲型肝炎病毒抗体可减少免疫检测中的步骤，缩短检测时间，即由通常的2天缩短为全程检测只需3.5小时，并可通过降低交叉反应而降低背景，提高检测灵敏度；另外，由于辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素与亲和素不同，其分子量大约为60000，不含碳水化合物，非特异性结合较亲和素低，所以具有提高灵敏度及特异性的效果。

Description

甲型肝炎病毒抗原检测方法

技术领域

本发明涉及甲型肝炎病毒(HAV)抗原的检测方法，属于生物学技术领域。

背景技术

在甲型肝炎减毒活疫苗、甲型肝炎灭活疫苗及相关病毒的研究工作中，均需进行甲型肝炎病毒抗原的检测，并且由于甲型肝炎病毒HAV不能产生细胞病变(CPE)，所以在病毒感染性滴度检测时，待检测病毒在细胞上增殖完成后，必须用物理或化学方法使病毒释放，再用相关方法进行甲型肝炎病毒抗原(HAAg)检测。目前市面上并没有专门的甲型肝炎病毒抗原检测试剂盒出售，对抗原的检测均由各生产厂家或各科研机构根据自身需要使用不同的方法。根据文献检索，目前的甲型肝炎病毒抗原检测法有：逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法，固相杂交酶联显色法(RT-PCR-ELISA)，使用单克隆抗体的双抗体夹心法，将甲型肝炎病毒IgM抗体诊断试剂盒改良后用于甲型肝炎病毒抗原检测的间接法(ELISA)，生物素-亲和素-生物素标记辣根过氧化物酶复合物法(ABPC法)。

RT-PCR、RT-PCR-ELISA法检测虽然检测灵敏度好，但需要专门的仪器设备，检测成本较高，且特异性受到诸多因素的影响；双抗体夹心法(ELISA)操作方便，但需要用不同株单克隆抗体分别包被和标记，而单克隆抗体筛选制备不易，普通试验室很难建立；将甲型肝炎病毒IgM抗体诊断试剂盒改良后用于甲型肝炎病毒抗原检测的间接法(ELISA)，则不是专门针对甲型肝炎病毒抗原的检测方法，灵敏度不高，检测时间相对较长，检测步骤多，影响因素也多。而有报道的生物素-亲和素-生物素化辣根过氧化物酶法，虽然使用了生物素来标记抗体，但其使用的是普通脂溶性生物素，需要用有机溶剂溶解后才能用于标记，且其使用亲和素结合的生物素化辣根酶复合物作为酶放大系统，复合物的浓度配比麻烦，步骤多，检测时间长。

发明内容

针对甲型肝炎病毒抗原检测存在的上述现状，以及甲型肝炎疫苗生产检定中要对甲型肝炎病毒抗原进行大量检测的情况，本发明利用长臂生物素标记HAV-IgG，以辣根过氧化物酶标记链霉亲和素作放大系统，提供一种特异性高、灵敏度高、使用方便、用途广泛的甲型肝炎病毒抗原检测方法，应用于甲型肝炎疫苗生产及质量检定，获得了较好的效果，本方法也可应用于甲型肝炎病毒的其他科研工作及临床检验。

本发明通过下列技术方案完成：一种甲型肝炎病毒抗原检测方法，其特征在于经过下列步骤：

A、按50～150μl/孔的量，将待检甲型肝炎病毒抗原、抗原阳性对照和抗原阴性对照分别加入酶标板的孔中，并留空白调零孔，放入湿盒中，于37℃保温1～3小时后，洗板3～5次；

B、按50～150μl/孔的量，在A步骤的酶标板的各孔中，加入稀释度为1∶500～3000的长臂生物素标记HAV抗体使用液，放入湿盒中，于37℃保温0.5～1小时后洗板3～5次；

C、按50～150μl/孔的量，在B步骤的酶标板的各孔中，加入稀释度为1∶2000～10000的辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素使用液，放入湿盒中，于37℃保温0.5～1小时后洗板3～5次；

D、在C步骤的酶标板的各孔中，分别加入TMB显色液A和B各50μl/孔，混匀，放入湿盒中，37℃保温10～15分钟；

E、在D步骤的酶标板的各孔中，按50～100μl/孔的量加入终止液后置于酶标仪上，在450nm波长下，用空白孔调零后检测吸光度A值，即得检测结果。

根据检测结果进行下列判定：

阳性对照平均A值-阴性对照平均A值≥0.4时，则试验成立，反之应重试。

Cutoff值＝阴性对照的平均A值×2.1(阴性对照的平均A值大于0.05，按实际值计算；若阴性对照的平均A值小于0.05时，按0.05计算)。

样品A值≥Cutoff值，该样品孔判定为HAV阳性，样品A值＜Cutoff值，该样品孔判定为HAV阴性。

所述B步骤的长臂生物素标记HAV抗体经下列方法制备：

a、按长臂生物素∶甲型肝炎病毒抗体＝1∶5～20克分子比的比例，将市购的长臂生物素用注射用水溶解后，与甲型肝炎病毒抗体混合，得混合体，于室温下放置0.5～1.0小时，或2～8℃温度下放置1～3小时；

b、用磷酸盐缓冲液于2～8℃温度下透析上述a步骤的混合体并过夜，加等体积甘油混匀，得长臂生物素标记HAV抗体，-20℃以下保存备用。

所述C步骤的辣根过氧化物酶标记链霉亲和素为市购产品。

所述酶标板预先经过下列方法制备：

1)酶标板包被：将纯化的HAV-IgG用碳酸盐缓冲液稀释至5-20μg/ml，按50～150μl/孔的量加入到聚苯乙烯板中，2～8℃过夜，洗板3～5次；

2)酶标板封闭：按150～250μl/孔的量加入封闭液，2～8℃过夜，对酶标板进行封闭，洗板3～5次，晾干，冰箱保存备用。

所述洗板用PBS洗液在洗板机上洗板或者手工洗板。

所述磷酸盐缓冲液PBS、PBS洗液、碳酸盐缓冲液、终止液、TMB显色液A和B、封闭液均为现有技术的常规用液。

本发明具有下列优点和效果：采用上述方案，即采用长臂生物素标记HAV-IgG，以辣根过氧化物酶标记链霉亲和素作放大系统，对甲型肝炎病毒抗原进行检测时，由于长臂生物素比一般生物素有更长的间臂，能减少空间位阻，使几个生物素化分子能同时与一个亲和素复合物结合，加之长臂生物素为水溶性生物素，直接标记抗甲型肝炎病毒抗体可减少免疫检测中的步骤，缩短检测时间，即由通常的2天缩短为全程检测只需3.5小时，并可通过降低交叉反应而降低背景，提高检测灵敏度；另外，由于辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素与亲和素不同，其分子量大约为60000，不含碳水化合物，非特异性结合较亲和素低，所以具有提高灵敏度及特异性的效果。本发明所建立的检测方法是一种特异性好、灵敏度高、方便快捷的甲型肝炎病毒抗原检测方法。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明做进一步描述。

实施例

一、抗HAV血清的制备

1)用一次性注射器吸取1ml组织培养的HAV抗原(520EU/ml)，排净空气后对猴或其它适宜动物进行免疫注射；

2)在2、3、4周采血，并用甲型肝炎病毒抗体诊断试剂盒进行HAV抗体效价检测。效价低于1∶4000时，须进行加强免疫；

3)当抗-HAV的效价达1∶4000以上时，即可通过颈动脉采血，分离血清，-20℃以下保存待用。

二、HAV-IgG分离纯化

1)取市购蛋白A或蛋白A/G亲和层析柱，室温放置平衡30分钟，用5倍柱体积的平衡液对层析柱进行平衡；

2)将待纯化的上述一步骤3)的血清与常规平衡液按1∶1的体积比混合后上样，用10倍柱体积的平衡液洗脱杂蛋白，留下目的蛋白；

3)用10倍柱体积的洗脱液将目的蛋白从亲和柱上洗脱下来，收集洗脱峰，用磷酸盐缓冲液PBS透析过夜；

4)用lowry法测定蛋白含量，-20℃以下保存待用。

三、长臂生物素标记HAV抗体的制备

1)按长臂生物素∶甲型肝炎病毒抗体＝1∶10克分子比的比例，将市购的长臂生物素用注射用水溶解后，与甲型肝炎病毒抗体混合，得混合体，于室温下放置0.5小时；

2)用磷酸盐缓冲液PBS于5℃温度下透析上述a步骤的混合体并过夜，加等体积甘油混匀，得长臂生物素标记HAV抗体，-20℃以下保存备用。

四、甲型肝炎病毒抗原的检测

1)酶标检测板包被：将纯化的HAV-IgG用碳酸盐缓冲液稀释至10μg/ml，按100μl/孔的量加入到聚苯乙烯板中，5℃过夜，用PBS洗液在洗板机上洗板5次；

2)酶标检测板封闭：按200μl/孔的量加入封闭液，5℃过夜，对酶标板进行封闭，用PBS洗液在洗板机上洗板5次，晾干，冰箱保存备用；

3)将长臂生物素标记抗体按1∶100、1∶200、1∶400......1∶5000的稀释度进行稀释，同时将辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素按上述相同稀释度进行稀释，用常规棋盘法试验确定它们的最佳使用稀释度，即长臂生物素标记HAV抗体使用液的稀释度为1∶500～3000，辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素使用稀释度为1∶2000～10000；

4)先将待检的甲型肝炎病毒抗原样品用PBS稀释液进行下列不同稀释度的系列稀释：1∶2、1∶4、1∶8......1∶2048，具体稀释如下：取1ml待检甲型肝炎病毒抗原样品加入1mlPBS稀释液，混匀，即成1∶2样品；取1ml1∶2样品加入1mlPBS稀释液即成1∶4样品，依次对倍稀释至1∶2048；用微量移液器将稀释好的甲型肝炎病毒抗原待检样品从高稀释度(1∶2048)开始依次加入酶标板中，100μl/孔，同时在酶标板的另外的孔中加入抗原阳性对照、抗原阴性对照，每个对照各加2孔，并留1孔作为空白调零孔，放入湿盒中，37℃保温2小时，用PBS洗液在洗板机上或用手工洗板5次；

5)在上述酶标板的各孔中加入稀释度为1∶800的长臂生物素标记HAV抗体使用液，100μl/孔，放入湿盒中，37℃保温0.5小时，用PBS洗液在洗板机上或手工洗板5次；

6)在上述酶标板的各孔中加入稀释度为1∶5000辣根过氧化物酶标记链霉亲和素使用液，100μl/孔，放入湿盒中，37℃保温0.5小时，用PBS洗液在洗板机上或手工洗板5次；

7)在上述酶标板的各孔中分别加入TMB显色液A和B各50μl/孔，混匀，放入湿盒中，37℃保温10分钟；

8)在上述酶标板的各孔中加入终止液，50μl/孔，置于酶标仪在450nm波长下，用空白孔调零后检测吸光度A值，结果见表1。

9)结果判定：

阳性对照平均A值(1.848)-阴性对照平均A值(0.052)＝1.796，大于0.4，本次试验成立。

Cutoff值＝0.052×2.1＝0.109，(阴性对照的平均A值大于0.05，按实际值计算)。按照样品A值≥Cutoff值，该样品判定为HAV阳性样品，样品A值＜Cutoff值，为阴性，该样品判定为HAV阴性样品。则该样品1∶2-1∶1024稀释度均为阳性、1∶2048为阴性，故该甲型肝炎病毒抗原效价检测为1∶1024。

所用溶液如下：

1、磷酸盐缓冲液PBS：磷酸氢二钠2.9g，磷酸二氢钾0.2g，氯化钠8g，加注射用水至1000ml。

2、PBS洗液：在1000ml磷酸盐缓冲液PBS中，加入0.05％吐温20。

3、碳酸盐缓冲液：无水碳酸钠1.6g，碳酸氢钠2.93g，加注射用水至1000ml。

4、终止液：浓硫酸54ml，加注射用水至500ml。

5、TMB显色液A：TMB 50mg，二甲基亚砜50ml，加注射用水50ml。

6、TMB显色液B：醋酸钠6g，冰醋酸0.2ml，双氧水，2.5ml，加注射用水至500ml。

7、封闭液：在1000ml磷酸盐缓冲液PBS中，加入20克牛血清白蛋白，溶解混匀。

本实施例的优点

(1)从检测时间方面分析，本发明检测方法与现行检测试剂法相比，检测时间由通常的2天缩短为全程检测只需3.5小时，见表2。

(2)两种检测方法特异性与灵敏性综合分析

1)用本发明检测方法进行甲型肝炎病毒抗原滴度检测时，特异性显示为所有HAV阳性样品P/N值明显高于现有的检测试剂法，阴阳性对比明显，梯度、线性较好(表3)。两者有显著性差异(t＝5.123，p＝0.007＜0.01)；且用本发明方法对其他相关病毒进行检测无交叉情况出现(表4)。

2.用本发明之方法进行甲型肝炎抗原滴度检测时，其灵敏度高于现行方法。

用确立的程序对HAV抗原标准对照(1∶2048)、爱巴苏灭活疫苗(24IU/0.5ml)和现有疫苗样品进行检测，并与现行检测法进行对比。比较结果显示，本发明的甲型肝炎病毒抗原检测方法的结果高于现行检测法1-3个稀释度，阴性对照低，见表5。

表1实施例1的检测A值

	1	2	3	4	5
						A	HAV1∶2*	HAV1∶5120.291
B	HAV1∶4*	HAV1∶10240.176
						C	HAV1∶83.247	HAV1∶20480.087
D	HAV1∶162.584	阳性对照1.837
						E	HAV1∶321.833	阳性对照1.858
F	HAV1∶641.152	阴性对照0.051
						G	HAV1∶1280.789	阴性对照0.053
H	HAV1∶2560.534	空白孔0.000

表2两种甲型肝炎抗原检测方法比较

表3对比试验P/N(P/C)值比较

注：POD为阳性对照平均OD值；COD为细胞对照平均OD值；NOD为阴性对照平均OD值。

用本发明之方法检测甲型肝炎病毒感染性滴度时，其特异性与灵敏性综合分析(POD/COD值)优于现行检测法(表6)，两者有显著性差异(t＝3.367，p＝0.028＜0.05)。

用本发明之方法检测20个感染性滴度样品，其中10个高于现行检测法，占50.0％，10个结果与现行检测法一致，占50.0％，两种方法所检测结果之间差异有统计学意义(t＝3.529，p＝0.002＜0.01)；且本发明之方法阳性对照OD值高于现行检测法(t＝3.971，p＝0.017＜0.05)，本发明之方法，细胞对照OD值低于现行检测法(t＝3.360.p＝0.028＜0.05)。

用本发明方法检测18份抗原滴度样品，其中12份高于现行检测法(为总数的66.7％)，4份与现行检测法相同(22.2％)，1份样品全阴未测出、1份样品常规法有跳孔无法判断，无比较结果者占11.1，在检测灵敏度相同的情况下，检测结果显示：本发明方法明显优于现行检测法，两方法检测结果差异有统计学意义(t＝5.078，p＝0.0002＜0.01)。从线性相关度(R2)分析，本发明之方法也优于现行检测法，且差异有统计学意义(t＝6.321，p＝0.000＜0.01)。本发明之方法阳性对照的OD值高于现行检测法，差异有统计学意义(t＝5.926，p＝0.010＜0.05)；同时本发明之方法，阴性对照的OD值现行检测法，差异有统计学意义(t＝4.119，p＝0.026＜0.05)。

本发明方法专门用于检测甲型肝炎病毒抗原，与现行检测法相比，检测灵敏度和特异性都有明显提高，全程检测时间3.5小时，比现行检测法所需的两天缩短为3.5小时，有利于疫苗生产，特别在疫苗稀配分装质量控制上有较强优势，能让稀释-分装之间的等待时间明显缩短，且P/N高，有利于结果判定。在保证质量的同时，还可提高产量。与普通方法相比，本发明之方法更适合于甲型肝炎疫苗检定工作，也可应用于甲乙肝联合疫苗的检测工作及相关的甲型肝炎病毒研究工作。目前市场上并没有甲型肝炎病毒检测试剂盒，可利用此方法开发为一种多用途诊断试剂产品，弥补市场空白。

表5.两种方法对HAAg同步检测对比分析

表4甲型肝炎病毒抗原检测法(ELISA)交叉试验结果

表6两种方法检测HAV感染性滴度比较

Claims (6)

1、一种甲型肝炎病毒抗原检测方法，其特征在于经过下列步骤：

A、按50～150μl/孔的量，将待检甲型肝炎病毒抗原、抗原阳性对照和抗原阴性对照分别加入酶标板的孔中，并留空白调零孔，放入湿盒中，于37℃保温1～3小时后，洗板3～5次；

B、按50～150μl/孔的量，在A步骤的酶标板的各孔中，加入稀释度为1∶500～3000的长臂生物素标记HAV抗体使用液，放入湿盒中，于37℃保温0.5～1小时后洗板3～5次；

C、按50～150μl/孔的量，在B步骤的酶标板的各孔中，加入稀释度为1∶2000～10000的辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素使用液，放入湿盒中，于37℃保温0.5～1小时后洗板3～5次；

D、在C步骤的酶标板的各孔中，分别加入TMB显色液A和B各50μl/孔，混匀，放入湿盒中，37℃保温10～15分钟；

E、在D步骤的酶标板的各孔中，按50～100μl/孔的量加入终止液后置于酶标仪上，在450nm波长下，用空白孔调零后检测吸光度A值，即得检测结果。

2、如权利要求1所述的甲型肝炎病毒抗原检测方法，其特征在于所述B步骤的长臂生物素标记HAV抗体经下列方法制备：

a、按长臂生物素∶甲型肝炎病毒抗体＝1∶5～20克分子比的比例，将市购的长臂生物素用注射用水溶解后，与甲型肝炎病毒抗体混合，得混合体，于室温下放置0.5～1.0小时，或2～8℃温度下放置1～3小时；

b、用磷酸盐缓冲液于2～8℃温度下透析上述a步骤的混合体并过夜，加等体积甘油混匀，得长臂生物素标记HAV抗体，-20℃以下保存备用。

3、如权利要求1所述的甲型肝炎病毒抗原检测方法，其特征在于所述C步骤的辣根过氧化物酶标记链霉亲和素为市购产品。

4、如权利要求1所述的甲型肝炎病毒抗原检测方法，其特征在于所述酶标板预先经过下列方法制备：

1)酶标板包被：将纯化的HAV-IgG用碳酸盐缓冲液稀释至5-20μg/ml，按50～150μl/孔的量加入到聚苯乙烯板中，2～8℃过夜，洗板3～5次；

2)酶标板封闭：按150～250μl/孔的量加入封闭液，2～8℃过夜，对酶标板进行封闭，洗板3～5次，晾干，冰箱保存备用。

5、如权利要求1所述的甲型肝炎病毒抗原检测方法，其特征在于所述洗板用PBS洗液在洗板机上洗板或者手工洗板。

6、如权利要求1所述的甲型肝炎病毒抗原检测方法，其特征在于所述磷酸盐缓冲液PBS、PBS洗液、碳酸盐缓冲液、终止液、TMB显色液A和B、封闭液均为现有技术的常规用液。