CN101187666A - 基于elisa法的免疫共沉淀试验方法 - Google Patents
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Abstract
基于ELISA法的免疫共沉淀试验方法，涉及生物技术，将免疫共沉淀法和酶联免疫吸附检测法结合起来，即，利用酶联免疫吸附检测法中的96孔塑料板来捕获目的蛋白(蛋白质A)—兴趣蛋白(蛋白质B)-抗兴趣蛋白抗体复合物，然后用抗兴趣蛋白抗体相对应的辣根过氧化物酶标记二抗，显色，酶标仪检测。本发明简化了实验过程，提高了检测系统的敏感度，具有稳定性和可重复性的特点，降低了实验成本，提高了实验效率。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术，特指一种基于ELISA法的免疫共沉淀试验方法，具体地讲指一种快速、高通量、定量检测蛋白质与蛋白质间相互作用的免疫共沉淀-酶联试验技术，建立板式固相免疫共沉淀-酶联试验的定量检测方法，用于快速筛查和定量检测共沉淀蛋白质。
背景技术
目前，研究蛋白质间的相互作用有多种方法，常用的有酵母双杂交系统、免疫沉淀、Pull-down等方法。其中，免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)是相对稳定、简便的方法，也是在蛋白质组的科学研究中的得到了广泛应用的一种方法，它是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础来研究蛋白质相互作用的经典方法，能够确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。但这种方法还有三个明显缺陷：一是两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；二是方法本身具有冒险性，必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果；三是操作过程复杂，浪费较多的蛋白质样品，只能检测到纳克级(ng)，所以灵敏度较低。另外，与上述其他几种研究细胞内的蛋白质间相互作用的方法一样具有医学一些不足之处，如操作程序复杂，技术操作要求高，所用耗材昂贵，费事、费时、重现性差等。这已经成为蛋白质组研究进程的瓶颈，兹需一种能够快速、定量、高通量筛查蛋白质与蛋白质间相互作用的检测方法。
尽管也有学者对上述一些方法作了一些改进，或者发明了一些新的检测方法，依然存在耗材昂贵，费事、费时、重现性差的不足之处，如意大利学者Persani等在《自然-临床实践内分泌代谢杂志》上发表的题为“技术的洞察：现代检测蛋白质与蛋白质相互作用的方法显示有功能的促甲状腺素受体的聚合结构”(Persani L，Calebiro D，Bonomi M.Technology Insight：modern methods to monitor protein-protein interactions reveal functional TSH receptoroligomerization，Nat Clin Pract Endocrinol Metab.2007，3(2)：180-90.)文章中，总结了国外学者发明的一些用于在活细胞内观察两种蛋白质的相互作用情况的现代检测方法，这些技术是基于福斯特共振荧光能量转移的物理学检测方法。这些方法的优势是能够实时观察活细胞内的蛋白质间的相互作用，但技术要求高，且设备昂贵。
目前，最简单的研究两蛋白质相互作用的是酶联免疫吸附检测法(ELISA)，在体外验证两种蛋白质的相互作用，具有高通量、速度快、灵敏度高、重复性好、定量等优点。然而，该方法目前仅用于定量检测某一种蛋白质的含量，其优势未能充分发挥出来。本发明就是利用了ELISA的原理及其上述优势来弥补免疫共沉淀的不足之处，发展了一个定量、快速、高通量检测蛋白质间的相互作用的方法。
发明内容
针对上述问题，本发明提出一种新的技术方案，将免疫共沉淀法和酶联免疫吸附检测法结合起来，即，利用酶联免疫吸附检测法中的96孔塑料板来捕获目的蛋白(蛋白质A)-兴趣蛋白(蛋白质B)-抗兴趣蛋白抗体复合物，然后用抗兴趣蛋白抗体相对应的辣根过氧化物酶标记二抗，显色，酶标仪检测。本发明简化了实验过程，提高了检测系统的敏感度，具有稳定性和可重复性的特点，降低了实验成本，提高了实验效率。
本发明可通过下述技术方案实现的：
(1)细胞内总蛋白的提取：用磷酸缓冲液(PBS)洗涤细胞，然后，在细胞中加入细胞裂解液，将细胞离心，取上清液备用；
(2)用蛋白质A的抗体包被96孔塑料板：选择与蛋白质A相应的抗体，抗体从商业公司订购，用碳酸盐缓冲液或磷酸盐缓冲液稀释抗体，稀释浓度为1～10μg/ml，再将稀释液加入到96孔塑料板中进行包被，每孔加100～200μl，37℃2～6小时或4℃过夜；
(3)封闭：用1～2wt％牛血清白蛋白(BSA)溶液封闭余下的空白位点，37℃中孵育4～6小时；
(4)加样：将步骤1中的上清液用磷酸盐缓冲液稀释，总蛋白浓度为1～10μg/ml，再将稀释液加入到步骤2中已包被的塑料板的反应孔中，每孔加100～200μl，在37℃中孵育1～2小时，同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔；
(5)加入与蛋白质B的一抗：选择与蛋白质B相应的抗体，抗体从商业公司订购，磷酸盐缓冲液稀释抗体，浓度为10～20μg/ml，于各反应孔中，加入稀释的蛋白质B的抗体100～150μl，37℃孵育0.5～1小时，洗涤；
(6)于各反应孔中，加入与蛋白质B的抗体相应的辣根过氧化物酶标记二抗，37℃孵育0.5～1小时，洗涤；
(7)加底物液显色：于各反应孔中加入显色底物溶液100～150μl，37℃放置10～30分钟；
(8)终止反应：于各反应孔中加入0.1～0.2mmol硫酸。
(9)结果判定：在酶标仪检测仪上，检测吸光度。
步骤2中包被条件优选为每孔100μl，4℃过夜；抗体的稀释浓度优选1.25μg/ml，2.5μg/ml，5μg/ml，10μg/ml。
步骤3中牛血清白蛋白(BSA)溶液优选2wt％，孵育时间优选6小时；
步骤4中稀释的上清液中总蛋白浓度优选1μg/ml，加入到96孔塑料板的体积优选为每孔100μl；孵育时间优选2小时；
步骤5中抗体的稀释浓度优选10μg/ml，加入到96孔塑料板的体积优选为每孔100μl，孵育优选1小时；
步骤6中孵育优选1小时；
步骤7中底物液显色溶液为四甲基联苯胺(TMB)，加入到96孔塑料板的体积为每孔100μl，反应时间为20分钟；
步骤8中硫酸加入到96孔塑料板的量优选为每孔50μl。
本发明是结合免疫共沉淀法和酶联免疫吸附检测法两种方法的原理，简化实验过程，提高检测系统的敏感度，具有稳定性和可重复性的特点，降低了实验成本，提高了实验效率，且可以对所需进行研究的蛋白质进行任意组合。提供一种快速、定量分析两种蛋白质与蛋白质相互作用，高通量筛查一种蛋白质与其他蛋白质间的相互作用技术方案。具体优势可见列表。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步阐述，但并不限制本发明范围。
实施例
1.1细胞培养
人脑胶质瘤细胞株U251购自中科院上海细胞与生化所，用含10％小牛血清(GIBCO)的培养基(DMEM，GIBCO)培养液，37℃5％CO2培养细胞，细胞长满后，以2×105个/ml浓度接种到24孔板中，每孔0.5ml。37℃5％CO2培养48小时后，细胞换用无血清培养基培养细胞24小时，细胞换用含100ng神经生长因子(NGF)DMEM继续培养细胞1小时。
1.2用免疫荧光双标技术确定磷酸化的酪氨酸激酶A(pTrkA)和神经生长因子(NGF)在细胞内的共定位。
为了证明上述两种蛋白质在细胞内可能是相互作用的，首先用免疫荧光双标技术确定磷酸化的酪氨酸激酶A(pTrkA)和神经生长因子(NGF)在细胞内的是否共定位，这是进一步验证本发明的方法有效性的前提。具体操作步骤如下：
1.2.1细胞固定将1.1所述细胞在1h各取出一组用4％多聚甲醛固定。
1.2.2免疫荧光染色：上述固定后细胞，将上述细胞吸去培养基，洗涤，固定。分别用绿色荧光(FITC)标记的二抗(Sigma)结合兔抗人的NGF抗体(Santa Cruz)，用Cy3红色荧光标记的二抗结合羊抗人的磷酸化的TrkA(pTrkA)抗体(Santa Cruz)，在激光共聚焦显微镜下观察受体与他们的共定位情况。
1.2.3激光共聚焦显微镜所用激光共聚焦显微镜型号为MRC-1024(BioRad，Watford，UK)。共聚焦系统由Bio-Rad公司提供的软件控制。从中可以看出红色荧光(Cy3)表示pTrkA在细胞内的分布，绿色荧光(FITC)表示NGF在细胞内的分布，蓝色荧光(Hoechst 33342)染细胞核，Merge是指激光共聚焦后的结果，图中可见金黄色颗粒，表明pTrkA与NGF在细胞内是共定位的，说明这两种蛋白质可能是相互作用的。
1.3.1用本发明的方法定量检测pTrkA与NGF两种蛋白质在细胞内的相互作用情况。
1.3.1细胞内总蛋白的提取①用预冷的磷酸缓冲液(PBS)洗涤细胞两次，最后一次吸干PBS；②加入预冷的细胞裂解液(RIPABuffer)(细胞浓度为107/ml)；③用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下，把悬液转到1.5离心管(EP管)中，4℃，缓慢晃动15min(EP管插冰上，置水平摇床上)。④4℃，14000g离心15min，立即将上清转移到一个新的离心管中，储存于-80℃超低温冰箱中，待测。
1.3.2基于ELISA法的免疫共沉淀试验：①用羊抗人的磷酸化TrkA的抗体包被96孔塑料板，采用被动吸附法，包被缓冲液为PH 9.6碳酸盐。用包被缓冲液将欲包被的磷酸化的TrkA抗体稀释成1.25μg/ml，2.5μg/ml，5μg/ml，10μg/ml，包被体积为100μl/well。包被条件4℃过夜。②封闭(blocking)：封闭是指用高浓度的蛋白溶液封闭余下的空白位点。其目的是降低本底，封闭缓冲液为2wt％BSA，37℃中孵育4小时。③加样：用PBS将1.3.1中所述的上清液稀释到1μg/ml，以降低裂解液中去垢剂的浓度，加一定稀释的待检样品100μl于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时，然后洗涤，同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔。④加兔抗人的NGF一抗：于各反应孔中，加入新鲜稀释的NGF的抗体100μl，浓度为10μg/ml。37℃孵育1小时，洗涤。⑤加与NGF的抗体相应的辣根过氧化物酶标记二抗，37℃孵育1小时，洗涤。⑥加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的四甲基联苯胺(TMB)底物溶液0.1ml，37℃反应20分钟。⑦终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。⑧结果判定：在ELISA检测仪上，于450nm处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，从中可以看出随着pTrkA抗体包被浓度的增加，NGF的抗体的浓度也增加，说明pTrkA和NGF在细胞内是以符合物的形式存在的。
1.4用免疫共沉淀试验验证上述实验结果①准备琼脂糖珠(Protein A agarose)，用PBS洗两遍珠子，然后用PBS配制成50％浓度，建议减掉枪尖部分，避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠；②每1ml总蛋白中加入100μl Protein A琼脂糖珠(50％)，4℃摇晃10min(EP管插冰上，置水平摇床上)，以去除非特异性杂蛋白，降低背景；③4℃，14000g离心15min，将上清转移到一个新的离心管中，去除Protein A珠子④用PBS将总蛋白稀释到1μg/μl，以降低裂解液中去垢剂的浓度；⑤加入一定体积的羊抗人磷酸化TrkA的抗体到500μl总蛋白中，4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温2h；⑥加入100μl Protein A琼脂糖珠来捕捉抗原抗体复合物，4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温1h；⑦14000rpm瞬时离心5s，收集琼脂糖珠-抗原抗体复合物，去上清，用预冷的RIPA buffer洗3遍，800μl/遍，用60μl 2×上样缓冲液将琼脂糖珠-抗原抗体复合物悬起，轻轻混匀，缓冲液的量依据上样多少的需要而定(60μl足够上三道)；⑧将上样样品煮5min，以游离抗原，抗体，珠子，离心，将上清电泳；⑨蛋白电泳及免疫印迹：按实验室常规方法配制12％聚丙烯酰胺凝胶，根据上述样品的蛋白浓度，按各泳道蛋白总量相等的原则计算样品体积后上样、电泳、转膜，1∶200兔抗人NGF多克隆抗体(Santa Cruz)及1∶5000山羊抗兔IgG-HRP(华美生物工程公司)孵育，ECL Plus(Amersham Biosciences)作为发光底物，用胶片记录结果，其中Lane 1是用NGF的抗体沉淀NGF后，免疫印迹检测pTrkA的结果，Lane 2用pTrkA的抗体沉淀pTrkA，免疫印迹检测NGF，从中可以看出pTrkA和NGF在细胞内是以复合物的形式存在的。但是，免疫共沉淀试验检测方法所用的耗材多且昂贵，花费的时间较多，而本发明，仅需要价廉的酶标板，步骤少，且能用酶标仪定量检测。
Claims (9)
1.基于ELISA法的免疫共沉淀试验方法，其特征在于：
按照下述步骤进行：
(1)细胞内总蛋白的提取：用磷酸缓冲液洗涤细胞，然后，在细胞中加入细胞裂解液，将细胞离心，取上清液备用；
(2)用蛋白质A的抗体包被96孔塑料板：选择与蛋白质A相应的抗体，抗体从商业公司订购，用碳酸盐缓冲液或磷酸盐缓冲液稀释抗体，稀释浓度为1～10μg/ml，再将稀释液加入到96孔塑料板中进行包被，每孔加100～200μl，37℃2～6小时或4℃过夜；
(3)封闭：用1～2wt％牛血清白蛋白(BSA)溶液封闭余下的空白位点，37℃中孵育4～6小时；
(4)加样：将步骤1中的上清液稀释，总蛋白浓度为1～10μg/ml，再将稀释液加入到步骤2中已包被的塑料板的反应孔中，每孔加100～200μl，在37℃中孵育1～2小时，同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔；
(5)加入与蛋白质B的一抗：选择与蛋白质B相应的抗体，抗体从商业公司订购，磷酸盐缓冲液稀释抗体，浓度为10～20μg/ml，于各反应孔中，加入稀释的蛋白质B的抗体100～150μl，37℃孵育0.5～1小时，洗涤；
(6)于各反应孔中，加入与蛋白质B的抗体相应的辣根过氧化物酶标记二抗，37℃孵育0.5～1小时，洗涤；
(7)加底物液显色：于各反应孔中加入显色底物溶液100～150μl，37℃放置10～30分钟；
(8)终止反应：于各反应孔中加入0.1-0.2mmol硫酸；
(9)结果判定：在酶标仪检测仪上，检测吸光度。
2.根据权利要求1所述的基于ELISA法的免疫共沉淀试验方法，其特征在于：步骤2中包被条件为每孔100μl，4℃过夜；抗体的稀释浓度为1.25μg/ml，2.5μg/ml，5μg/ml，10μg/ml。
3.根据权利要求1所述的基于ELISA法的免疫共沉淀试验方法，其特征在于：步骤3中牛血清白蛋白(BSA)溶液为2wt％，孵育时间为6小时。
4.根据权利要求1所述的基于ELISA法的免疫共沉淀试验方法，其特征在于：步骤4中稀释的上清液中总蛋白浓度为1μg/ml，加入到96孔塑料板的体积为每孔100μl；孵育时间为2小时。
5.根据权利要求1所述的基于ELISA法的免疫共沉淀试验方法，其特征在于：步骤5中抗体的稀释浓度为10μg/ml，加入到96孔塑料板的体积为每孔100μl，孵育1小时。
6.根据权利要求1所述的基于ELISA法的免疫共沉淀试验方法，其特征在于：步骤6中孵育时间为1小时。
7.根据权利要求1所述的基于ELISA法的免疫共沉淀试验方法，其特征在于：步骤7中底物液显色溶液为四甲基联苯胺(TMB)，加入到96孔塑料板的体积为每孔100μl，反应时间为20分钟。
8.根据权利要求1所述的基于ELISA法的免疫共沉淀试验方法，其特征在于：步骤8中2M硫酸加入到96孔塑料板的体积为每孔50μl～100μl。
9.根据权利要求8所述的基于ELISA法的免疫共沉淀试验方法，其特征在于：步骤8中硫酸加入到96孔塑料板的量为每孔50μl。
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| CN101556285B (zh) * | 2009-05-22 | 2013-03-13 | 中国医学科学院医学生物学研究所 | 甲型肝炎灭活疫苗体外相对效力测试方法 |
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