CN104694478A - 抗人脂联素的单克隆抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株为保藏号为CGMCC No.9568的C2001或保藏号为CGMCC No.9908的6C3-Ⅰ，以及所述杂交瘤细胞株产生的抗人脂联素单克隆抗体A25或C63，本发明提供的抗人脂联素单克隆抗体可以用于在生物样本中定量或定性检测人总脂联素。本发明还提供了一种人总脂联素的检测试剂盒。本发明的人脂联素单克隆抗体质地均一、特异性强。本发明的检测人总脂联素的试剂盒可根据用途进行灵敏度和检测范围调控，不仅适用于血中人脂联素含量的测定，而且高敏BA-ELISA适宜检测唾液、尿液、乳汁、尿液及关节液以及脂肪细胞培养上清的脂联素水平。

Description

抗人脂联素的单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明属于免疫学和生物技术领域，涉及抗人脂联素的单克隆抗体及其应用，更具体地，涉及利用抗人脂联素的单克隆抗体制备的人总脂联素酶联免疫吸附分析(ELISA)试剂盒及其大批量检测样本的临床应用。

背景技术

人脂联素(Adiponectin,又名apM1,Arcp-30,AdipoQ,GBP-28)是由apM1基因编码，由244个氨基酸残基构成的蛋白分子，具有与胶原VIII、胶原X、补体C1q和TNF-α同源的结构域。人脂联素主要在脂肪细胞特异表达和分泌，是血液中含量最丰富的细胞因子，约占总血浆蛋白的0.01％，循环中的脂联素以多聚体形式存在，包括高分子量(high molecular weight，HMW,12-18聚体及更高)的主要形式、中分子的六聚体(hexameric middle molecularweight，MMW)和少量的低分子三聚体(trimeric low molecular weight，LMW)形式。不同形式的脂联素功能有所不同。

大量实验表明，脂联素具有广阔应用前景。脂联素可通过不同的途径作用于多个器官，在一些重要的生理过程中发挥关键的调控作用，包括糖脂代谢、造血、炎症、补体激活、血栓形成以及抗肿瘤细胞生长等，其分泌失调与许多疾病的发生、发展密切相关。基因扫描将2型糖尿病、代谢综合征和冠心病的易感基因均定位于3q27，正是脂联素基因所在区域，脂联素基因突变引起的低脂联素血症与上述疾病发生密切相关。一些抗糖尿病药物如噻唑烷二酮类更是把增加脂联素的表达作为2型糖尿病改善胰岛素抵抗的治疗靶点。临床研究也显示，对于肥胖患者尤其是伴胰岛素抵抗者，脂联素表达水平显著降低，体重减轻后表达上调，并伴随胰岛素敏感性提升，因此，脂联素可作为反映脂肪组织内分泌功能变化的重要标志物，不仅可以区分具有不同健康风险的肥胖亚型，还可作为减重效果评价的重要指标。对于2型糖尿病患者，血中脂联素浓度显著降低，并且降低的程度与与胰岛素抵抗及糖尿病的进展相平行，可望成为评判2型糖尿病代谢状况的新指标。大量的流行病学证据还显示，脂联素水平降低可以预测2型糖尿病、代谢综合征、冠心病以及某些肿瘤的患病风险。因此检测脂联素水平对于上述疾病的早期预测、治疗监控以及预后判断都具有重要参考价值。除血液以外，新近临床研究还发现唾液、尿液、关节液以及乳汁等样本中的脂联素水平也具有不同的检查价值和病理生理意义，从而进一步拓展了脂联素水平检测的临床意义和发展潜力。

目前，检测脂联素的定量方法主要有采用多克隆抗体的竞争性放射免疫分析方法(RIA)和双抗体夹心分析模式的酶联免疫吸附方法(ELISA)。ELISA方法灵敏度高，特异性强，标记试剂稳定，无RIA方法的放射污染和危害，因此应用广泛。但现有试剂盒大都受限于关键试剂如检测抗体不能自己生产，不仅价格昂贵，且质量和稳定性难以长期保障；有的试剂盒还受限于使用多克隆抗体，多抗供量有限且批间差异大，这样的试剂盒难以适应大批量长时期开展前瞻性临床研究的需要；同时，由于循环中存在不同聚合形式的脂联素，不同方法采用的抗体性质不同，特别是采用多克隆抗体，结合位点不同，与不同聚合形式的结合能力也不同，因此准确测定各种形式的总脂联素的浓度有很大难度；此外，大多试剂盒用途单一，没有完整考察是否适用于包括血清/浆、唾液、关节液、乳汁和细胞培养上清等各类生物样本的大批量检测，也没有详细考察能否检测包括多种分子形式脂联素的总体水平。

发明内容

因此，为了解决现有技术的不足，本发明的目的是提供一种抗人脂联素单克隆抗体，该抗人脂联素单克隆抗体能结合各种分子形式的脂联素，且质地均一、稳定性好、可长期大批量生产；本发明还提供了一种操作简便、灵敏度高、成本低、经大样本临床和流行病学验证，可适用于大批量检测血清/浆、唾液、关节液、尿液及细胞培养上清等各种生物样本中人总脂联素水平的ELISA试剂盒。此外，本发明的抗人脂联素单克隆抗体还可用于免疫组化、免疫印迹等多种免疫检测用途。

一方面，本发明提供了一种杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株为6C3-Ⅰ或C2001，其中，

杂交瘤细胞株6C3-Ⅰ的保藏号为CGMCC No.9908(分类命名：人脂联素单克隆抗体杂交瘤细胞株，保藏日期：2014年11月03日，保藏号为CGMCC No.9908，保藏地：中国院微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101)；

杂交瘤细胞株C2001的保藏号为CGMCC No.9568(分类命名：人脂联素单克隆抗体杂交瘤细胞株，保藏日期：2014年08月18日，保藏号为CGMCC No.9568，保藏地：中国院微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101)。

另一方面，本发明提供一种抗人脂联素单克隆抗体A25或C63，其中，所述抗人脂联素单克隆抗体A25由保藏号为CGMCC No.9568的杂交瘤细胞株C2001产生；

所述抗人脂联素单克隆抗体C63由保藏号为CGMCC No.9908的杂交瘤细胞株6C3-Ⅰ产生。

本发明的抗人脂联素单克隆抗体通过以下步骤制备：

1)制备抗人脂联素单克隆抗体杂交瘤细胞株；

2)检测单克隆抗体；

3)将杂交瘤的克隆化及扩大培养；

4)大量生产、纯化和鉴定单克隆抗体的性质。

再一方面，本发明提供一种使用本发明的抗人脂联素单克隆抗体在生物样本中定量和/或定性检测人脂联素分子中的应用，优选地，所述人脂联素分子为人总脂联素分子，优选地，所述人总脂联素分子为不同聚合形式的人脂联素分子，进一步优选地，所述人总脂联素分子的聚合形式为低分子的三聚体、中分子六聚体和高分子12-18聚体或更高聚体。优选地，所述生物样本为血清/浆、唾液、脑脊液、关节液、乳汁以及组织细胞提取液或细胞培养上清等含有脂联素的生物学液体样本。

优选地，所述检测的方法为半定量的非变性凝胶电泳免疫印迹法或定量的ELISA法但不限于ELISA。使用半定量的非变性凝胶电泳免疫印迹法时，将本发明的单克隆抗体用于混合人血清经非变性凝胶电泳分离后，使用免疫印迹法检测，发现本发明不同的单克隆抗体具有不同的结合能力，从而可以分辨出不同聚合形式的人脂联素。

优选地，所述方法为ELISA方法，该方法包括以下步骤：

(1)进行夹心结合试验，在单克隆抗体A25和C63中选择最佳配对单克隆抗体；

(2)将两种单克隆抗体中的一种作为固相抗体，使用酶标板包被，另一种作为标记抗体，使用生物素标记；

(3)加入酶标亲和素，检测被结合的标记；

优选地，所述ELISA方法中，使用单克隆抗体C63作为包被抗体，A25作为标记抗体。

在上述方法中，待测样品可以为血清/浆、唾液、脑脊液、关节液、乳汁以及组织细胞提取液或细胞培养上清等含有脂联素的生物学液体样本。

还一方面，本发明提供一种抗人脂联素单克隆抗体在组织/细胞中检测人脂联素蛋白表达的应用，优选地，所述方法为免疫组化法；优选地，所述样本为培养的细胞或组织活检样本。

本发明还提供了一种人总脂联素的检测试剂盒，所述试剂盒中包含本发明所述的抗人脂联素单克隆抗体作为有效成分，优选地，所述检测试剂盒为ELISA试剂盒，更优选地，所述ELISA试剂盒中的ELISA采用双抗体夹心的非竞争结合法，进一步优选地，所述ELISA中引入BA放大系统。

优选地，所述ELISA试剂盒包括：

用于捕获待测样品中的抗人脂联素单克隆抗体C63；

生物素标记的人脂联素单克隆抗体A25；

系列包含已知浓度的人脂联素标准品溶液和质控品；

酶标亲和素；

检测酶标亲和素的工具。

优选地，所述试剂盒还包括包被液、磷酸盐缓冲液、阻断液、洗涤液、抗体稀释液、酶结合物稀释液、底物应用液和/或终止液。

优选地，所述ELISA试剂盒为定量检测试剂盒。

再另一方面，本发明提供一种人总脂联素检测试剂盒在临床样品检测中的应用，优选地，所述人总脂联素分子为不同聚合形式的人脂联素分子，进一步优选地，所述人总脂联素分子的聚合形式为低分子的三聚体、中分子六聚体和高分子12-18聚体或更高聚体。优选地，所述临床检测为大批量检测，更优选地，所述检测的样本为生物学液体样本，优选选自血清/浆、唾液、脑脊液、关节液、乳汁以及组织细胞提取液或细胞培养上清。

另一方面，本发明提供一种检测人脂联素的免疫检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

1)准备实验用液；

2)制备标准品；

3)选择单克隆抗体C63和A25分别包被聚乙烯酶标板作固相抗体及生物素化后作检测抗体。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明的人脂联素单克隆抗体质地均一、特异性强，与分子结构类似的TNFα、补体C1Q及球状区单体脂联素均无明显交叉反应。本发明的检测人脂联素的试剂盒可根据用途进行灵敏度和检测范围调控，不仅适用于血中人脂联素含量的测定，而且高敏BA-ELISA适宜检测唾液、尿液、乳汁、尿液及关节液以及脂肪细胞培养上清的脂联素水平。本方法简便快捷，便于大批量样品的测定。本发明的ELISA试剂盒稳定性好,批内批间变异系数小，回收实验满意。本发明的检测人脂联素的试剂盒的关键试剂单克隆抗体可以大批量重复生产，具有试剂稳定、价格低廉和可持续性等优点。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1为本发明的抗人脂联素单克隆抗体与利用非变性聚丙烯酰胺凝胶(native-PAGE)电泳分离开的人血中不同聚合形式的脂联素结合的电泳图；

其中图1a为单克隆抗体C63与混合血清脂联素的结合情况；

图1b为单克隆抗体A25与血浆脂联素的结合情况；

图1c为作为对照的单克隆抗体的结合图。

图2为本发明的抗人脂联素单克隆抗体免疫组化法鉴定脂肪组织中的脂联素表达的阳性结果(×400倍)

图3为本发明的人总脂联素检测试剂盒检测脂联素浓度的标准曲线图；

其中，图3a为两种灵敏度和检测范围的ELISA标准曲线图；

图3b为血清/血浆脂联素ELISA标准曲线的弯钩效应图；

图4为使用本发明的人总脂联素检测试剂盒检测混合人血清中经凝胶层析分离、各收集管中不同聚合形式脂联素的含量。

图5为本发明的人总脂联素检测试剂盒与美国Phoenix ELISA试剂盒(批号：EK-ADI-01)检测人血清标本脂联素的结果比对图

图6为使用本发明的人总脂联素检测试剂盒检测冠心病患者脂联素水平的与心脑血管事件发生关系的kaplan-merier分析曲线图。

图7为使用本发明的人总脂联素检测试剂盒检测人前脂肪细胞分化成熟过程中脂联素的分泌情况图；

图8为使用本发明的人总脂联素检测试剂盒检测骨关节炎患者关节液中脂联素与软骨基质降解生物标记物蛋白聚糖降解片段G1-1H11(AGG1)和6D6-G2(AGG2)的相关性结果图。

具体实施方式

除非特别指明，以下实施例中所用的试剂均为分析纯级试剂，且可从正规渠道商购获得。

实施例1抗人脂联素单克隆抗体的制备

所述抗人脂联素单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备方法为：选取6-8周龄Balb/C雌性小鼠(购自中国医学科学院医学实验动物研究所)，脂联素采用美国R&D公司的重组人脂联素(rh Adiponectin/Acrp30，NSO细胞表达，批号1065-AP)作为抗原，为获得高亲和力抗体，采用小剂量(1ug左右)、长时程，多次加强的免疫方法，选择经鼠尾血清用间接ELISA证实特异性抗体滴度最高的小鼠，经融合前加强免疫，取脾脏收集脾细胞，采用常规聚乙二醇法与sp2/0骨髓瘤细胞(中国医学科学院基础所细胞中心)融合成杂交瘤细胞。经HAT选择培养，在融合后10天左右取上清液，间接ELISA检测有无特异性抗体分泌。

所述间接ELISA的操作流程为(1)人脂联素蛋白包被的酶标板条，(2)鼠血清培养血清100ul/孔，室温1小时，振荡，(3)以PBS-T洗液洗板4次，(5)辣根酶-羊抗鼠IgG(0.5μg/ml)，100ul/孔，室温1小时，振荡，(6)洗板4次，拍板，(7)100ul/孔3，3’，5，5’四甲基联苯胺(TMB)底物液，显色反应10分钟，(8)1M硫酸(50ul/孔)终止反应，(9)酶标仪(波长450nm/620nm)读OD值。

将检测到的阳性杂交瘤克隆并扩大培养，该培养采用常规有限稀释法。方法如下：(1)制备饲养细胞悬液铺于96孔板。(2)阳性孔细胞调至浓度分别为50个、25个、10个和5个/ml，100μl/孔各接种96孔板。(3)在倒置显微镜下观察细胞克隆情况。(4)第10天左右，挑选单个克隆孔细胞上清进行抗体检测。(5)初次克隆化的杂交瘤细胞阳性孔再次克隆2-3次，使单克隆孔的阳性率100％。对单克隆细胞接种培养瓶扩大培养，多次传代，由此获得质地均一、可稳定分泌抗人脂联素单克隆抗体的杂交瘤细胞株供长期保存。

为鉴定单克隆抗体类型及亲和力，取杂交瘤细胞培养上清，采用sigma公司的ELISA分型试剂盒鉴定单克隆抗体的类和亚类。采用间接ELISA比较不同单克隆抗体相对亲和力的大小。由此筛选出两株分泌高亲和力单克隆抗体的杂交瘤细胞株。高亲和力单克隆抗体适合用于ELISA。

发明人将这两种杂交瘤细胞株(杂交瘤细胞株6C3-Ⅰ，分类命名：人脂联素单克隆抗体杂交瘤细胞株，保藏日期：2014年11月03日，保藏号为CGMCC No.9908，保藏地：中国院微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101；杂交瘤细胞株C2001，分类命名：人脂联素单克隆抗体杂交瘤细胞株，保藏日期：2014年08月18日，保藏号为CGMCCNo.9568，保藏地：中国院微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101)，用于生产单克隆抗体。

为大批量生产单克隆抗体，采用小鼠腹腔接种法，即采用Balb/c鼠于腹腔注射0.5ml液体石腊，1～2周后腹腔注射1×10⁶个杂交瘤细胞，接种细胞7～10天后可产生腹水。采用间接ELISA测定腹水中抗人脂联素抗体滴度。证实所述腹水中含有大量的单克隆抗体。

为获得大量高纯度抗体，采用亲和层析方法纯化腹水抗体，根据抗体类型，选择纯化介质和缓冲液体系，具体方法如下：采用SIGMA公司的琼脂糖微珠Protein A sepharose CL-4B制备亲和层析柱，腹水以Tris-Hcl(PH9.0)缓冲液稀释后上柱，4℃结合过夜，并以0.1M Tris-Hcl(PH9.0)缓冲液洗脱未结合蛋白，再用PH3.0的0.1M的柠檬酸-磷酸缓冲液洗脱特异抗体，收集保存。

实施例2抗人脂联素单克隆抗体采用免疫印迹法评价与不同分子亚 型人脂联素的结合特性

为鉴定获得的单克隆抗体是否可以结合不同聚合形式的脂联素，将混合人血清/浆行非变性聚丙烯酰胺凝胶(native-PAGE)电泳，以分离人血清/浆中不同聚合形式脂联素，包括低分子的三聚体(LMW，约65kDa)、中分子六聚体(MMW，150kDa)，高分子12-18聚体或更高形式(HMW，约280～420kDa，及420kDa以上)。分别用本发明获得的不同抗人脂联素单克隆抗体，以免疫印迹法检测与电泳分离后血中不同聚合形式的脂联素的结合能力，结果如图1显示,本发明筛选出的两种单克隆抗体C63(图1a)和A25(1b)均可以检测出脂联素的HMW多聚体，MMW以及LMW形式，而作为对照的克隆抗体(图1c)只能检测到440KD以上的大分子。

因此，本结果说明本发明选择的2种单克隆抗体可用以识别人血中的各种脂联素亚型，同时也说明，本发明的单克隆抗体可用于人总脂联素的免疫印迹分析。

实施例3抗人脂联素单克隆抗体在免疫组化中的应用

抗人脂联素单克隆抗体用于免疫组织化学，鉴定脂肪组织中脂联素的表达：将手术中切除的人皮下脂肪组织浸泡于新鲜配制4％多聚甲醛固定液，经梯度乙醇脱水，石蜡包埋和组织切片，切片用二甲苯中脱蜡，换2次，移入体积比为1∶1的二甲苯和乙醇混合液中，浸泡5分钟左右，移入系列乙醇梯度(100％，95％，80％)水化，PBS漂洗，蒸馏水洗1次；置3％H₂O₂孵育20分钟，高压锅内抗原修复，PBS洗3次×5分钟，山羊血清室温封闭，加鼠抗人脂联素单克隆抗体混合液(A63和C25)37℃孵育2h，PBS洗3次。生物素化羊抗鼠二抗37℃孵育30分钟，PBS洗3次，加SABC，37℃孵育30分钟，PBS洗3次，二氨基联苯胺(DAB)显色10分钟，自来水冲洗，苏木素复染2分钟，盐酸乙醇分化2秒；脱水透明，中性树胶封片；镜检，将图像通过光学显微镜(400×)观察并拍摄图像如图2所示，其中细胞胞浆呈现棕黄色为阳性染色。

因此，结果说明本发明单克隆抗体既可用于免疫组化定性检测组织细胞中脂联素的原位表达，还可应用于评价脂肪细胞的分化成熟及内分泌功能。

实施例4抗人总脂联素单克隆抗体定量检测ELISA试剂盒的制备

本发明人总脂联素定量检测ELISA试剂盒实验用液包括：(1)包被液：0.1M NaHCO₃-Na₂CO₃(PH9.6-9.8)缓冲液，(2)磷酸盐缓冲液(PBS)：0.01M Na₂HPO4-NaH₂PO4(PH7.2)缓冲液，(3)阻断液(1％BSA-PBST)：1％BSA-0.01M PBS-TWEEN-20，(4)洗涤液(PBS-T)，(5)抗体稀释液：取1L 0.01M PBS加入BSA 10g、牛γ球蛋白1g、Tween-20 0.5ml、硫柳汞0.2g，(6)酶结合物稀释液：取1L 0.01M PBS加入BSA 3g、硫柳汞0.2g、TWEEN-200.5ml，(7)底物应用液的配制：检测前10分钟，取TMB-HCL1片(1mg片剂)加入10ml过硼酸钠溶液，混匀即用。(8)终止液：1M浓H2SO4。

本发明人总脂联素定量检测ELISA试剂盒的制备步骤为：

1、人脂联素标准品制备：收集正常人血清100ml，4℃离心20分钟。取上清以美国Phoenix的ELISA试剂盒检测其人脂联素含量，取均值作为人脂联素标准品母液浓度。添加含0.01％硫柳汞并过滤除菌分装冻存于-80℃，以作为参比标准。使用时以1％BSA-PBS稀释配制成标准品及质控品的各浓度点，同时以Phoenix ELISA标准品进行比对校正。

2、ELISA夹心配对抗体的筛选：将制备的多种纯化单克隆抗体按棋盘式矩阵配对，进行夹心结合试验，筛选最佳配对单克隆抗体。即分别以包被缓冲液稀释待配对单克隆抗体(MAb)，按照10μg/ml浓度包被酶标板作固相抗体，同时生物素化后作为检测抗体(MAb-B),以抗体稀释液稀释至1μg/ml，分别加入脂联素标准0和10ng/ml进行夹心结合，采用亲和素-辣根酶放大检测信号，TMB底物显色，进行配对试验，结果如表1可见，MAb4(C63)做包被抗体和MAb1(A25)做标记抗体的夹心配对，ELISA本底最低，信躁比(即10ng/ml与0ng/ml的OD值之比)最高，从而选择这两种单克隆抗体制备具有最佳动力学反应曲线的生物素-亲和素放大酶联免疫(BA-ELISA)检测试剂盒。

表1双抗体夹心配对试验结果

3、酶标板固相抗体制备：将本发明的C63单克隆抗体经亲和层析纯化后，用碳酸盐缓冲液稀释至5～10μg/ml，100ul/孔包被酶标板，4℃过夜后加阻断液封闭1h，以PBST洗涤后于4℃存放备用。

4、生物素标记抗体的制备：将本发明的纯化单克隆抗体A25以0.1M碳酸盐缓冲液稀释至1mg/ml，采用SIGMA公司的N-羟基琥珀酰亚胺生物素(BNHS)标记，通过调整BNHS与抗体分子比(从2：1到50：1不等)得不同标记率，从而获不同用途的检测灵敏度。因血标本脂联素含量过高，降低灵敏度可减少稀释倍数和误差；而唾液、脂肪细胞培养液等标本的脂联素含量低，则需要高灵敏的检测方法。标记抗体工作浓度0.25-0.5μg/ml。

5、样本预处理：血浆/清样本测定前用含0.1％BSA-PBST标本稀释液作1：1000稀释；关节液样本作1：50-100倍稀释；尿液、唾液和细胞培养上清3000rpm离心10分钟，取上清直接检测。

6、双抗体夹心结合：将人脂联素标准品或待测样本与生物素化的鼠抗人脂联素单克隆抗体各50μl一同加入包被孔内，振荡反应1h。

7、酶联反应：洗涤4次后加入链亲和素标记的过氧化物辣根酶100μl反应0.5h。

8、酶-底物显色反应：洗涤4次后再加入底物液(含0.03％过硼酸钠和0.01％TMB)100μl，振荡显色约10分钟。

9、终止反应：以1mol/L硫酸终止反应。

10、拟合曲线与读值：在酶标仪上读波长为450nm/620nm的OD值，采用4参数法拟和标准曲线，按编好的程序直接得出待检样本的浓度。

实施例5人总脂联素定量检测ELISA试剂盒的方法学评价和比较

考查反应曲线、灵敏度、特异性、精密度、准确度和弯钩效应及试剂稳定性，并与商业化试剂盒比较。

1、标准曲线：灵敏度、检测范围及弯钩效应

为适应不同样本测定需要，本发明试剂盒设计两种检测灵敏度和工作范围(见图3a)。对于人血中脂联素检测，由于含量高达μg/ml水平，现有试剂盒通常需要将标本多次稀释到5000倍后检测，本发明试剂盒调低灵敏度至0.5ng/ml，曲线的工作范围0.5～50ng/ml，血标本稀释1000倍即可检测，减少了稀释倍数和次数，操作更简便，也降低了稀释误差。以混合人血清作倍比稀释，本试剂盒检测如图3b显示，在脂联素浓度1250ng/ml时，反应曲线出现“弯钩”效应。而针对唾液、细胞培养上清等脂联素含量低的标本，本发明试剂盒通过提高抗体标记率获得高灵敏ELISA，曲线的工作范围为0.1～10ng/ml，灵敏度为0.05ng/ml。采用四参数拟和曲线，相关系数R2＝0.997～1.000。

2、特异性

1)不同种属动物源性交叉反应：取牛、羊、小鼠、大鼠、猴及兔血清，均分别按1：1，1：10，1：100倍稀释，用ELISA测定脂联素含量，均未见交叉反应。

2)相关蛋白：与100ng/ml人抵抗素、TNFα及C1q未见交叉反应。

3)与脂联素不同分子亚型:以健康人混合血清4℃经Ultrogel ACA34(1×50cm)层析柱分离，以0.1％BSA-PBS洗脱，0.5ml/管收集，使用本发明试剂盒测定各收集管中脂联素的含量，结果如图4所示，至少检出3个脂联素洗脱峰，经非变性聚丙烯酰胺凝胶(native-PAGE)电泳免疫印迹法证实，依次为280～660KD的高分子脂联素、150KD的中分子以及65KD LMW；说明本发明试剂盒能识别各个分子亚型，测定的是总脂联素水平。

4)精密度和准确性：正常人混合血清，以标准稀释液稀释1000倍后批内重复测定10次，测定值为9.8±0.3μg/ml，变异系数cv为3.1％；不同批次稀释10次，批间重复测定的结果为10.1±0.9μg/ml，cv为8.9％。即取正常人混合血清稀释1000倍后分别加入4ng、10ng、40ng脂联素纯品(R&D公司),计算回收率为102.1％。说明本发明试剂盒准确、可靠。

5)方法学比对：取正常人和糖尿病患者的空腹血清标本供84人份，应用本发明试剂盒和美国Phoenix ELISA试剂盒检测脂联素水平进行比较，前者需要将样本稀释1000倍，后者稀释5000倍，结果如图5所示，经直线回归分析相关系数r＝0.93，两者相关性好。

可见与商业化试剂盒比较，本发明试剂盒不仅检测结果有良好相关性，且操作更简便，同时，因采用可大批量生产的自制单克隆抗体，更具低成本的价格优势。

实施例6健康人群血中脂联素水平正常参考值的建立

1、健康成人：选取110位健康成人。所有受试者来自社区糖尿病筛查对象，隔夜空腹10-12小时，次日清晨均行75g葡萄糖耐量试验(OGTT)。健康正常人界定为按ADA 1997标准除外2型糖尿病，BMI限定为18～25kg/m²，年龄25～60岁，血压≤140/90mmHg，肝肾功能正常。用本发明试剂盒测定空腹血清水平作为正常参考值。结果：男性平均8.6±4.4μg/ml，其第5～95百分位分布为1.7～17.2μg/ml，女性11.5±5.8μg/ml，其中第5～95百分位为3.7～22.3μg/ml，其性别差异显著(P<0.01)。

2、儿童青少年:选取通过抽样调查来的北京地区6-18岁儿童青少年人群，按照2009年IDF代谢综合征标准筛选出无任何代谢综合征组份的健康儿童1032名(男430)作为建立正常值的参考人群，按性别百分位分布统计，结果显示：男孩中位数为12.8μg/ml，第5～95百分位分布为4.5-28.2μg/ml，女孩为13.5μg/ml，分布为5.0-29.6μg/ml。

因此，结果说明，本发明试剂盒基于大样本标本检测建立了比较完善的正常参考值，为临床及流行病学进一步大批量应用提供了参考依据。

实施例7冠心病患者血清脂联素水平检测

收集经冠脉造影检查明确诊断冠心病的患者共449例，其中男性305，平均年龄65±11岁，进行为期19±8月的临床随访，观察主要心脑不良事件(MACCE)的发生情况，具体包括心源性死亡、非心源性死亡、靶血管再血管化、随访期间发生的急性冠脉综合征、脑卒中或者一过性脑缺血、心功能恶化等，采用本试剂盒检测基线空腹血清脂联素水平，探讨其与冠心病患者预后(发生MACCE)之间的关系。结果显示发生MACC事件的冠心病患者，基线存在低脂联素血症(<5μg/ml)的比例明显增多(70％vs 58％，p＝0.038)，采用Kaplan-meier生存曲线评价脂联素的预后价值结果如图6所示，脂联素水平低的冠心病患者组发生MACCE事件显著高于脂联素水平高组(p<0.05)。

因此，结果说明，本发明试剂盒检测的脂联素可用作冠心病患者预后评估的重要指标,低脂联素水平冠心病患者预后差。

实施例82型糖尿病患者唾液中脂联素检测

共纳入38例新诊断的2型糖尿病患者(无药物治疗干扰)及35名健康对照，收集空腹及OGTT各时点(1、2、3h)的血清。同时留取空腹唾液,唾液采集为无刺激状态下自然分泌的全唾液，采样10分钟，将其3000rpm离心10分钟后留取上清，采用本发明试剂盒，同批检测血清(稀释1000倍)和唾液中脂联素水平，检测结果如表2显示：唾液中可检出脂联素浓度，但比血液低1000倍(ng/ml水平)，唾液与同时点的血液脂联素水平有相关性(P<0.05)。同时发现2型糖尿病的空腹唾液和血清水平均低于健康对照者。此外OGTT各时点的血清脂联素没有明显变化(P>0.05)，提示血中脂联素分泌水平不受糖餐引起的急性高血糖、高胰岛素的明显影响。

因此本结果说明，本发明试剂盒证实唾液中可检测到脂联素的分泌，唾液可望作为一种非侵入性替代标本，检测其脂联素水平对糖尿病等相关疾病可能有临床参考价值。

表2新诊2型糖尿病与正常对照唾液及3h-OGTT中血清脂联素水平

*与正常对照比较，P<0.05

实施例9人前脂肪细胞分化过程中脂联素的分泌检测

取开腹手术病人大网膜脂肪组织，经胶原酶消化分离网膜前脂肪细胞原代培养，分化培养基诱导分化21天，隔日收取上清，应用本发明的高灵敏ELISA试剂盒测定培养上清脂联素的浓度。结果如图7所示，在人前脂肪细胞不能检测到人脂联素分泌，分化诱导到第7天才可以检测到低水平的分泌，此时显微镜下已可观察到有内含脂滴的脂肪细胞出现，第17天分泌量达高峰，第21天分泌量明显下降。

结果说明本发明试剂盒可以应用于监测脂肪细胞脂联素的分泌，同时提示检测脂联素分泌水平可作为鉴定脂肪细胞的分化成熟及反映其内分泌功能状态的标志。

实施例10骨性关节炎患者关节液中人脂联素的检测

收集骨科接受全膝关节置换术的女性患者30例，符合1995年美国风湿病学会骨关节炎诊断标准，年龄55～79岁，排除痛风、类风湿关节炎等其它关节疾病，均未接受过改变病情抗风湿药或免疫抑制治疗，近6个月内未接受关节内注射药物治疗。术中小心收集关节液(避免沾带血液)，3000g离心15分钟，收集上清，-80℃保存，应用本发明试剂盒同批测定脂联素水平，结果关节液脂联素浓度为0.93±0.64μg/mL(0.19～2.47μg/mL)，低于其血浆浓度7.50±3.29μg/mL(3.60～21.30μg/mL)；同时发现骨关节炎患者关节液脂联素与软骨基质降解片段相关(见图8)，提示脂联素参与骨关节炎的代谢调节，是其病理生理过程中的重要参与者。

因此，本结果说明本发明试剂盒不仅检测到关节液中脂联素的存在，而且初步揭示了关节液检测脂联素的临床意义。

实施例11乳汁中人脂联素的检测

共纳入按ADA标准诊断为妊娠糖尿病(GDM)的产妇及作为对照的健康产妇各48人，分别于分娩后3天收集初乳和3个月收集成乳，经冰浴下超声粉碎处理，超速离心(10000g×60min)去除脂质。应用本发明的试剂盒检测乳汁中脂联素的水平，探讨GDM对乳汁脂联素的影响。结果见表3所示，与正常对照比较GDM患者母乳中脂联素水平显著降低，提示GDM可影响母乳中的脂联素水平。结果说明，应用本发明试剂盒可以检测乳汁中脂联素水平，并且具有临床意义。

表3.GDM乳汁中脂联素水平检测

Claims (10)

1.一种杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株为6C3-Ⅰ或C2001，其中，杂交瘤细胞株6C3-Ⅰ的保藏号为CGMCC No.9908；杂交瘤细胞株C2001的保藏号为CGMCC No.9568。

2.一种抗人脂联素单克隆抗体A25或C63，其中，所述抗人脂联素单克隆抗体A25由保藏号为CGMCC No.9568的杂交瘤细胞株C2001产生；

所述抗人脂联素单克隆抗体C63由保藏号为CGMCC No.9908的杂交瘤细胞株6C3-Ⅰ产生。

3.根据权利要求2所述的抗人脂联素单克隆抗体的制备方法，所述方法包括以下步骤：

1)制备抗人脂联素单克隆抗体杂交瘤细胞株；

2)检测单克隆抗体；

3)将杂交瘤的克隆化及扩大培养；

4)大量生产、纯化和鉴定单克隆抗体的性质。

4.如权利要求2所述的抗人脂联素单克隆抗体在生物样本中定量和/或定性检测人脂联素分子中的应用；

优选地，所述人脂联素分子为人总脂联素分子；

优选地，所述人总脂联素分子为不同聚合形式的人脂联素分子；

进一步优选地，所述人总脂联素分子的聚合形式为低分子的三聚体、中分子六聚体和高分子12-18聚体或更高聚体；

优选地，所述生物样本为生物学液体样本，优选选自血清/浆、唾液、脑脊液、关节液、乳汁、组织细胞提取液或细胞培养上清；

优选地，所述检测的方法为半定量的非变性凝胶电泳免疫印迹法或定量的ELISA法。

5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述方法为ELISA方法，该方法包括以下步骤：

(1)进行夹心结合试验，在单克隆抗体A25和C63中选择最佳配对单克隆抗体；

(2)将两种单克隆抗体中的一种作为固相抗体，使用酶标板包被，另一种作为标记抗体，使用生物素标记；

(3)加入酶标亲和素，检测被结合的标记；

优选地，所述生物样本为生物学液体样本，优选选自血清/浆、唾液、脑脊液、关节液、乳汁、组织细胞提取液或细胞培养上清。

6.根据权利要求5所述的方法，其中，使用单克隆抗体C63作为固相抗体，A25作为标记抗体。

7.如权利要求2所述的抗人脂联素单克隆抗体在组织/细胞中检测人脂联素蛋白表达的方法中的应用，优选地，所述方法为免疫组化法；优选地，所述样本为培养的细胞或组织活检样本。

8.一种检测人总脂联素的试剂盒，所述试剂盒中包含如权利要求2所述的抗人脂联素单克隆抗体；

优选地，所述检测试剂盒为ELISA试剂盒；更优选地，所述ELISA试剂盒中的ELISA采用双抗体夹心的非竞争结合法；进一步优选地，所述ELISA中引入BA放大系统。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其中，所述ELISA试剂盒包括：

用于捕获待测样品中的抗人脂联素单克隆抗体C63；

生物素标记的人脂联素单克隆抗体A25；

系列包含已知浓度的人脂联素标准品溶液和质控品；

酶标亲和素；

检测酶标亲和素的工具；

优选地，所述试剂盒还包括包被液、磷酸盐缓冲液、阻断液、洗涤液、抗体稀释液、酶结合物稀释液、底物应用液和/或终止液；

优选地，所述ELISA试剂盒为定量检测试剂盒。

10.如权利要求9所述的试剂盒在临床样品检测中的应用，所述试剂盒用于定量和/或定性检测生物样本中人总脂联素；优选地，所述人总脂联素分子为不同聚合形式的人脂联素分子，进一步优选地，所述人总脂联素分子的聚合形式为低分子的三聚体、中分子六聚体和高分子12-18聚体。优选地，所述临床样品检测为大批量检测；更优选地，所述待测样品为生物学液体样本，选自血清/浆、唾液、脑脊液、关节液、乳汁、组织细胞提取液或细胞培养上清。