CN117164715A - 一种抗人激肽释放酶1单克隆抗体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种抗人激肽释放酶1单克隆抗体，包括抗人激肽释放酶1单克隆抗体44H9C11或抗人激肽释放酶1单克隆抗体17B6‑1，以及上述抗体对在制备检测抗人激肽释放酶1含量的试剂盒中的应用，本发明对特异性识别天然KLK1而不识别KLK2多个抗体进行配对筛选，获得灵敏度高的抗体组合；对上述抗体对进行检测体系的调试优化工作，获得灵敏度等检测性能可满足人KLK1浓度检测的酶联免疫定量检测试剂盒。
Description
技术领域
本发明涉及一种单克隆抗体，具体涉及一种抗人激肽释放酶1单克隆抗体及其应用，属于生物医学检测技术领域。
背景技术
心脑血管疾病是严重危害人类健康的主要慢性非传染性疾病。其中冠心病和脑卒中是世界上最常见的死亡原因。在我国随着人口的老龄化，以冠心病、脑卒中为代表的心脑血管疾病其发病率、致死率及致残率呈逐年上升的趋势。尽管已经发现了许多心脑血管疾病的危险因素，如高血压、糖尿病、血脂代谢的异常、体重指数等。然而这些危险因素只能解释部分病人，因此，寻找新的心脑血管疾病危险因素将具有重要的临床意义。
基础研究证明，激肽---缓激肽系统与肾素血管紧张素系统相互作用并在心脑血管疾病的发生发展中具有重要的作用。激肽---缓激肽系统主要是激肽释放酶在发挥作用，激肽释放酶是一组丝氨酸蛋白酶，存在于不同组织和生物液体中。最初从胰腺中分离。主要分为血浆激肽释放酶和组织激肽释放酶两大类。
人和动物的组织激肽释放酶中只有一种酶能有效地使激肽原释放生物活性物激肽。在人体内该酶称为胰肾激肽释放酶，新的统一命名为KLK1。能水解低分子量激肽原使之生成激肽，而激肽与血管平滑肌细胞膜上的舒缓激肽受体结合后，可使血管平滑肌增多，进而通过第二信使途径舒张血管，达到降压的目的。
研究证明降低的血浆人KLK1含量具有较高的脑卒中发生率和再发率。升高的血浆人KLK1含量与冠心病发生呈正相关关系，而与冠心病的严重程度呈负相关关系。因此，人KLK1可能具有重要的心脑血管保护作用，其在血浆中含量的可能预测脑卒中及冠心病的发生及再发。
组织激肽释放酶是一个大的多基因家族，由15个成员组成，各成员间基因序列、蛋白水平、三级结构极为相似，具有较高的同源性。针对KLK1来说，与其具有较高同源性的蛋白为KLK2，同源性大概65.6％，另外，天然KLK1存在多个糖基化位点，而重组表达KLK1在糖基化位点等其他构象方面可能与天然蛋白存在较大的差异，在动物免疫和在特异性抗体筛选时采用重组人KLK1就会出现筛选的特异性抗体不能有效识别天然人KLK1的问题。
目前，市面上没有针对人KLK1的高特异性、高灵敏度的检测试剂盒，所以迫切需要一种能有效、快速检测人KLK1的产品。
发明内容
发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供了一种能有效识别天然人KLK1的抗人激肽释放酶1单克隆抗体。
本发明还要解决的技术问题是提供了利用天然人KLK1进行动物免疫和特异性抗体筛选得到的抗人激肽释放酶1单克隆抗体。
本发明还要解决的技术问题是提供了抗人激肽释放酶1单克隆抗体在制备检测抗人激肽释放酶1含量的试剂盒中的应用。
本发明最后要解决的技术问题是提供了高特异性、高灵敏度的酶联免疫试剂盒。
技术方案：为了实现上述目的，本发明提供了一种抗人激肽释放酶1单克隆抗体，所述抗人激肽释放酶1单克隆抗体包括单克隆抗体44H9C11或单克隆抗体17B6-1；
所述单克隆抗体44H9C11包括重链CDR1、重链CDR2、重链CDR3，轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3；所述单克隆抗体44H9C11的重链CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述单克隆抗体44H9C11的重链CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述单克隆抗体44H9C11的重链CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；所述单克隆抗体44H9C11的轻链CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，所述单克隆抗体44H9C11的轻链CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示，所述单克隆抗体44H9C11的轻链CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示；
所述单克隆抗体17B6-1包括重链CDR1、重链CDR2、重链CDR3，轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3；所述单克隆抗体17B6-1的重链CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示，所述单克隆抗体17B6-1的重链CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示，所述单克隆抗体17B6-1的重链CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示，所述单克隆抗体17B6-1的轻链CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示，所述单克隆抗体17B6-1的轻链CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：13所示，所述单克隆抗体17B6-1的轻链CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：14所示。
其中，所述单克隆抗体44H9C11的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。
其中，所述单克隆抗体17B6-1的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：15所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：16所示。
本发明内容还包括一种抗人激肽释放酶1单克隆抗体对，其包括所述的单克隆抗体44H9C11和单克隆抗体17B6-1。
本发明内容还包括所述的抗人激肽释放酶1单克隆抗体、所述的抗人激肽释放酶1单克隆抗体对在制备检测抗人激肽释放酶1含量的试剂盒中的应用。
其中，所述试剂盒包括胶体金免疫试剂盒、化学发光试剂盒、放射免疫试剂盒、酶联免疫试剂盒或荧光免疫试剂盒。
本发明内容还包括一种酶联免疫试剂盒，所述酶联免疫试剂盒包括包被所述单克隆抗体44H9C11的酶标板、辣根过氧化物酶标记链霉亲和素和生物素标记的所述单克隆抗体17B6-1。
其中，所述酶联免疫试剂盒还包括标准品、质控品、样品稀释液、洗涤液、显色液及终止液；优选地，所述标准品为天然人KLK1。
有益效果：与现有技术相比，本发明具备以下优点：
1、本发明提供的抗人激肽释放酶1单克隆抗体，其利用天然人KLK1进行动物免疫和特异性抗体筛选得到，能有效识别天然KLK1。
2、本发明提供的抗人激肽释放酶1单克隆抗体，利用KLK2进行反筛，从而具有高特异性，能特异性识别天然KLK1而不识别KLK2。
3、本发明能特异性识别天然KLK1而不识别KLK2的多个抗体进行配对筛选，获得灵敏度高的抗体组合；对上述抗体对进行检测体系的调试优化工作，获得灵敏度等检测性能可满足动物血浆中和人血浆中人KLK1浓度检测的酶联免疫定量检测试剂盒。
4、本发明提供的抗人激肽释放酶1单克隆抗体，应用于酶联免疫定量检测试剂盒，既可以检测重组小鼠KLK1和人尿液中提取纯化KLK1，检测范围广。
附图说明
图1为人尿液中提取纯化KLK1 SEC-HPLC图。
图2为人尿液中提取纯化KLK1 SDS-PAGE图，泳道1为Marker，泳道2为人尿液中提取纯化KLK1。
图3为最佳抗体对44H9C11(捕获抗体)&17B6-1(检测抗体)纯化后的SDS-PAGE。泳道M为Marker，泳道1为捕获抗体44H9C11；泳道2为检测抗体17B6-1；泳道3为Mouse IgG。
图4为最佳四对抗体对Sandwich Elisa检测标准曲线。
图5为抗体对44H9C11(捕获抗体)&17B6-1(检测抗体)应用于酶联免疫定量检测试剂盒以缓冲液基质标准曲线。
图6为替换市售KLK1酶联免疫检测试剂盒中抗体对，采用本发明最佳抗体对44H9C11(捕获抗体)&17B6-1(检测抗体)检测重组小鼠KLK1标准品标准曲线。
图7利用市售KLK1酶联免疫检测试剂盒检测重组小鼠KLK1标准品标准曲线。
图8为替换市售KLK1酶联免疫检测试剂盒中的抗体对，采用本发明最佳抗体对44H9C11(捕获抗体)&17B6-1(检测抗体)检测人尿液中提取纯化KLK1标准曲线。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1：人KLK1-Elisa试剂盒的制备
1、免疫原-人激肽释放酶1(KLK1)的制备
以下实施例中所述人尿液中提取纯化KLK1，即人尿激肽原酶，由人尿液中提取纯化得到，HPLC纯度为100％，电泳纯度为100％，比活性≥9PNAU/mg蛋白，SEC-HPLC如图1所示，SDS-PAGE如图2所示。
2、KLK1单克隆抗体的制备
2.1动物免疫
以人尿液中提取纯化KLK1按照一般免疫程序免疫Balb/c雌性小鼠，选取针对免疫原的免疫应答水平高(OD>1，效价≥1：8000)的免疫小鼠。
2.2细胞融合和反筛
细胞融合：采用电融合的方法将血清效价最高的免疫小鼠的小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞进行融合，每轮融合的所有细胞都将被铺到96孔板中；
初筛：用间接Elisa方法筛选融合细胞上清液，挑选出针对人尿来源的KLK1(靶蛋白)呈阳性的上清。
反筛：对初筛阶段得到的所有阳性克隆，采用间接Elisa方法筛选所有的阳性母克隆上清，筛选出对人尿来源的KLK1呈阳性，KLK2阴性，293cell line WB阴性(Human celllysate反筛)的特异性克隆细胞。筛选得到10株特异性识别KLK1而不识别KLK2阳性克隆母细胞，特异性检查结果如表1所示：
表1
由表1可知，5株阳性克隆母细胞41B12C2、52H9E6、44H9C11、17B6-1和59G6G5针对KLK1特异性更好，进一步进行亚克隆、扩大培养，得到5株阳性单克隆细胞。
3、最佳人KLK1抗体对初筛
3.1人KLK1抗体对初筛
对筛选得到5株阳性单克隆细胞41B12C2、52H9E6、44H9C11、17B6-1和59G6G5进行抗体制备，采用ProteinA/G亲和层析的方法进行抗体纯化，利用抗靶蛋白抗体-靶蛋白-Biotin标记抗靶蛋白抗体的模式在buffer基质下进行Sandwich Elisa检测。
材料：
包被：捕获抗体，2.5μg/mL；
包被缓冲液：磷酸盐缓冲盐溶液，pH 7.4；
抗原：人尿液中提取纯化KLK1 0-100ng/mL；
样本基质：磷酸盐缓冲盐溶液，pH 7.4；
检测试剂：检测抗体，0.25-1μg/mL，采用生物素标记。
结果如表2和表3所示：
表2
由表2可知，41B12C2(捕获抗体)&17B6-1(检测抗体)、44H9C11(捕获抗体)&17B6-1(检测抗体)、59G6G5(捕获抗体)&52H9E6(检测抗体)和44H9C11(捕获抗体)&52H9E6(检测抗体)，四个抗体对检测响应OD450较高，因此接下来针对上述4种抗体对在梯度浓度下进行最佳浓度的进一步确定，结果见表3。
表3
根据表3，4对抗体对44H9C11(捕获抗体))&17B6-1(检测抗体1μg/ml)、41B12C2(捕获抗体))&17B6-1(检测抗体，0.5μg/ml)，44H9C11(捕获抗体)&52H9E6(检测抗体，0.25pg/ml)，59G6G5(捕获抗体)&52H9E6(检测抗体，0.5μg/ml)制作得到相应的标准曲线如图4所示，由图4可知，抗体对44H9C11(捕获抗体)&17B6-1(检测抗体，1μg/ml)的相关系数R2为0.9984，41B12C2(捕获抗体)&17B6-1(检测抗体，0.5μg/ml)的相关系数R2为0.9942，59G6G5(捕获抗体)&52H9E6(检测抗体，0.25μg/ml)的相关系数R2为0.9953，4H9C11(捕获抗体)&52H9E6(检测抗体，0.5μg/ml)的相关系数R2为0.9946。
由此，确定4对配对抗体灵敏度，如表4所示：
表4
由表4可知，第一对抗体对44H9C11(捕获抗体)&17B6-1(检测抗体)灵敏度最高，确定为最佳抗体对，其纯化后的SDS-PAGE如图3所示，测序由金斯瑞生物科技股份有限公司完成，测得捕获抗体44H9C11的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，捕获抗体44H9C11重链可变区的3个互补决定区的氨基酸序列分别是：如序列SEQ ID NO：1所示的重链CDR1、如序列SEQ ID NO：2所示的重链CDR2和如序列SEQ ID NO：3所示的重链CDR3；捕获抗体44H9C11轻链可变区的3个互补决定区的氨基酸序列分别是：如序列SEQ ID NO：4所示的轻链CDR1、如序列SEQ ID NO：5所示的轻链CDR2和如序列SEQ ID NO：6所示的轻链CDR3。
测得检测抗体17B6-1的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示，检测抗体17B6-1重链可变区的3个互补决定区的氨基酸序列分别是：如序列SEQ ID NO：9所示的重链CDR1、如序列SEQ ID NO：10所示的重链CDR2和如序列SEQ ID NO：11所示的重链CDR3；检测抗体17B6-1轻链可变区的3个互补决定区的氨基酸序列是：如序列SEQ ID NO：12所示的轻链CDR1、如序列SEQ ID NO：13所示的轻链CDR2和如序列SEQ ID NO：14所示的轻链CDR3。
实施例2单链抗体的重组表达及纯化
分别将单克隆抗体44H9C11和17B6-1的重链及轻链可变区之间加入连接肽(GGGGS)3，并将其全基因按照CHO表达系统的偏爱性进行密码子优化的方法，进行单链抗体的重组表达，所表达得到的抗体分别命名为抗体44H9C11和抗体17B6-1。
抗体44H9C11的重组后氨基酸序列如SEQ ID No.17所示，根据中国仓鼠卵巢细胞(CHO)的密码子偏好性，优化后基因序列如SEQ ID No.19所示；
抗体17B6-1的重组后氨基酸序列如SEQ ID No.18所示，根据中国仓鼠卵巢细胞(CHO)的密码子偏好性，优化后基因序列如SEQ ID No.20所示；
上述单链抗体的重组表达具体步骤如下：
(1)将优化后的抗体44H9C11的基因序列和抗体17B6-1的基因序列分别克隆至真核表达载体pcDNA3中；
(2)将克隆后的载体进行进一步的测序鉴定，然后将正确的克隆提质粒；
(3)培养CHOK1悬浮细胞，将细胞培养在Gibco细胞培养基(购自赛默飞公司)中，当密度达到1X106/ml，成活率>95％时进行细胞转染；
(4)转染方法：按照1ml细胞，加入1μg质粒，6μgPEI转染试剂进行转染；
(5)转染后5-7天，收集细胞上清，用Protein G树脂进行亲和纯化获得高纯度的抗体蛋白44H9C11和抗体蛋白17B6-1，并用超滤柱将洗脱缓冲液置换成PBS缓冲液。
实施例3抗体对44H9C11(捕获抗体)&17B6-1(检测抗体)应用于酶联免疫定量检测试剂盒检测大鼠血浆中人KLK1的浓度。
2.1试剂盒：
PBS缓冲液：精密称取8gNaC1，0.2gKCl，3.63gNa2HPO4·12H2O，0.24gKH2PO4，加水溶解，并调节pH值至7.4，定容至1L，室温保存1个月。
3％BSA-PBST(W/V)溶液：称取约3g BSA，用100mL PBST缓冲液溶解，混匀，冰箱(2～8℃)保存，有效期7天；其中，PBST缓冲液的制备：精密量取50μl Tween20和100mLPBS缓冲液，混匀即得，现用现配；
混合SD大鼠空白血浆：将10个个体SD大鼠空白血浆混合后冻存于冷冻冰箱(-15～-25℃)；有效期2年。
样本稀释液：用3％BST-PBST(W/V)溶液将混合SD大鼠空白血浆稀释成5％(V/V)混合SD大鼠空白血浆，现配现用。
包被人激肽释放酶1捕获抗体缓冲液的配置：用PBS缓冲液稀释捕获抗体44H9C11至2μg/ml，现配现用。
包被人激肽释放酶1捕获抗体的酶标板的配置：每孔加入100μL包被人激肽释放酶1捕获抗体44H9C11缓冲液至96孔板，封板膜封板，放置冷藏冰箱(2～8℃)温育过夜(16-20h)。
生物素标记的抗人激肽释放酶1检测抗体溶液的配制：用3％BST-PBST(W/V)溶液将生物素标记的检测抗体17B6-1(生物素标记的检测抗体17B6-1采用市售Roche生物素蛋白标记试剂盒对检测抗体17B6-1标记而成)稀释至1μg/ml，混匀即得。
辣根过氧化物酶标记链霉亲和素溶液(SA-HRP溶液)的配制：用样本稀释液稀释SA-HRP(上海生工)200倍。
显色液：TMB单组份显色液。
洗涤液的配制：将PBS(20X)母液用超纯水稀释20倍后加入适量Tween20，配成含0.05％(V/V)Tween20的洗液待用。
终止液的配制：将11ml硫酸缓慢加入90mL超纯水中，边加边搅拌混匀。
标准曲线样品配制过程如表5和表6所示：
表5
表6
2.2操作步骤
(1)包被：制备包被人激肽释放酶1捕获抗体44H9C11的酶标板；
(2)洗板：弃去板内液体，每孔加入250μL洗涤液3次，每次30s以上，最后一次洗涤后，在吸水纸上拍干残余的洗液。
(3)封闭：每孔加入300μL 3％BSA-PBST(W/V)溶液，封板膜封板，37±1℃孵育2h±10min。
(4)洗板：弃去板内液体，每孔加入250μL洗涤液3次，每次30s以上，最后一次洗涤后，在吸水纸上拍干残余的洗液。
(5)加样：根据实验布局，在相应的板孔内分别加入100μL的标准品、质控品及待检样品，各样品均设复孔，封板膜封板，37℃±1℃温育1h±10min。
(6)洗板：弃去板内液体，每孔加入250μL洗涤液3次，每次30s以上，最后一次洗涤后，在吸水纸上拍干残余的洗液。
(7)加检测溶液：每孔加入100μL生物素标记的抗人激肽释放酶1检测抗体17B6-1溶液，37±1℃孵育1h±10min。
(8)洗板：弃去板内液体，每孔加入250μL洗涤液3次，每次30s以上，最后一次洗涤后，在吸水纸上拍干残余的洗液。
(9)加SA-HRP溶液：每孔加入100μL过氧化物酶标记的链霉素溶液(SA-HRP溶液)，37±1℃孵育40min±5min
(10)洗板：弃去板内液体，每孔加入250μL洗涤液3次，每次30s以上，最后一次洗涤后，在吸水纸上拍干残余的洗液。
(11)显色：每孔加入100μL显色液，25±1℃孵育17±2min。
(12)终止：每孔加入100μL终止液终止反应。
(13)检测读数：使用酶标仪在波长450-630nm下读数。
a、标准曲线与定量范围
以理论浓度为横坐标，测得OD值与空白复孔OD均值的差为纵坐标，通过四参数回归模型来拟合标准曲线；
四参数回归模型：y＝(A-D)/[1+(x/C)B]+D，其中，A为曲线下渐近线估值，D为曲线上渐近线估值，B为曲线的斜率，C为最大结合一半时对应的浓度，数据见表7；
表7
由表7可知，抗人激肽释放酶1在5％(V/V)混合SD大鼠血浆中的的标准曲线定量范围是300.000-8000.000pg/mL。
b、准确度与精密度
使用5％(V/V)混合SD大鼠空白血浆配置稀释人尿液中提取纯化KLK1至如下验证样品，考察批内及批间准确度与精密度，结果见表8和表9；
(1)批内准确度、精密度
表8
(2)批间准确度、精密度
表9
由表8和表9可知，质控品批内精密度CV％在6％内，批内准确度RE％在±4％内，而LLOQ批内精密度CV％和批内准确度RE％分别在10％内；质控品批间准确度RE％在±10％内，批间精密度CV％在15％以内。
C、选择性
分别用5只5％(V/V)SD大鼠的空白个体血浆(用3％BST-PBST(W/V)溶液将SD大鼠空白个体血浆稀释而成)，稀释人尿液中提取纯化KLK1(2.000μg/mL)至定量上限(ULOQ)和定量下限(LLOQ)两个浓度，用于考察混合SD大鼠空白血浆中的非结构相关物质是否影响人KLK1浓度的准确测定，结果如表10：
表10
/>
表10结果表明混合SD大鼠空白血浆中的非结构相关物质不影响人KLK1浓度的准确测定。
D稳定性
HQC(6000.000pg/mL)和LQC(2000.000pg/mL)经冻融3、5次；室温条件放置23.9h；2-8℃条件放置23.9h；用3％BSA-PBST进行20倍稀释预处理后，室温下实验台放置2.5h稳定；-70～-90℃条件放置30天稳定，结果见附表11-12。
表11
表12
/>
E释线性与钩状效应
使用5％混合SD大鼠空白血浆将人尿液中提取纯化KLK1(2.000μg/mL)稀释50、2000和4000倍，检测结果如表13所示；
表13
如表13所示：稀释线性结果表明样品的最大稀释倍数为4000倍，每个稀释倍数下所测得的样本回算后浓度均值与理论浓度比较的相对误差RE％在±15％以内；同一浓度来源的所有稀释样品回算终浓度CV％小于10％。
使用5％混合SD大鼠空白血浆将人尿液中提取纯化KLK1(2.000μg/mL)稀释5和50倍。
表14
如表14所示，终浓度高于ULOQ的样品OD值不低于ULOQ浓度点的OD值，表明未出现钩状效应。
E平行性
选取真实样本进行平行线考察，样品稀释至标准曲线定量范围内，测定其浓度，结果如表15所示。真实样本选取大鼠皮下注射给药：人尿激肽原酶注射液(人尿激肽原酶注射液配方：人尿激肽原酶1PNA单位/mL；枸橼酸钠2.5mg/mL；氯化钠6.0mg/mL；磷酸二氢钠一水合物1.93mg/mL；磷酸氢二钠2.09mg/mL，pH6.5～7.0)后Cmax附近的样本，其中给药浓度：20PNA单位/kg(高剂量组)。
表15
由表15结果表明，真实样品经过一系列的稀释后仍然可以准确的测定分析物，在标准曲线定量范围内，样品终浓度间CV％为7.1％。
实施例4抗体对44H9C11(捕获抗体)&17B6-1(检测抗体)应用于酶联免疫定量检测试剂盒检测人血样本中KLK1的浓度。
1、试剂盒：
PBS缓冲液：精密称取8gNaCl，0.2gKCl，3.63gNa2HPO4·12H2O，0.24gKH2PO4，加水溶解，并调节pH值至7.4，定容至1L，室温保存1个月。
1％BSA的PBS溶液：称取约1g BSA，用100mLPBS缓冲液溶解，混匀，冰箱(2～8℃)保存，有效期7天；
包被人激肽释放酶1捕获抗体缓冲液的配制：用1％BSA的PBS溶液稀释捕获抗体44H9C11至2μg/ml，现配现用。
生物素标记的人激肽释放酶1检测抗体溶液的配制：用1％BSA的PBS溶液稀释生物素标记的检测抗体17B6-1(其中，生物素标记的检测抗体17B6-1采用市售Roche生物素蛋白标记试剂盒对检测抗体17B6-1标记而成)稀释至0.5μg/ml，混匀即得。
辣根过氧化物酶标记链霉亲和素溶液(SA-HRP溶液)的配制：用1％BSA的PBS溶液稀释SA-HRP(上海生工)300倍；
显色液：TMB单组份显色液。
洗涤液的配制：将PBS(20X)母液用超纯水稀释20倍后加入适量Tween20，配成含0.05％(V/V)Tween20的洗液待用。
终止液的配制：将11ml硫酸缓慢加入90mL超纯水中，边加边搅拌混匀。
标准曲线样品的配制：蛋自校正标样的配制过程操作如表16：质控样品的配制过程操作如表17：
表16
表17
2、操作步骤
包被：将配制好的包被人激肽释放酶1捕获抗体44H9C11缓冲液加入板孔，100μL/孔，并用封板膜封板，2～8℃包被过夜。
(2)洗板：弃去板内液体，每孔加入300μL洗涤液3次，每次30s以上，最后一次洗涤后，在吸水纸上拍干残余的洗液。
(3)封闭：每孔加入300μL1％(W/V)BSA的PBS溶液，封板膜封板，37±1℃孵育2h±5min。
(4)洗板：弃去板内液体，每孔加入300μL洗涤液3次，每次30s以上，最后一次洗涤后，在吸水纸上拍干残余的洗液。
(5)加样：根据实验布局，在相应的板孔内分别加入100μL的标准品、质控品及待检样品，各样品均设复孔，封板膜封板，37℃±1℃温育1h±10min。
(6)洗板：弃去板内液体，每孔加入250μL洗涤液3次，每次30s以上，最后一次洗涤后，在吸水纸上拍干残余的洗液。
(7)加检测溶液：每孔加入100μL生物素标记的抗人激肽释放酶1检测抗体17B6-1溶液，37±1℃孵育1h±10min。
(8)洗板：弃去板内液体，每孔加入250μL洗涤液3次，每次30s以上，最后一次洗涤后，在吸水纸上拍干残余的洗液。
(9)加SA-HRP溶液：每孔加入100μL过氧化物酶标记的链霉素溶液(SA-HRP溶液)，37±1℃孵育40min±5min
(10)洗板：弃去板内液体，每孔加入300μL洗涤液3次，每次30s以上，最后一次洗涤后，在吸水纸上拍干残余的洗液。
(11)显色：每孔加入100μL显色液，25±1℃孵育17±2min。
(12)终止：每孔加入50μL终止液终止反应。
(13)检测读数：酶标仪读取各孔的OD值，测定波长450nm(于终止液加入10min内测定)。
A标准曲线与精密度和准确度
以理论浓度为横坐标，测得OD值与空白复孔OD均值的差为纵坐标，通过四参数回归模型来拟合标准曲线；
四参数回归模型：y＝(A-D)/[1+(x/C)B]+D，其中，A为曲线下渐近线估值，D为曲线上渐近线估值，B：曲线的斜率，C：最大结合一半时对应的浓度，测定的标准曲线见图5，相应的精密度和准确度见表18。
表18
以上述试剂盒检测了9个正常人样本人血浆中KLK1的含量，每组做两个个复孔，检测结果如表19所示。
表19
由表19所示，应用上述试剂盒检测9份正常人样本中人血浆KLK1，CV＜5％，说明本发明抗体对44H9C11(捕获抗体)&17B6-1(检测抗体)应用于酶联免疫定量检测试剂盒检测人血样本中KLK1的浓度重复性好。
对比例与市售试剂盒的比较(抗体对的评价)
以采购的R&D KLK1-Elisa试剂盒为基础，分别用本发明制备的抗体对44H9C11(捕获抗体)&17B6-1(检测抗体)和试剂盒里自带的抗体对(市售抗体对)同步检测重组小鼠KLK1标准品(R&D KLK1-Elisa试剂盒自带)和人尿液中提取纯化KLK1，其他试剂均使用该试剂盒配套试剂，操作如下：
(1)抗体包被：分别包被本发明制备的捕获抗体44H9C11(4μg/mL)和Captureantibody(R&D KLK1-Elisa试剂盒自带，4μg/mL)，100μL/孔，2～8℃过夜包被；
(2)洗涤：弃去孔内液体，加洗涤液300μL/孔，洗涤3次，倒掉，拍干；
(3)封闭：加入封闭液Superblock，300μL/孔，盖膜，37℃，封闭2h±5min；
(4)洗涤：加洗涤液300μL/孔，洗涤3次，倒掉，拍干；
(5)加样：用样品稀释液稀释重组小鼠KLK1标准品和人尿液中提取纯化KLK1分别至2000、1000、500、250、125、62.5、31.25和0pg/ml，分别加入上述浓度溶液100μL/孔，盖膜，37℃，500rpm温育1h±5min；
(6)洗涤：加洗涤液300μL/孔，洗涤3次，倒掉，拍干；
(7)加检测抗体：用1％BSA的PBS溶液稀释检测抗体，分别加稀释后已进行生物素标记的本发明制备的检测抗体17B6-1(0.5μg/mL)和Detection antibody(市售检测抗体，0.5μg/mL)，100μL/孔，盖膜，37℃温育1h±5min；
(8)洗涤：加洗涤液300μL/孔，洗涤3次，倒掉，拍干；
(9)加检测试剂：将检测试剂Streptavidin-HRP(Jackson IR Inc)用1％BSA的PBS溶液稀释至1：30000和1：80000两个稀释度，盖膜，37℃ 500rpm温育1h±5min；
(10)洗涤：加洗涤液300μL/孔，洗涤3次，倒掉，拍干；
(11)加TMB显色液：100μL/孔，盖膜，37℃温育20min；
(12)终止：加终止液，50μL/孔，室温终止反应；
(13)测定：在酶标仪测定各孔OD值，测定波长450nm。
其中重组小鼠KLK1标准品(采购的R&D KLK1-Elisa试剂盒)，浓度设置为2000、1000、500、250、125、62.5、31.25和0pg/ml，人尿液中提取纯化KLK1标准品浓度设置为2000、1000、500、250、125、62.5、31.25和0pg/ml，检测结果如表20和21所示：
表20
以重组小鼠KLK1标准品浓度为横坐标，检测器响应值OD450为纵坐标分别绘制自试剂盒里自有抗体对(市售抗体对)和本发明制备的抗体对44H9C11(捕获抗体)&17B6-1(检测抗体)的标准曲线，分别见图6和图7；
由此可见，针对市售试剂盒中原本的重组小鼠KLK1标准品，两种抗体对均可显示出检测趋势。
表21待测样本检测数值
以人尿液中提取纯化KLK1标准品浓度为横坐标，检测器响应值OD450为横坐标分别绘制试剂盒里自有抗体对(市售抗体对)和本发明制备的抗体对44H9C11(捕获抗体)&17B6-1(检测抗体)的标准曲线，其中采用试剂盒里原有的抗体(市售抗体对)进行检测时，不同浓度的人尿液中提取纯化KLK1标准品显色OD450无明显梯度趋势，因而相应的标准曲线无法绘制出来，本发明制备的抗体对44H9C11(捕获抗体)&17B6-1(检测抗体)的标准曲线相关系数R2为0.9984，见图8；由此可见，我们研发制备的抗体对既可以检测重组小鼠KLK1和人尿液中提取纯化KLK1，而市售试剂盒无法准确检测人尿液中提取纯化KLK1，由此表明我们抗体检测范围更广。
Claims (8)
1.一种抗人激肽释放酶1单克隆抗体，其特征在于，所述抗人激肽释放酶1单克隆抗体包括单克隆抗体44H9C11或单克隆抗体17B6-1；
所述单克隆抗体44H9C11包括重链CDR1、重链CDR2、重链CDR3，轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3；
所述单克隆抗体44H9C11的重链CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；
所述单克隆抗体44H9C11的重链CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；
所述单克隆抗体44H9C11的重链CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；
所述单克隆抗体44H9C11的轻链CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；
所述单克隆抗体44H9C11的轻链CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；
所述单克隆抗体44H9C11的轻链CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示；
所述单克隆抗体17B6-1包括重链CDR1、重链CDR2、重链CDR3，轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3；
所述单克隆抗体17B6-1的重链CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示；
所述单克隆抗体17B6-1的重链CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示；
所述单克隆抗体17B6-1的重链CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示；
所述单克隆抗体17B6-1的轻链CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示；
所述单克隆抗体17B6-1的轻链CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示；
所述单克隆抗体17B6-1的轻链CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示。
2.根据权利要求1所述的一种抗人激肽释放酶1单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体44H9C11的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。
3.根据权利要求1所述的一种抗人激肽释放酶1单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体17B6-1的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示。
4.一种抗人激肽释放酶1单克隆抗体对，其包括权利要求1~3任一项所述的单克隆抗体44H9C11和单克隆抗体17B6-1。
5.权利要求1-4任一项所述的抗人激肽释放酶1单克隆抗体、权利要求4所述的抗人激肽释放酶1单克隆抗体对在制备检测抗人激肽释放酶1含量的试剂盒中的应用。
6.根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述试剂盒包括胶体金免疫试剂盒、化学发光试剂盒、放射免疫试剂盒、酶联免疫试剂盒或荧光免疫试剂盒。
7.一种酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述酶联免疫试剂盒包括包被权利要求1-3任一项所述的单克隆抗体44H9C11的酶标板、辣根过氧化物酶标记链霉亲和素和生物素标记的权利要求1-3任一项所述的单克隆抗体17B6-1。
8.根据权利要求7所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述酶联免疫试剂盒还包括标准品，所述标准品为天然人KLK1。
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