CN103270417A - 分析装置和分析方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种能够简单地分析待分析靶的技术。本发明的分析装置包括基板、核酸元件和检测信号的检测部，所述核酸元件和所述检测部被布置在所述基板上，其中所述核酸元件包括第一核酸分子和第二核酸分子。所述第一核酸分子是能够与靶结合的核酸分子，而所述第二核酸分子是能够与链霉亲和素结合的核酸分子。在所述靶未结合于所述第一核酸分子的情况下，所述第二核酸分子结合所述链霉亲和素的结合能力被失活。在所述靶结合于所述第一核酸分子的情况下，所述第二核酸分子结合所述链霉亲和素的结合能力被激活。所述检测部检测所述第二核酸分子与所述链霉亲和素之间的结合。通过使用所述检测装置，所述靶结合于所述第一核酸分子，并且作为所述靶结合于所述第一核酸分子的结果，所述链霉亲和素结合于所述第二核酸分子。因此可以通过检测所述第二核酸分子与所述链霉亲和素之间的结合来分析所述靶。

Description

分析装置和分析方法
技术领域
本发明涉及分析装置和分析方法。
背景技术
在临床治疗、食品、环境等各种不同领域中，需要检测目标靶。与靶的相互作用通常被用于检测靶。其中，使用与靶特异性结合的抗体的方法已被广泛使用（专利文献1）。在这种方法中，使用例如用酶标记的标记抗体。具体来说，首先，样品中的靶与标记抗体彼此结合。然后，通过使用酶的发色底物检测标记抗体中的酶的发色反应，来分析靶。
然而，抗体是通过对动物进行免疫而获得的，因而产生了下列问题。也就是说，高毒性的靶对被免疫动物而言是致死性的。此外，在被免疫动物中，低分子靶难以作为抗原被识别。因此，获得与这些靶特异性结合的抗体是十分困难的。因此，可检测的靶是有限的。
此外，在使用抗体的情形中存在着治疗过程复杂的问题。此外，在临床治疗等中需要容易地分析许多样品，因此需要使用小型装置容易地执行检测方法。然而，在使用抗体的情况下缩小装置的尺寸是困难的。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：JP2009-133712A
发明内容
本发明待解决的问题
因此，本发明旨在提供一种能够简单地分析目标靶的新技术。
解决问题的手段
本发明的分析装置是包括基板、核酸元件和检测信号的检测部的分析装置，其中所述核酸元件和所述检测部被布置在所述基板上，所述核酸元件包括第一核酸分子和第二核酸分子，所述第一核酸分子是能够与靶结合的核酸分子，所述第二核酸分子是能够与链霉亲和素结合的核酸分子，当所述靶未结合于所述第一核酸分子时，所述第二核酸分子结合所述链霉亲和素的结合能力被失活，当所述靶结合于所述第一核酸分子时，所述第二核酸分子结合所述链霉亲和素的结合能力被激活，并且所述检测部检测所述第二核酸分子与所述链霉亲和素之间的结合。
本发明的用于分析靶的分析方法是使用本发明的分析装置来分析靶的分析方法，所述分析方法包括：向所述分析装置添加样品和链霉亲和素的添加步骤；以及在所述检测部中检测所述第二核酸分子与所述链霉亲和素之间的结合从而检测靶的检测步骤。
发明效果
根据本发明，可以简单地分析待分析目标。例如，可以将适体技术应用于本发明。适体在例如试管中获得。因此，即使是能够与高毒性化合物结合的适体和能够与低分子化合物结合的适体，也能被获得。因此，根据本发明，例如可以解决使用抗原-抗体反应等的方法所伴有的问题。此外，根据本发明，例如可以通过信号检测例如电化学检测等来执行简单分析。此外，根据本发明，例如由于使用核酸元件，因此有可能缩小装置的尺寸和将装置制造在芯片中。因此可以容易地分析许多样品。在本发明中，“分析”涵盖定量分析、半定量分析和定性分析。
附图说明
图1示出了解释图，其示意性示出了本发明中的分析装置的实例。
具体实施方式
核酸元件
如上所述，在本发明中，核酸元件包括第一核酸分子和第二核酸分子。第一核酸分子是能够与靶结合的核酸分子。第二核酸分子是能够与链霉亲和素结合的核酸分子。当靶未结合于第一核酸分子时，第二核酸分子结合链霉亲和素的结合能力被失活。当靶结合于第一核酸分子时，第二核酸分子结合链霉亲和素的结合能力被激活。
对于第一核酸分子而言，只需要是能够与靶结合的核酸分子。第一核酸分子可以按照例如待分析靶的类型来适当地选择。可以通过例如表面等离子体共振分子相互作用分析等来确定第一核酸分子是否能够与靶结合。具体来说，可以使用例如Biacore3000（商品名，GE HealthcareUK Ltd.）或Biacore X（商品名，GE Healthcare UK Ltd.）来检测结合能力。
第一核酸分子可能通过例如自身退火而具有二级结构。所述二级结构可以是例如茎环结构。
第一核酸分子的实例包括单链核酸分子和双链核酸分子。
第一核酸分子是例如其结构通过靶的结合而改变的核酸分子。结构变化是例如二级结构变化。由于第一核酸分子的结构倾向于通过靶与所述第一核酸分子的结合而改变，因此第一核酸分子优选为例如单链核酸分子。
对第一核酸分子的组分没有特别限制，例如，其实例包括核苷酸残基。核苷酸残基的实例包括核糖核苷酸残基和脱氧核糖核苷酸残基。核苷酸残基涵盖例如修饰的核苷酸残基，并且可以是例如核糖核苷酸残基的衍生物、脱氧核糖核苷酸残基的衍生物等。第一核酸分子可以是例如仅由核苷酸残基构成的核酸分子或含有核苷酸残基的核酸分子。例如，第一核酸分子可以仅含核糖核苷酸残基、仅含脱氧核糖核苷酸残基或含有它们两者作为核苷酸残基。具体来说，第一核酸分子的实例包括由多核糖核苷酸构成的RNA、含有多核糖核苷酸的RNA、由脱氧核糖核苷酸构成的DNA和含有脱氧核糖核苷酸的DNA。
修饰的核苷酸残基可以是例如通过修饰糖残基获得的核苷酸残基。糖残基的实例包括核糖残基和脱氧核糖残基。对糖残基中待修饰的位点没有特别限制，并且可以是例如糖残基的2’位和/或4’位。修饰的实例包括甲基化、氟化、氨基化和硫杂化。修饰的核苷酸残基的实例包括2’-甲基嘧啶残基和2’-氟嘧啶。修饰的核苷酸残基的具体实例包括2’-甲基尿嘧啶（2’-甲基化-尿嘧啶核苷酸残基）、2’-甲基胞嘧啶（2’-甲基化-胞嘧啶核苷酸残基）、2’-氟尿嘧啶（2’-氟化-尿嘧啶核苷酸残基）、2’-氟胞嘧啶（2’-氟化-胞嘧啶核苷酸残基）、2’-氨基尿嘧啶（2’-氨基化-尿嘧啶-核苷酸残基）、2’-氨基胞嘧啶（2’-氨基化-胞嘧啶核苷酸残基）、2’-硫尿嘧啶（2’-硫杂化-尿嘧啶核苷酸残基）和2’-硫胞嘧啶（2’-硫杂化-胞嘧啶核苷酸残基）。
核苷酸残基中的碱基可以是例如天然碱基（非人造碱基）或非天然碱基。天然碱基的实例包括A、C、G、T、U及其修饰碱基。非天然碱基的实例包括修饰碱基和改变的碱基，并且非天然碱基优选具有与相应的天然碱基相似的功能。具有与相应的天然碱基相似的功能的人造碱基的实例包括：能够代替鸟嘌呤（g）与胞嘧啶（c）结合的人造碱基、能够代替胞嘧啶（c）与鸟嘌呤（g）结合的人造碱基、能够代替腺嘌呤（a）与胸腺嘧啶（t）或尿嘧啶（u）结合的人造碱基、能够代替胸腺嘧啶（t）与腺嘌呤（a）结合的人造碱基以及能够代替尿嘧啶（u）与腺嘌呤（a）结合的人造碱基。修饰碱基的实例包括甲基化碱基、氟化碱基、氨基化碱基和硫杂化碱基。修饰碱基的具体实例包括2’-甲基尿嘧啶、2’-甲基胞嘧啶、2’-氟尿嘧啶、2’-氟胞嘧啶、2’-氨基尿嘧啶、2’-氨基胞嘧啶、2-硫尿嘧啶和2-硫胞嘧啶。在本发明中，除了天然碱基之外，由a、g、c、t和u所表示的碱基还涵盖例如具有与天然碱基相似的功能的人造碱基。
第一核酸分子可以含有例如人造核酸单体残基作为组分。人造核酸单体残基的实例包括PNA（肽核酸）、LNA（锁核酸）和ENA（2’-O,4’-C-亚乙基桥接的核酸）。单体残基中的碱基可以例如与上面提到的碱基相同。
在第一核酸分子是单链核酸分子的情形中，单链核酸分子的实例包括单链DNA和单链RNA。在第一核酸分子是双链核酸分子的情形中，双链核酸分子的实例包括双链DNA、双链RNA和DNA-RNA双链。
第一核酸分子可以具有例如天然核酸序列或合成的核酸序列。对合成第一核酸分子的方法没有特别限制，并且可以是例如通过核酸合成仪例如DNA合成仪或RNA合成仪，使用核苷酸例如NTP和dNTP从其末端化学合成第一核酸的方法。
第一核酸分子优选为例如适体。适体通常是指能够与特定靶特异性结合的核酸分子。如上所述，适体可以是例如DNA、RNA、单链核酸分子例如单链RNA或单链DNA以及双链核酸分子例如双链RNA或双链DNA中的任一种。
对第一核酸分子的长度没有特别限制。对长度没有特别限制，其下限是例如7mer，并且其上限是例如120mer。长度优选为80mer、更优选为35mer、还更优选为20mer。第一核酸分子的长度范围为例如7至120mer，优选为7至80mer，更优选为7至35mer，还更优选为7至20mer。
正如上面提到的，第一核酸分子可以按照待分析靶的类型来适当地选择，完全不受限制。
对生产适体的方法没有特别限制，例如，可以通过上述已知合成方法来生产适体。此外，可以通过例如已知的SELEX（指数富集配体系统进化（Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment））方法等来生产能够与特定靶结合的适体。
对通过SELEX方法的适体生产没有特别限制，并且例如可以如下进行。首先，提供含有多种核酸分子的核酸库。然后，使核酸库中的核酸分子与靶结合（缔合），以便在核酸分子与靶之间形成复合物。然后，在获得的复合物中收集参与复合物形成的核酸分子。由此可以生产与靶特异性结合的适体。
第二核酸分子是能够与链霉亲和素结合的核酸分子。当靶未结合于第一核酸分子时，第二核酸分子结合链霉亲和素的结合能力被失活。当靶结合于第一核酸分子时，第二核酸分子结合链霉亲和素的结合能力被激活。
在本发明中，“能够与链霉亲和素结合”可以是能够与例如链霉亲和素、链霉亲和素片段和链霉亲和素衍生物中的任一种结合。例如，当链霉亲和素与另一种物质形成复合物时，第二核酸分子可以与复合物中的链霉亲和素结合。
例如，可以通过如上所述的表面等离子体共振分子相互作用分析等来确定第二核酸分子是否能够与链霉亲和素结合。
第二核酸分子可能通过例如自身退火而具有二级结构。所述二级结构可以是例如茎环结构。
第二核酸分子的实例包括单链核酸分子和双链核酸分子。
第二核酸分子是例如其结构通过第一核酸分子的结构变化而改变的核酸分子。第二核酸分子的结构变化是例如二级结构的变化。由于第二核酸分子的结构倾向于通过第一核酸分子的结构变化而改变，因此第二核酸分子优选为例如单链核酸分子。
例如，对第二核酸分子的组分没有特别限制。例如，其组分与为第一核酸分子示出的那些组分相同。第二核酸分子可以是例如仅由核苷酸残基构成的核酸分子或含有核苷酸残基的核酸分子。例如，第二核酸分子可以仅含核糖核苷酸残基、仅含脱氧核糖核苷酸残基或含有它们两者作为核苷酸残基。具体来说，第二核酸分子的实例包括由多核糖核苷酸构成的RNA、含有多核糖核苷酸的RNA、由脱氧核糖核苷酸构成的DNA和含有脱氧核糖核苷酸的DNA。
在第二核酸分子是单链核酸分子的情形中，单链核酸分子的实例包括单链DNA和单链RNA。在第二核酸分子是双链核酸分子的情形中，双链核酸分子的实例包括双链DNA、双链RNA和DNA-RNA双链。
第二核酸分子可以具有例如天然核酸序列或合成的核酸序列。对合成第二核酸分子的方法没有特别限制，并且可以例如与为第一核酸分子示出的方法相同。
第二核酸分子优选为例如适体。如上所述，适体可以是例如DNA、RNA、单链核酸分子例如单链RNA或单链DNA以及双链核酸分子例如双链RNA或双链DNA中的任一种。
对第二核酸分子的长度没有特别限制。对长度没有特别限制，其下限是例如7mer，并且其上限是例如120mer。长度优选为80mer、更优选为35mer、还更优选为20mer。第二核酸分子的长度范围为例如7至120mer，优选为7至80mer，更优选为7至35mer，还更优选为7至20mer。
例如，第二核酸分子优选含有下列多核苷酸（a）至（d）中的任一种：
（a）由SEQ ID NO：1至10任一项所表示的碱基序列构成的多核苷酸；
（b）由通过在碱基序列（a）中置换、缺失、添加和/或插入一个或多个碱基而获得的碱基序列构成并且能够与链霉亲和素结合的多核苷酸；
（c）由与碱基序列（a）具有50%以上同一性的碱基序列构成并且能够与链霉亲和素结合的多核苷酸；以及
（d）由在严格条件下与碱基序列（a）杂交的碱基序列或与其互补的碱基序列构成并且能够与链霉亲和素结合的多核苷酸。
SEQ ID NO：1至10的碱基序列如下所示。在每个碱基序列中，带下划线的碱基表示共有序列。
SEQ ID NO：1（85）
taatacgact cactatagca atggtacggt acttcccgac gcaccgatcg caggttcgggacaaaagtgc acgctacttt gctaa
SEQ ID NO：2（18）
AC GCACCGATCG CAGGTT
SEQ ID NO：3（20）
GAC GCACCGATCG CAGGTTC
SEQ ID NO：4（22）
CGAC GCACCGATCG CAGGTTCG
SEQ ID NO：5（24）
CCGAC GCACCGATCG CAGGTTCGG
SEQ ID NO：6（26）
CCCGAC GCACCGATCG CAGGTTCGGG
SEQ ID NO：7（28）
TCCCGAC GCACCGATCG CAGGTTCGGG A
SEQ ID NO：8（60_3-10）
GCA ATGGTACGGT ACTTCCCGAC GCACCGATCG CAGGTTCGGGACAAAAG
SEQ ID NO：9（60_5-10）
GGT ACTTCCCGAC GCACCGATCG CAGGTTCGGG ACAAAAGTGCACGCTAC
SEQ ID NO：10（60）
GCA ATGGTACGGT ACTTCCCGAC GCACCGATCG CAGGTTCGGGACAAAAGTGC ACGCTAC
在所述碱基序列中，SEQ ID NO：2至10任一项的碱基序列是优选的，这是由于所述碱基序列对链霉亲和素具有优越的结合性质，并且可以例如通过所述碱基序列容易地设计第二核酸分子。
第二核酸分子可以是例如含有由所述碱基序列构成的多核苷酸的核酸分子，或由所述多核苷酸构成的核酸分子。
在后文中，由多核苷酸（a）构成的核酸分子或含有多核苷酸（a）的核酸分子被称为核酸分子（a）。由多核苷酸（b）构成的核酸分子或含有多核苷酸（b）的核酸分子被称为核酸分子（b）。由多核苷酸（c）构成的核酸分子或含有多核苷酸（c）的核酸分子被称为核酸分子（c）。由多核苷酸（d）构成的核酸分子或含有多核苷酸（d）的核酸分子被称为核酸分子（d）。
核酸分子（a）是例如由多核苷酸（a）构成的核酸分子或含有多核苷酸（a）的核酸分子，
（a）由SEQ ID NO：1至10任一项所表示的碱基序列构成的多核苷酸。
核酸分子（a）是例如能够形成由下面的通式（1）表示的结构的核酸分子。所述核酸分子是例如满足通式（1）并由SEQ ID NO：1的碱基序列或其部分序列构成或含有SEQ ID NO：1的碱基序列或其部分序列的核酸分子。
Figure BDA00003396686300101
在通式（1）中，在每个碱基旁边的数字指示所述碱基在SEQ ID NO：1的碱基序列中的位置，并不一定指示所述碱基在由通式（1）表示的核酸分子中的位置。在通式（1）中，每个星号指示氢键，并表示能够形成茎结构。在通式（1）中，每个N1和N2指示核苷酸残基。在通式（1）中，n1指示核苷酸残基N1的数量，并且n2指示核苷酸残基N2的数量。(N1)n1和(N2)n2可以通过相互形成氢键来形成茎结构。在(N1)n1具有多个核苷酸残基的情况下，所述核苷酸残基可以彼此相同或不同。在(N2)n2具有多个核苷酸残基的情况下，所述核苷酸残基可以彼此相同或不同。
如通式（1）中所示，例如在由SEQ ID NO：1表示的碱基序列中，40至42位的碱基序列能够形成凸出结构，46至52位的碱基序列能够形成环结构，并且43至45位的碱基序列和53至55位的碱基序列能够形成茎结构。如通式（1）中所示，在核酸分子的由SEQ ID NO：1表示的碱基序列中，在39位碱基上游（5’侧）的序列“(N1)n1-A”和在56位碱基下游（3’侧）的序列“T-(N2)n2”可以形成茎结构。
在本发明中，“能够形成环结构”例如涵盖了确实形成环结构，以及尽管没有形成环结构，但能够根据条件形成环结构。此外，“能够形成环结构”还涵盖了例如通过实验检查和通过计算机模拟预测这两种情形。在本发明中，“能够形成茎结构”例如涵盖了确实形成茎结构，以及尽管没有形成茎结构，但能够根据条件形成茎结构。此外，“能够形成环结构”还涵盖了例如通过实验检查和通过计算机模拟预测这两种情形。
例如，在通式（1）中，n1和n2各自为0、1、2、3、4或5，并且彼此相同。
例如，在n1和n2为0的情况下，“(N1)n1-A”为“A”，“T-(N2)n2”为“T”，通式（1）的序列由SEQ ID NO：2表示，并且茎结构具有一个碱基对。
例如，在n1和n2为1的情况下，“(N1)n1-A”为“GA”，“T-(N2)n2”为“TC”，通式（1）的序列由SEQ ID NO：3表示，并且茎结构具有两个碱基对。
例如，在n1和n2为2的情况下，“(N1)n1-A”为“CGA”，“T-(N2)n2”为“TCG”，通式（1）的序列由SEQ ID NO：4表示，并且茎结构具有三个碱基对。
例如，在n1和n2为3的情况下，“(N1)n1-A”为“CCGA”，“T-(N2)n2”为“TCGG”，通式（1）的序列由SEQ ID NO：5表示，并且茎结构具有四个碱基对。
例如，在n1和n2为4的情况下，“(N1)n1-A”为“CCCGA”，“T-(N2)n2”为“TCGGG”，通式（1）的序列由SEQ ID NO：6表示，并且茎结构具有五个碱基对。
例如，在n1和n2为5的情况下，“(N1)n1-A”为“TCCCGA”，“T-(N2)n2”为“TCGGGA”，通式（1）的序列由SEQ ID NO：7表示，并且茎结构具有六个碱基对。
如上所述，核酸分子（a）可以是例如由通式（1）表示的结构的核酸分子或含有由通式（1）表示的结构的核酸分子。在后一种情况下，例如可以在通式（1）中(N1)n1的上游侧和(N2)n2的下游侧中任一个或两者上进一步添加序列。例如，可以在由SEQ ID NO：1表示的碱基序列的基础上设定附加序列，并且对由附加序列形成的结构没有特别限制。
如上所述，核酸分子（b）是例如含有多核苷酸（b）的核酸分子或由多核苷酸（b）构成的核酸分子，
（b）由通过在碱基序列（a）中置换、缺失、添加和/或插入一个或多个碱基而获得的碱基序列构成并且能够与链霉亲和素结合的多核苷酸。
在碱基序列（a）中，对“一个或多个”没有特别限制，例如为1至5、优选为1至4、更优选为1至3、还更优选为1或2，特别优选为1。
如上所述，核酸分子（c）是例如含有多核苷酸（c）的核酸分子或由多核苷酸（c）构成的核酸分子，
（c）由与碱基序列（a）具有50%以上同一性的碱基序列构成并且能够与链霉亲和素结合的多核苷酸。
在多核苷酸（c）中，同一性（同源性）为例如60%以上、优选70%以上、更优选80%以上、还更优选90%以上、更进一步优选95%以上、特别优选99%以上。例如可以使用BLAST等在默认条件下计算同一性。
如上所述，核酸分子（d）是例如含有多核苷酸（d）的核酸分子或由多核苷酸（d）构成的核酸分子，
（d）由在严格条件下与碱基序列（a）杂交的碱基序列或与其互补的碱基序列构成并且能够与链霉亲和素结合的多核苷酸。
在多核苷酸（d）中，“在严格条件下杂交”意味着在例如本领域技术人员公知的实验条件下杂交。具体来说，“严格条件”是指例如在0.7至1mol/l NaCl存在下在60℃至68℃下进行杂交并在其后使用0.1至2倍SSC溶液在65℃至68℃下洗涤后，可以鉴定碱基序列的条件。在这里请注意，1×SSC由150mmol/L NaCl和15mmol/L柠檬酸钠构成。
每个核酸分子（b）、（c）和（d）的全长是例如18至60mer，优选为18至50mer，具体来说为18mer、20mer、22mer、24mer、26mer、28mer或50mer。
在第二核酸分子是双链核酸分子的情况下，第二核酸分子可以是例如单链多核苷酸（a）至（d）中的任一种和由与其互补的相应碱基序列构成的单链多核苷酸中的任一种的双链核酸分子。在第二核酸分子是双链核酸分子的情况下，可以在其使用前通过例如变性等使双链核酸分子成为单链核酸分子。
第二核酸分子可以例如根据上述碱基序列的信息通过已知方法来生产。对所述已知方法没有特别限制，其实例包括使用自动合成装置的化学合成法、使用各种聚合酶通过酶反应的合成法以及通过从DNA模板体外转录的合成。
第二核酸分子可以通过例如下述方法来生产，在所述方法中，使用核酸分子库和链霉亲和素形成核酸分子库与链霉亲和素之间的复合物，并选择参与复合物形成的核酸分子候选物。这样的方法的实例包括根据SELEX方法及其等同方法所述的方法，以及使用其上固定有链霉亲和素的载体来形成复合物并在其后收集参与复合物形成的核酸分子候选物的方法。载体的实例包括琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶。
第二核酸分子可以通过例如对通过上述方法获得的核酸分子进行部分改变来生产。例如，在这种情况下，可以参考使用根据获得的核酸分子的碱基序列来预测二级结构的方法所获得的结果，来改变核酸分子。对用于预测二级结构的方法没有特别限制，并且其可以是例如搜索核酸分子的二级结构候选物并在所述二级结构候选物中预测能量上稳定的二级结构的方法。二级结构的预测可以是例如基于使二级结构候选物的能量函数最小化而进行的二级结构预测，所述二级结构候选物通过将核酸分子的碱基序列分成由例如沃森-克里克（Watson-Crick）类型的碱基对构成的茎区域和单链区域例如由茎区域之外的碱基构成的环结构来获得。
下面描述基于使二级结构候选物的能量函数最小化而进行的二级结构预测。首先，在靶核酸分子的碱基序列中搜索由例如沃森-克里克类型的碱基对构成的碱基候选物和这些碱基对候选物之外的单链区的候选物。然后，通过从搜索到的碱基对的候选物和单链区的候选物的所有组合中排除理论上不可能的组合，例如其中构成碱基对的候选物的碱基与构成单链区的候选物的碱基部分重叠的组合等，来鉴定二级结构候选物。计算二级结构候选物的能量函数，并从鉴定到的二级结构候选物中搜索具有最小能量函数的二级结构。此时，计算二级结构候选物的能量函数的方法可以是，根据构成二级结构候选物的每个茎区域和每个单链区的自由能，将二级结构候选物的该自由能用作二级结构候选物的能量函数的方法。如上所述在二级结构候选物中鉴定到的具有最小能量函数的二级结构被用作靶核酸分子的碱基序列的二级结构。
可以通过参考如上所述获得的二级结构结果，置换或缺失构成二级结构中的特征性位点的碱基，或向二级结构中的特征性部分插入或添加碱基，来改变第二核酸分子。例如，可以使用如上所述提供的核酸分子作为母体分子，来置换构成二级结构的茎区域和/或单链区的一些碱基。可以缺失构成二级结构的茎区域和/或单链区的一些碱基。可以通过向二级结构的茎区域和/或单链区插入或添加单个碱基或多个碱基，来缩短和/或延长茎区域和/或单链区的长度。
在第一核酸分子和/或第二核酸分子是RNA的情况下，所述RNA可以优选具有例如核糖核酸酶耐受性。对制造具有核糖核酸酶耐受性的核酸分子的方法没有特别限制。具体来说，所述方法的实例包括通过甲基化等对构成RNA的一部分核糖核苷酸残基进行修饰的方法，以及将一部分或全部核糖核苷酸残基制造成脱氧核糖核苷酸（DNA）或LNA的方法。在核酸分子是含有脱氧核糖核苷酸残基的RNA的情况下，对脱氧核糖核苷酸残基的位点没有特别限制，并且例如优选为能够形成茎结构的区域。在核酸分子是含有单体残基例如LNA的RNA的情况下，对单体残基的位点没有特别限制，并且例如优选为能够形成茎结构的区域。除了这些方法之外，方法可以是将具有数万道尔顿的PEG（聚乙二醇）或脱氧胸苷结合到第一核酸分子和/或第二核酸分子的5’末端和/或3’末端的方法。
第一核酸分子和/或第二核酸分子可以是例如通过对一部分如上所述的核苷酸残基进行修饰而获得的修饰的核苷酸残基。对核酸分子中修饰的核苷酸残基的位点没有特别限制，并且例如优选为能够形成茎结构的区域的末端和能够形成环结构或凸出结构的区域的末端。
正如上面提到的，在本发明中，核酸元件包含第一核酸分子和第二核酸分子。核酸元件可以是例如仅由第一核酸分子和第二核酸分子构成的元件，或者还可以包括另一种组分。所述另一种组分可以是例如连接物。
对连接物的组分没有特别限制，例如与上面为第一核酸分子和第二核酸分子所提到的那些组分相同。连接物可以是例如仅由核苷酸残基构成的核酸分子或含有核苷酸残基的核酸分子。连接物可以是例如单链核酸分子或双链核酸分子。在连接物是单链核酸分子的情况下，其实例包括单链DNA和单链RNA。在连接物是双链核酸分子的情况下，其实例包括双链DNA、双链RNA和DNA-RNA的双链。对连接物的长度没有特别限制。
在核酸元件中，第一核酸分子和第二核酸分子优选彼此连接，例如第一核酸分子的一个末端连接到第二核酸分子的一个末端。例如，可以将第一核酸分子的5’末端连接到第二核酸分子的3’末端，或者可以将第一核酸分子的3’末端连接到第二核酸分子的5’末端。前者是优选的。
第一核酸分子和第二核酸分子可以例如彼此直接或间接连接。
在直接连接的情况下，第一核酸分子的一个末端与第二核酸分子的一个末端通过例如磷酸二酯结合彼此连接。具体来说，直接结合可以是例如第一核酸分子的5’末端通过磷酸二酯结合连接到第二核酸分子的3’末端，或者第一核酸分子的3’末端通过磷酸二酯结合连接到第二核酸分子的5’末端。前者是优选的。
在间接连接的情况下，第一核酸分子和第二核酸分子通过例如连接物彼此连接。在后文中，插于第一核酸分子与第二核酸分子之间的连接物被称为间插连接物或间插序列。间插连接物可以是例如一个末端连接到第一核酸分子的一个末端并且另一个末端连接到第二核酸分子的一个末端的形式。具体来说，间接连接是例如间插连接物的一个末端连接到第一核酸分子的5’末端并且另一个末端连接到第二核酸分子的3’末端，或者可以是一个末端连接到第一核酸分子的3’末端并且另一个末端连接到第二核酸分子的5’末端。前者是优选的。第一核酸分子或第二核酸分子与连接物的连接可以是例如通过磷酸二酯结合的连接。
核酸元件还可以在其任一末端侧上具有连接物。在后文中，该连接物被称为附加连接物或附加序列。核酸元件可以在例如第一核酸分子中与第二核酸分子连接的末端相反的末端处、或第二核酸分子中与第一核酸分子连接的末端相反的末端处具有连接物。核酸元件可以在第一核酸分子中的相反末端和第二核酸分子中的相反末端的每一个处具有附加连接物。
对核酸元件的全长没有特别限制，例如可以根据如上述第一核酸分子和第二核酸分子的长度以及连接物的长度来适合地设定。在核酸元件中，第一核酸分子和第二核酸分子的长度可以彼此相同或不同。
核酸元件优选为例如通过将第一核酸分子与第二核酸分子彼此连接而获得的单链核酸分子。在核酸元件是单链核酸分子的情况下，第一核酸分子的结构通过靶与第一核酸分子的结合而改变，并且这种变化例如容易地引起第二核酸分子的结构变化。如上所述，所述结构变化是例如二级结构变化。
对用于设计核酸元件的方法没有特别限制，只要例如在核酸分子中第一核酸分子与第二核酸分子彼此连接即可。具体来说，如下所述来设计核酸元件。将第一核酸分子与第二核酸分子彼此连接，使得当靶未结合于第一核酸分子时，第二核酸分子结合链霉亲和素的结合能力被失活，并且当靶结合于第一核酸分子时，第二核酸分子结合链霉亲和素的结合能力被激活。
优选情况下，第二核酸分子结合链霉亲和素的结合能力例如如下所述在核酸元件中进行控制。也就是说，在核酸元件中，通过例如在靶未结合于第一核酸分子的状态下将第二核酸分子锁定，来失活第二核酸分子结合链霉亲和素的结合能力。此外，通过靶与第一核酸分子的结合，通过自缔合来激活第二核酸分子结合链霉亲和素的结合能力。
具体来说，核酸元件例如可以是下列形式。例如，在靶未结合于第一核酸分子的状态下，第一核酸分子的一部分与第二核酸分子的一部分在核酸元件中形成茎结构，第二核酸分子被所述茎结构锁定，并且第一核酸分子形成茎环结构作为要与靶结合的位点。另一方面，第一核酸分子的所述部分和第二核酸分子的所述部分的茎结构通过靶与第一核酸分子的结合而被释放，从而释放了第二核酸分子的锁定，并且第二核酸分子结合链霉亲和素的结合能力通过第二核酸分子的自缔合而被激活。
在核酸元件包括间插连接物和附加连接物的情况下，优选例如如下所述来控制第二核酸分子结合链霉亲和素的结合能力。例如，在核酸元件中，间插连接物的一个末端连接到第一核酸分子的5’末端，另一个末端连接到第二核酸分子的3’末端，并且附加连接物连接到第一核酸分子的3’末端。在例如靶未结合于核酸元件中的第一核酸分子的状态下，间插连接物与第一核酸分子的3’末端区域形成茎结构，并且附加连接物与第二核酸分子的3’末端区域形成茎结构。于是，第二核酸分子被所述茎结构锁定，因此第二核酸分子结合链霉亲和素的结合能力被失活。此外，第一核酸分子形成茎环结构作为要与靶结合的位点。另一方面，具有间插连接物的茎结构和具有附加连接物的茎结构通过靶与第一核酸分子的结合而被释放。因此，第二核酸分子的锁定被释放，并且第二核酸分子结合链霉亲和素的结合能力通过第二核酸分子的自缔合而被激活。
例如，核酸元件可以通过生产第一核酸分子和第二核酸分子、然后将它们彼此结合来获得，或者可以通过设计它们在其中彼此连接的序列、然后在所述序列的基础上合成核酸分子来获得。此时，可以通过例如使用计算机等预测二级结构来修饰所述序列。
分析装置
如上所述，本发明的分析装置是包括基板、核酸元件和检测信号的检测部的分析装置，其中所述核酸元件和检测部被布置在基板上，所述核酸元件包括第一核酸分子和第二核酸分子，所述第一核酸分子是能够与靶结合的核酸分子，所述第二核酸分子是能够与链霉亲和素结合的核酸分子，当所述靶未结合于所述第一核酸分子时，所述第二核酸分子结合所述链霉亲和素的结合能力被失活，当所述靶结合于所述第一核酸分子时，所述第二核酸分子结合所述链霉亲和素的结合能力被激活，并且所述检测部检测所述第二核酸分子与所述链霉亲和素之间的结合。在本发明中，所述核酸元件与上面提到的相同。
检测部只需检测第二核酸分子与链霉亲和素之间的结合。具体来说，例如，检测部只需检测源自于结合的信号。信号的实例包括光信号例如发色信号或发光信号，以及电信号。
正如下面提到的，在使用分析装置的分析中，优选使用通过用标记物质标记链霉亲和素而获得的标记的链霉亲和素作为链霉亲和素。源自于结合的信号优选为例如源自于标记物质的信号。
标记物质优选为发出信号的标记物质。标记物质可以是例如独立地或间接地发出信号的标记物质。在前一种情况下，标记物质的实例包括荧光团和放射性同位素，其信号可以根据标记物质的类型通过在各种条件下执行方法来检测。在后一种情况下，标记物质可以是例如酶，并且优选为催化氧化还原反应的酶。在这种情况下，信号优选为例如通过氧化还原反应从底物发出的信号，具体来说，通过使酶在底物存在下进行反应来产生信号。氧化还原反应只需在例如从底物生成产物的过程中引起两种底物之间的电子传递。酶的实例包括过氧化物酶例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、脲酶、过氧化氢酶、葡萄糖氧化酶、乳酸脱氢酶和淀粉酶。
底物可以例如按照酶的类型来适合地决定。在酶是过氧化物酶的情况下，对底物没有特别限制，其实例包括3,3’,5,5’-四甲基联苯胺（TMB）、1,2-苯二胺（OPD）、2,2’-连氮基双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)铵盐（ABTS）、3,3’-二氨基联苯胺（DAB）、3,3’-二氨基联苯胺四盐酸盐水合物（DAB4HCl）、3-氨基-9-乙基咔唑（AEC）、4-氯-1-萘酚（4C1N）、2,4,6-三溴-3-羟基苯甲酸、2,4-二氯苯酚、4-氨基安替比林、4-氨基安替比林盐酸盐和鲁米诺。
本发明的分析装置还可以包括试剂部，所述试剂部例如含有用于氧化还原反应的底物。试剂部例如优选被布置在检测部中，更优选被布置在电极系统上。
在信号是电信号的情况下，检测部具有例如电极系统。例如，电极系统可以包括工作电极和反电极，或者可以包括工作电极、反电极和参比电极。对电极的材料没有特别限制，其实例包括铂、银、金和碳。工作电极和反电极的实例包括铂电极、银电极、金电极和碳电极。参比电极可以是例如银/氯化银电极。银/氯化银电极可以通过例如将氯化银电极层压在银电极上来形成。
例如，可以通过将电极布置在基板的上表面上，来形成检测部。对用于布置电极的方法没有特别限制，例如可以使用已知方法，其具体实例包括薄膜形成方法例如蒸发法、溅射法、丝网印刷法和镀层法。电极例如可以被直接或间接布置在基板上。间接布置可以是例如经由另一种元件进行的布置（在后文中同样适用）。
正如上面提到的，核酸元件只需要被布置在基板上。优选情况下，将核酸元件固定在基板上。核酸元件例如可以被直接或间接布置在基板的表面上。具体来说，例如，核酸元件优选被布置在基板的检测部上，更优选在检测部中的电极上，还更优选在电极中的工作电极上。例如，核酸元件可以被直接或间接布置在检测部或电极上。在后文中，除非另有指明，否则“核酸元件布置或固定在基板上”涵盖核酸元件布置或固定在基板中的检测部上或检测部中的电极上。
对用于布置核酸元件的方法没有特别限制，并且可以使用用于固定核酸的常规已知方法。用于固定核酸的方法可以是例如将预先制备的核酸固定在基板上、优选在检测部上、更优选在电极上的方法。这种方法是例如利用光刻术的方法，其具体实例可以在参考文献例如美国专利号5,424,186等中找到。此外，用于固定核酸的方法可以是例如在基板上、优选在检测部上、更优选在电极上合成核酸元件的方法。这种方法可以是例如斑点法，其具体实例可以在参考文献例如美国专利号5,807,522和JP H10-503841 A中找到。
例如，核酸元件中第一核酸分子的末端侧和第二核酸分子的末端侧中的任一个可以被布置在基板上。末端侧可以是例如核酸元件中第一核酸分子或第二核酸分子的一个末端。在第一核酸分子具有附加连接物的情况下，末端侧可以是例如附加连接物的与连接第一核酸分子的末端相反的末端。另一方面，当第二核酸分子具有附加连接物时，末端侧可以是例如附加连接物的与连接第二核酸分子的末端相反的末端，并且这种形式是优选的。
本发明的分析装置可以例如包括仅仅一种类型的核酸元件或两种以上类型的其靶各不相同的核酸元件。在后一种情况下，优选每种核酸元件具有能够与不同靶结合的第一核酸。如上所述，当本发明的分析装置包括两种以上类型的其靶各不相同的核酸元件时，有可能例如通过一个分析装置检测两种以上类型的靶。在本发明的分析装置包括两种以上类型的核酸元件的情形下，优选的是，分析装置包括多个检测部，并且不同的核酸元件被布置在相应的检测部中。这样的分析装置例如可以通过以下方式来形成：将基板的表面划分成多个基质，在相应的划分区域中形成上述电极系统，并将核酸元件布置在相应的检测部中。在本发明的分析装置中，对被布置在一个检测部中的核酸元件的数量没有特别限制。
对基板没有特别限制，并且其优选为例如具有绝缘表面的基板。基板可以是例如由绝缘材料构成的基板或在其表面上具有由绝缘材料构成的绝缘层的基板。对绝缘材料没有特别限制，其实例包括已知材料例如玻璃、陶瓷、绝缘塑料和纸。对绝缘塑料没有特别限制，其实例包括硅酮树脂、聚酰亚胺树脂、环氧树脂和含氟树脂。
对将要通过本发明的分析装置分析的靶没有特别限制。靶的实例包括高分子化合物、低分子化合物、有机化合物和无机化合物。高分子化合物或有机化合物的实例包括微生物、病毒、多糖、蛋白质、核酸和树脂。低分子化合物的实例包括杀虫剂、药物、化学剂、寡糖、单糖、脂质、寡肽、氨基酸、维生素和生物活性物质。无机化合物的实例包括矿物质、无机酸和金属。
对本发明中的待分析样品没有特别限制，其实例包括食品、药物、化学剂、土壤、动物、植物、微生物、病毒、水、垃圾和废物。食品的实例包括食物和饮料。水的实例包括自来水、排水、河水、海水、雨水和雪。
接下来，参考具体实例来描述本发明的分析装置。在这里需要指出，本发明不受下面实例的限制。
图1示出了本发明的分析装置的实例的示意图。如图1中所示，分析装置1包括基板10、电极20和核酸元件40，电极20被布置在基板10上，核酸元件40被固定在电极20上。在基板10上，其中布置有电极20的区域是检测部。核酸元件40是由第一核酸分子41、第二核酸分子42、间插连接物43、第一附加连接物44和第二附加连接物45构成的单链核酸分子。在核酸元件40中，第一核酸分子41与第二核酸分子42经由间插连接物43彼此连接，第一附加连接物44连接到第一核酸分子41的末端，并且第二附加连接物45连接到第二核酸分子42的末端。核酸元件40经由与第二核酸分子42连接的第二附加连接物45而被固定在电极20上。第一核酸分子41优选为单链，并且优选在未结合于靶的状态下通过自身退火而形成茎环结构，如图1的左图中所示。
下面参考使用第一核酸分子41作为能够与靶50结合的适体并使用第二核酸分子42作为能够与通过用过氧化物酶标记链霉亲和素而获得的标记的链霉亲和素结合的DNA的实例，来描述使用分析装置1的方法。
首先，向分析装置1的检测部添加样品。如图1的左图中所示，当样品中不存在靶50时，靶不与核酸元件40的第一核酸分子41结合，使得第二核酸分子42不与链霉亲和素结合。具体来说，第二核酸分子42与第一附加连接物44形成茎结构，使得第二核酸分子42被锁定，并且第二核酸分子42结合链霉亲和素的结合能力被失活。因此，不存在由过氧化物酶引起的电子传递，使得不能通过检测部的电极20检测到电信号。另一方面，如图1的右图中所示，当样品中存在靶50时，靶与核酸元件40的第一核酸分子41结合，使得第二核酸分子42的结构改变成能够与链霉亲和素结合的二级结构。具体来说，当靶50结合于第一核酸分子41时，第一核酸分子41的结构改变，使得第二核酸分子42与第一附加连接物44的茎结构被释放。因此，第二核酸分子42自身缔合，并且第二核酸分子42结合链霉亲和素的结合能力被激活。
然后，向检测部添加标记的链霉亲和素，使得标记的链霉亲和素结合于其结合能力被激活的第二核酸分子42。然后，洗涤检测部，以便去除未结合于第二核酸分子42的标记的链霉亲和素。随后向检测部添加底物，以便通过标记的链霉亲和素中的过氧化物酶执行酶反应。在通过过氧化物酶从底物生成产物的过程中，电子被转移。因此，可以通过检测部中的电极20检测电信号。如上所述，根据分析装置1，可以通过检测电信号来分析样品中靶的存在或不存在。
对添加样品和标记的链霉亲和素的顺序没有特别限制，例如，它们可以被同时添加，可以在添加样品后添加标记的链霉亲和素，或者可以在添加标记的链霉亲和素后添加样品。对添加底物的顺序没有特别限制，例如，优选在添加样品和标记的链霉亲和素后添加底物。
分析方法
如上所述，本发明的分析方法是使用本发明的分析装置来分析靶的分析方法，所述分析方法包括：向所述分析装置添加样品和链霉亲和素的添加步骤；以及在所述检测部中检测所述第二核酸分子与所述链霉亲和素之间的结合从而检测靶的检测步骤。
例如可以以为本发明的分析装置所描述的相同方式来执行本发明的分析方法。
对添加样品和链霉亲和素的顺序没有特别限制，例如，样品和链霉亲和素可以被同时添加，可以在添加样品后添加链霉亲和素，或者可以在添加链霉亲和素后添加样品。链霉亲和素优选为通过将标记物质与链霉亲和素结合而获得的标记的链霉亲和素。
如上所述，标记物质是例如独立地或间接地发出信号的标记物质。后一类标记物质优选为催化氧化还原反应的酶，例如优选在用于氧化还原反应的底物存在下执行检测步骤。
如上所述，检测步骤是检测第二核酸分子与链霉亲和素之间的结合从而检测靶的检测步骤。例如可以通过检测源自于标记物质的信号来检测第二核酸分子与链霉亲和素之间的结合。信号的检测例如可以根据标记物质的类型来适当地决定。检测的实例包括检测电信号的电化学检测和检测光信号的光学检测。光信号可以是例如标记物质本身的信号或由标记物质在底物存在下引起的酶反应所产生的信号。对底物没有特别限制，其优选为通过酶反应显出颜色或发光的底物。电化学检测可以是例如电化学信号的检测，并且可以通过测量信号强度例如电流来执行。例如，通过在底物存在下执行酶反应，电化学信号作为电子传递而产生。例如，可以通过向电极施加电压，使电子传递作为电流而被测量到。
例如，本发明的分析方法还可以包括通过在添加样品和链霉亲和素后进行洗涤来去除未结合于第二核酸分子的链霉亲和素的去除步骤。
本发明的分析方法还可以包括添加底物的添加步骤。对添加底物的顺序没有特别限制，例如，可以在添加样品和标记的链霉亲和素的同时或之后添加底物，或者可以在添加样品后添加标记的链霉亲和素之前或之后添加底物。例如，在分析装置包括试剂部的情况下，优选在添加样品后添加标记的链霉亲和素。
尽管已参考示例性实施方式具体示出和描述了本发明，但本发明不限于这些实施方式。本领域普通技术人员应该理解，可以在其中做出各种形式和细节上的改变，而不背离由权利要求书所限定的本发明的精神和范围。
本申请基于2010年12月24日提交的日本专利申请号2010-287590并要求其优先权权益，所述专利申请的公开内容在此以其全文引为参考。
工业实用性
根据本发明，可以简单地分析待分析目标。例如，可以将适体技术应用于本发明。例如，适体在试管中获得。因此，可以获得能够与高毒性化合物结合的适体和能够与低分子化合物结合的适体。因此，根据本发明，例如，可以解决使用抗原-抗体反应等的方法所伴有的问题，并且可以通过信号检测例如电化学检测等来执行简单分析。
参考数字的解释
1 分析装置
10 基板
20 电极
40 核酸元件
41 第一核酸分子
42 第二核酸分子
43 间插连接物
44 第一附加连接物
45 第二附加连接物
50 靶
Figure IDA00003396687100011
Figure IDA00003396687100041

Claims (22)

1.分析装置，其包含：
基板；
核酸元件；和
检测信号的检测部，其中
所述核酸元件和所述检测部被布置在所述基板上，
所述核酸元件包含第一核酸分子和第二核酸分子，
所述第一核酸分子是能够与靶结合的核酸分子，
所述第二核酸分子是能够与链霉亲和素结合的核酸分子，
当所述靶未结合于所述第一核酸分子时，所述第二核酸分子与所述链霉亲和素的结合能力被失活，
当所述靶结合于所述第一核酸分子时，所述第二核酸分子与所述链霉亲和素的结合能力被激活，并且
所述检测部检测所述第二核酸分子与所述链霉亲和素之间的结合。
2.权利要求1的分析装置，其中
所述第一核酸分子是其结构通过所述靶与所述第一核酸分子的结合而改变的核酸分子，并且
所述第二核酸分子是其结构通过所述第一核酸分子的结构变化而改变的核酸分子。
3.权利要求1或2的分析装置，其中
所述第一核酸分子和所述第二核酸分子是适体。
4.权利要求1至3任一项的分析装置，其中
所述第二核酸分子包含下列多核苷酸（a）至（c）中的任一种：
（a）由SEQ ID NO：1至10任一项所表示的碱基序列构成的多核苷酸；
（b）由通过在碱基序列（a）中置换、缺失、添加和/或插入一个或多个碱基而获得的碱基序列构成并且能够与链霉亲和素结合的多核苷酸；以及
（c）由与碱基序列（a）具有50%以上同一性的碱基序列构成并且能够与链霉亲和素结合的多核苷酸。
5.权利要求1至4任一项的分析装置，其中
所述核酸元件是通过将所述第一核酸分子与所述第二核酸分子彼此连接而获得的单链核酸分子。
6.权利要求1至5任一项的分析装置，其中
所述核酸元件还包含连接物。
7.权利要求1至6任一项的分析装置，其中
链霉亲和素是通过将标记物质与链霉亲和素结合而获得的标记的链霉亲和素，并且
所述信号源自于所述标记物质。
8.权利要求7的分析装置，其中
所述标记物质发出信号。
9.权利要求7的分析装置，其中
所述标记物质是催化氧化还原反应的酶。
10.权利要求9的分析装置，其中
所述标记物质是催化氧化还原反应的酶，并且
所述信号通过氧化还原反应从底物发出。
11.权利要求10的分析装置，其还包含试剂部，其中
所述试剂部含有用于氧化还原反应的底物。
12.权利要求7至11任一项的分析装置，其中
所述信号是电化学信号。
13.权利要求1至12任一项的分析装置，其中
所述检测部含有电极。
14.权利要求1至13任一项的分析装置，其中
所述核酸元件被布置在所述检测部上。
15.权利要求1至14任一项的分析装置，其包含：两种以上核酸元件，其中
所述两种以上核酸元件各自具有能够与不同靶结合的第一核酸分子。
16.使用权利要求1至15任一项的分析装置来分析靶的分析方法，所述分析方法包括：
向所述分析装置添加样品和链霉亲和素的添加步骤；以及
在所述检测部中检测所述第二核酸分子与所述链霉亲和素之间的结合从而检测靶的检测步骤。
17.权利要求16的分析方法，其中
所述链霉亲和素是通过将标记物质与链霉亲和素结合而获得的标记的链霉亲和素。
18.权利要求17的分析方法，其中
所述标记物质发出信号。
19.权利要求18的分析方法，其中
所述标记物质通过氧化还原反应发出信号。
20.权利要求19的分析方法，其中
所述标记物质是催化氧化还原反应的酶。
21.权利要求20的分析方法，其中
在用于所述氧化还原反应的底物存在下执行所述检测步骤。
22.权利要求18至21任一项的分析方法，其中
所述检测步骤中的检测是电信号的检测。
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