CN106932591A - 一种基于适配体检测细胞因子的非标记电化学生物传感器及细胞因子实时检测方法 - Google Patents

一种基于适配体检测细胞因子的非标记电化学生物传感器及细胞因子实时检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种基于适配体检测细胞因子的非标记电化学生物传感器及细胞因子实时检测方法。基于适配体检测细胞因子的非标记电化学生物传感器，其特征在于：其为Ru‑适配体‑NH‑CO‑Ph/GC，其包括通过CO‑NH结合在4‑羧基苯重氮盐修饰的功能化电极表面上的Ru‑适配体；所述的适配体(aptamer)5′端接枝NH2，能特异性识别待检测细胞因子，所述的Ru‑适配体为嵌有Ru(NH3)6 3+的Ru‑适配体复合物。本发明设计的这种电化学生物传感器方法简单，快速，并且能够实时快速，稳定，灵敏的实时检测细胞因子的方法。

Description

一种基于适配体检测细胞因子的非标记电化学生物传感器及 细胞因子实时检测方法
技术领域
本发明属生物化学领域，具体涉及一种基于适配体检测细胞因子的非标记电化学生物传感器及细胞因子实时检测方法。
背景技术
细胞因子是免疫原、丝裂原或其他刺激剂诱导多种细胞产生的低分子量(大约在6-70KDa)的可溶性蛋白质，是人体免疫系统功能状态的指标。它们在调节细胞信号传导，细胞分化，以及在免疫系统炎症反应中发挥关键作用。然而，与这些免疫反应相关的细胞因子的产生往往是动态的并且产生的速度非常快，而且在人体的浓度很低(pM)。因此，开发和研究能灵敏快速地实时动态检测活细胞分泌的细胞因子的分析方法对研究细胞免疫功能的微妙变化和动态特性至关重要。
目前，研究学者发展了许多研究细胞因子的方法，其中最典型的两种方法分别是酶联免疫吸附法(ELISA)[1]和基于磁珠的免疫检测方法[2]。但是这两种检测方法需要耗费很长的培养时间以及需要做大量的工作，不能提供实时检测，因此寻求简便、快捷、可靠的实时细胞因子检测方法迫在眉睫。
适配体是由组合文库中筛选出的单链DNA或RNA寡核酸序列[3]。在实际应用中可以替代抗体作为识别探针检测分析物，并它有着抗体无法比拟的优点，在一些苛刻的条件下，适配体比抗体稳定，并且价格比抗体便宜。由于适配体对目标分析物具有很高的特异性和亲和力。
发明内容
本发明所要解决的技术问题就是提供一种基于适配体检测细胞因子的非标记电化学生物传感器及细胞因子实时检测方法。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
一种基于适配体检测细胞因子的非标记电化学生物传感器，其为Ru-适配体-NH-CO-Ph/GC，其包括通过CO-NH结合在4-羧基苯重氮盐修饰的功能化电极表面上的Ru-适配体；所述的适配体(aptamer)5′端接枝NH2，能特异性识别待检测细胞因子，所述的Ru-适配体为嵌有Ru(NH3)6 3+的Ru-适配体复合物。
按上述方案，所述的细胞因子为细胞因子IFN-γ，与其对应的适配体为5′-NH2-TAATTCCCAATCCATGTGTTGTGGGTTGTGTTGGTTGGGGCATATTCACATGGATTGGGTTGGGCGGGATGGG-3′，具有发夹型结构；
所述的细胞因子为TNF-α，与其对应的适配体为5’-GCG GCC GAT AAG GTC TTTCCA AGC GAA CGA AAA-3’；
或为PDGF,与其对应的适配体为5’-CAG GCT ACG GCA CGT AGA CAT CAC CAT GATCCT G-3’；
或为IgG,与其对应的适配体为5’-TAATACGACTCACTATAGCAATGGTACGGTACTTCCCCACTCACCGGGTACCTGCCGCTCCCAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA-3’。
上述非标记电化学生物传感器的制备方法，步骤如下：
(1)配置嵌有Ru(NH3)6 3+的Ru-适配体复合物；
(2)将嵌Ru(NH3)6 3+的Ru-适配体复合物通过酰胺反应修饰到4-羧基苯重氮盐修饰的功能化电极表面，得到基于适配体检测细胞因子的非标记电化学生物传感器。
按上述方案，步骤(1)为：取一定量的适配体溶液和过量Ru(NH3)6Cl3溶液在室温下混合培养4～8h，得到Ru-适配体复合物。
按上述方案，所述适配体和Ru(NH3)6Cl3的摩尔量比为1:2000。
按上述方案，配置适配体溶液的溶剂为pH＝7.4的Tris-HCl缓冲溶液，所述适配体溶液的浓度为5μM，所述Ru(NH3)6Cl3溶液的浓度为10mM，Ru(NH3)6Cl3和适配体的体积比为1:1。
按上述方案，所述的Ru-适配体复合物通过酰胺反应修饰到4-羧基苯重氮盐修饰的功能化电极表面，具体为：把4-羧基苯胺在NaNO2/HCl下重氮化后，利用电化学还原法，把4-羧基苯胺修饰到电极表面上，制备HOOC-Ph/GC功能化表面，接着把修饰好的电极放到EDC/NHS中活化电极表面的羧基，然后将活化好的电极清洗干净,再把Ru-适配体复合物滴加到电极表面进行酰胺反应，使其通过-CO-NH-键把Ru-适配体复合物稳定地修饰到电极表面。
按上述方案，所述电化学还原的电位区间：0.6～-1.0V；所述清洗电极用溶剂为去离子水和pH＝7.4Tris-HCl缓冲溶液。
一种基于适配体对细胞因子进行实时检测的方法，步骤如下：
取待检测溶液，使用基于适配体检测细胞因子的非标记电化学生物传感器，利用计时电流法，记录电流随时间的变化,然后基于电流值和待检测细胞因子浓度的线性关系标准曲线，进行细胞因子的实时定量检测。
按上述方案，计时电流法实验条件：固定电位：-0.17～-0.2V。扫描时间根据检测过程中电流值随时间变化的稳定情况而确定。
按上述方案，所述的标准曲线的获得方法：利用计时电流法，在检测过程中逐渐增加体系中的细胞因子浓度，获得电流随时间变化的I-t曲线，取不同浓度的细胞因子时对应的电流值，基于电流值和待检测细胞因子浓度的线性关系，得到电流值和待检测细胞因子浓度的线性关系标准曲线c(x，y)—x为待检测细胞因子浓度，y为电流值。
按上述方案，标准曲线获得过程中细胞因子溶液的浓度范围为10-100pg mL-1。
本发明提供的基于适配体检测细胞因子的非标记电化学生物传感器的检测原理：利用Ru(NH3)6 3+及其衍生物与碱基对A、T所具有的一定的亲和力[5]，在室温下将Ru(NH3)6 3+与适配体温育一定时间，使氧化还原性探针Ru(NH3)6 3+嵌进发夹型适配体中，形成Ru-aptamer复合物。同时利用重氮盐原理，把4-羧基苯胺在NaNO2/HCl下重氮化后，利用电化学还原法，把4-羧基苯胺修饰到电极表面上，制备HOOC-Ph/GC功能化表面，接着把修饰好的电极经EDC/NHS中活化电极表面的羧基，然后通过-CO-NH-键把Ru-aptamer复合物稳定地修饰到电极表面，在没有细胞因子存在的条件下，氧化还原性探针嵌入在适配体中，没有电化学信号，当加入细胞因子后，由于细胞因子与适配体的亲和力比Ru(NH3)6 3+结合适配体的亲和力大，当细胞因子与适配体根据碱基互补配对形成DNA双螺旋结构的过程中，适配体的发夹型结构打开，与细胞因子结合，从而使Ru(NH3)6 3+释放出来。经SWV法检测，有一个明显的SWV电流峰，且随着检测物浓度的增加SWV峰电流增加，由此本发明可通过计时电流法对细胞因子含量进行实时检测。
本发明的有益效果：
本发明设计的这种电化学生物传感器方法简单，快速，并且能够实时快速，稳定，灵敏的实时检测细胞因子的方法。本发明在临床应用和疾病诊断中具有很大的应用价值，应用于多种生物医学研究，比如，可以应用于免疫学研究身体的免疫系统；应用于脑神经科学研究脑袋的活动；应用于肿瘤学研究癌症的病变及治疗；也可以应用于表观遗传学研究胚胎的发展。
附图说明
图1为本发明提供的一种实时监测细胞因子的方法的示意图，图1a为检测细胞因子的原理图，图1b为利用此检测体系采用SWV法对加入细胞因子前后的SWV曲线。
图2为Ru(NH3)6Cl3与aptamer反应前后在pH＝7.4Tris-HCl缓冲溶液中的循环伏安图。a表示的是10μL10mM Ru(NH3)6Cl3溶液滴加到电极表面晾干后，在pH＝7.4Tris-HCl缓冲溶液中的循环伏安曲线，曲线b表示的是10μL5μM aptamer溶液+10μL10mM Ru(NH3)6Cl3溶液在室温下混合培养4h后，在pH＝7.4Tris-HCl缓冲溶液中的循环伏安曲线。
图3. 4-羧基苯重氮盐电化学修饰到电极表面的原理图。
图4.玻碳电极在1mM 4-氨基苯胺和亚硝酸钠的0.5M盐酸溶液中的循环伏安图。
图5.干净的玻碳电极在修饰4-羧基苯胺前后在1mM铁氰化钾溶液中的循环伏安图.
图6.采用SWV法对IFN-γ与aptamer反应后，对Ru(NH3)6 3+释放路径的探讨的SWV曲线.
图7.Ru-aptamer-NH-CO-Ph/GC界面实时检测细胞因子IFN-γ的I-t曲线及线性范围。
a图为Ru-aptamer-NH-CO-Ph/GC界面实时检测细胞因子IFN-γ曲线；b图为根据电流增加曲线取每个浓度下的相对电流值做出的标准曲线图。
具体实施方式
实验药品与仪器设备：Hexaammineruthenium(Ⅲ)-Ru(NH3)6Cl3(Sigma-aldrich)、4-羧基苯胺(国药集团试剂有限公司)、亚硝酸钠(国药集团试剂有限公司)、浓盐酸(国药集团试剂有限公司)、玻碳电极(Gaoss Union)、CHI660E电化学工作站(上海辰华仪器有限公司)、N-羟基琥珀酰亚胺(武汉三益有限公司)、EDC.HCl(Shanghai Medpep CO.Ltd)、细胞因子(Signalway Antibody)、发夹型适配体、pH＝7.4PBS缓冲溶液、pH＝7.4Tris-HCl缓冲溶液
实验部分
Ru-aptamer复合物的制备
取适配体，序列：
5’TAATTCCCAATCCATGTGTTGTGGGTTGTGTTGGTTGGGGCATATTCACATGGATTGGGTTGGGCGGGATGGG-3′，5’端接枝氨基，获得细胞因子IFN-γ适配体5′-NH2-TAATTCCCAATCCATGTGTTGTGGGTTGTGTTGGTTGGGGCATATTCACATGGATTGGGTTGGGCGGGATGGG-3′，具有发夹型结构；
取10μL 5μM aptamer溶液(上述适配体溶解在pH＝7.4Tris-HCl缓冲溶液)和10μL10mM Ru(NH3)6Cl3溶液在室温下混合培养4h，得到Ru-aptamer复合物。
生物传感器的制备
首先把玻碳电极放在有1.0,0.3,0.05μm的氧化铝抛光布上，用手打磨玻碳电极，然后用去离子水清洗干净，氮气吹干。然后把1mM HOOC-Ph-NH2溶解在0.5M HCl溶液中，加入1mMNaNO2在冰浴下去氧10min，使HOOC-Ph-NH2重氮化得到HOOC-Ph-N2 +Cl-，然后通过电化学还原使HOOC-Ph-N2 +Cl-通过C-C键修饰到玻碳电极表面，电位区间：0.6～-1.0V，扫描速率为100mV/s,扫描2圈。接着用去离子水冲洗除去未被修饰的HOOC-Ph-N2 +Cl-，氮气吹干后，放到含有活化剂20mM EDC、40mM NHS的100mM MES(pH＝6.0)溶液中反应1h，使-COOH活化。活化后用去离子水和pH＝7.4Tris-HCl缓冲溶液冲洗电极，然后将修饰的电极表面浸泡于上述制备好的Ru-aptamer复合物中，室温下反应，通过-CO-NH-键把Ru-aptamer复合物修饰到电极表面形成传感器界面。
结果与讨论
Ru-aptamer复合物的表征
图2表示的是Ru(NH3)6Cl3与aptamer反应前后在pH＝7.4的Tris-HCl缓冲溶液中的循环伏安曲线，曲线a表示的是10μL10mMRu(NH3)6Cl3溶液滴加到电极表面晾干后，在pH＝7.4Tris-HCl缓冲溶液中的循环伏安曲线，曲线b表示的是10μL5μMaptamer溶液+10μL10mMRu(NH3)6Cl3溶液在室温下混合培养4h后，在pH＝7.4Tis-HCl缓冲溶液中的循环伏安曲线，从图可知，当Ru(NH3)6Cl3没有和aptamer反应时，有一对明显的氧化还原峰，当加入aptamer后，氧化还原峰消失，说明Ru(NH3)6Cl3已经嵌入到aptamer序列中，通过图2计算得到DNA序列对Ru(NH3)6Cl3的装载量
传感器界面的表征
图3所示的是4-羧基苯重氮盐电化学修饰到电极表面的原理图，首先我们先把4-羧基苯胺溶解到酸性溶液中，在NaNO2的作用下还原成重氮盐单分子，由于重氮盐在室温下不稳定，因此放到冰浴中还原，然后施加一定的电压，使其发生还原反应，生成4-羧基苯自由基，并伴随N2的产生，4-羧基苯自由基与GC电极形成C-C共价键吸附到电极表面，在电极表面形成稳定的芳基重氮盐分子层。
图4表示的是使用电化学还原法修饰1mM 4-羧基苯重氮盐的循环伏安曲线，由图中可知，第一圈循环伏安曲线在-0.4v左右有一个还原峰但是在第二圈的循环伏安曲线中还原峰消失，是因为电极表面修饰满了4-羧基苯分子，阻碍了溶液中的其他分子接近电极表面。
图5表示的是1mM 4-羧基苯重氮盐在HCl溶液中电化学还原修饰到GC上后，放到铁氰化钾溶液中的循环伏安曲线，由图可知，氧化还原峰消失。主要是因为电极表面修饰有4-羧基苯分子，而-COOH在酸性条件下为亲水基团，随着溶液pH的增大，电极表面的-COOH去质子化，离解为COO-，而Fe(CN)6 3-带负电，由于同号电荷相互排斥，所以使Fe(CN)6 3-/4-很难达到电极表面发生氧化还原反应，从而也说明4-羧基苯分子成功的修饰到了GC电极表面。
Ru释放路径的研究
图6表示的是IFN-γ与aptamer反应后，对Ru(NH3)6 3+释放路径的探讨，曲线a表示的是加入IFN-γ后不清洗直接放到1ml pH＝7.4Tris-HCl缓冲溶液中的SWV曲线，曲线b表示的是加入IFN-γ后清洗液的SWV曲线，曲线c表示的是清洗后的电极超声后放到1ml pH＝7.4Tris-HCl缓冲溶液中的SWV曲线，曲线d表示的是干净的空白电极在1ml pH＝7.4Tris-HCl缓冲溶液中的SWV曲线，从图中可知，氧化峰电流大小a>b>c，因此IFN-γ与aptamer反应后，Ru(NH3)6 3+从aptamer释放出来。
计时电流法实时检测细胞因子
将上述制备好的Ru-aptamer-NH-CO-Ph修饰的玻碳电极(Ru-aptamer-NH-CO-Ph/GC)放入到1ml pH＝7.4Tris-HCl缓冲溶液中先扫描，然后加入不同浓度的IFN-γ接着扫描记录电流随时间变化的曲线，见图7a。实验条件：固定电位：-0.2V，扫描时间：3600s。
图7a表示的是Ru-aptamer-NH-CO-Ph/GC放入到1ml pH＝7.4Tris-HCl缓冲溶液中的I-t曲线，从图中可知，在没有检测物IFN-γ的情况下，电流随时间的增加没有变化。当加入检测物IFN-γ的溶液时，电流随时间和IFN-γ浓度的增加而增加。图7b表示的是根据电流增加曲线取每个浓度下的相对电流值做出的标准曲线图。由标准曲线得知IFN-γ的最低可检测到的浓度是1pg mL-1，线性范围1-100pg mL-1。
基于上述待检细胞因子浓度和电流的线性关系即可进行细胞因子的实时在线检测。
参考文献
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<130> 2017100313669
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
taattcccaa tccatgtgtt gtgggttgtg ttggttgggg catattcaca tggattgggt 60
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<212> DNA
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<212> DNA
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taatacgact cactatagca atggtacggt acttccccac tcaccgggta cctgccgctc 60
ccaaaagtgc acgctacttt gctaa 85

Claims (10)

1.一种基于适配体检测细胞因子的非标记电化学生物传感器，其特征在于：其为Ru-适配体-NH-CO-Ph/GC，其包括通过CO-NH结合在4-羧基苯重氮盐修饰的功能化电极表面上的Ru-适配体；所述的适配体5′端接枝NH2，能特异性识别待检测细胞因子，所述的Ru-适配体为嵌有Ru(NH3)6 3+的Ru-适配体复合物。
2.根据权利要求1所述的基于适配体检测细胞因子的非标记电化学生物传感器，其特征在于：所述的细胞因子为细胞因子IFN-γ，与其对应的适配体为5′-NH2-TAATTCCCAATCCATGTGTTGTGGGTTGTGTTGGTTGGGGCATATTCACATGGATTGGGTTGGGCGGGATGGG-3′，具有发夹型结构；
所述的细胞因子为TNF-α，与其对应的适配体为5’-GCG GCC GAT AAG GTC TTT CCAAGC GAA CGA AAA-3’；
或为PDGF,与其对应的适配体为5’-CAG GCT ACG GCA CGT AGA CAT CAC CAT GAT CCTG-3’；
或为IgG,与其对应的适配体为5’-TAATACGACTCACTATAGCAATGGTACGGTACTTCCCCACTCACCGGGTACCTGCCGCTCCCAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA-3’。
3.权利要求1所述的非标记电化学生物传感器的制备方法，其特征在于：步骤如下：
(1)配置嵌有Ru(NH3)6 3+的Ru-适配体复合物；
(2)将嵌Ru(NH3)6 3+的Ru-适配体复合物通过酰胺反应修饰到4-羧基苯重氮盐修饰的功能化电极表面，得到基于适配体检测细胞因子的非标记电化学生物传感器。
4.根据权利要求3所述的非标记电化学生物传感器的制备方法，其特征在于：步骤(1)为：取一定量的适配体溶液和过量Ru(NH3)6Cl3溶液在室温下混合培养4～8h，得到Ru-适配体复合物。
5.根据权利要求3所述的非标记电化学生物传感器的制备方法，其特征在于：所述适配体和Ru(NH3)6Cl3的摩尔量比为1:2000；配置适配体溶液的溶剂为pH＝7.4的Tris-HCl缓冲溶液，所述适配体溶液的浓度为5μM，所述Ru(NH3)6Cl3溶液的浓度为10mM，Ru(NH3)6Cl3和适配体的体积比为1:1。
6.根据权利要求3所述的非标记电化学生物传感器的制备方法，其特征在于：所述的Ru-适配体复合物通过酰胺反应修饰到4-羧基苯重氮盐修饰的功能化电极表面，具体为：把4-羧基苯胺在NaNO2/HCl下重氮化后，利用电化学还原法，把4-羧基苯胺修饰到电极表面上，制备HOOC-Ph/GC功能化表面，接着把修饰好的电极放到EDC/NHS中活化电极表面的羧基，然后将活化好的电极清洗干净，再把Ru-适配体复合物滴加到电极表面进行酰胺反应，使其通过-CO-NH-键把Ru-适配体复合物稳定地修饰到电极表面。
7.根据权利要求6所述的非标记电化学生物传感器的制备方法，其特征在于：所述电化学还原的电位区间：0.6～-1.0V；所述清洗电极用溶剂为去离子水和pH＝7.4Tris-HCl缓冲溶液。
8.利用权利要求1所述的非标记电化学生物传感器对细胞因子进行实时检测的方法，其特征在于：取待检测溶液，使用基于适配体检测细胞因子的非标记电化学生物传感器，利用计时电流法，记录电流随时间的变化，然后基于电流值和待检测细胞因子浓度的线性关系标准曲线，进行细胞因子的实时定量检测。
9.利用权利要求8所述的对细胞因子进行实时检测的方法，其特征在于：计时电流法实验条件：固定电位：-0.17～-0.2V。
10.利用权利要求8所述的对细胞因子进行实时检测的方法，其特征在于：所述的标准曲线的获得方法：利用计时电流法，在检测过程中逐渐增加体系中的细胞因子浓度，获得电流随时间变化的I-t曲线，取不同浓度的细胞因子时对应的电流值，基于电流值和待检测细胞因子浓度的线性关系，得到电流值和待检测细胞因子浓度的线性关系标准曲线c(x，y)—x为待检测细胞因子浓度，y为电流值。
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