CN109580745B - 一种基于适配体的非标记电化学生物传感器及检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种基于适配体的非标记电化学生物传感器及同时检测多种细胞因子的实时检测方法。基于适配体的非标记电化学生物传感器，其特征在于：其包括通过CO‑NH结合在氧化石墨烯（GO）修饰的功能化电极表面上的一个或多个氧化还原探针小分子‑适配体复合物，每个氧化还原探针小分子‑适配体复合物中的氧化还原探针小分子不同；所述的适配体5′端接有NH2，能特异性识别待检测细胞因子。本发明设计的这种电化学生物传感器简单，快速，稳定，并且能够实时，灵敏地同时检测多种细胞因子。

Description

一种基于适配体的非标记电化学生物传感器及检测方法
技术领域
本发明属生物化学领域，具体涉及一种基于适配体检测细胞因子的非标记电化学生物传感器及同时检测多种细胞因子的实时检测方法。
背景技术
细胞因子是免疫原、丝裂原或其他刺激剂诱导多种细胞产生的低分子量(大约在6-70KDa)的可溶性蛋白质，是人体免疫系统功能状态的指标。它们在调节细胞信号传导，细胞分化，以及在免疫系统炎症反应中发挥关键作用。然而，与这些免疫反应相关的细胞因子的产生往往是动态的并且产生的速度非常快，而且在人体的浓度很低(pM)。因此，开发和研究能灵敏快速地实时动态检测活细胞分泌的细胞因子的分析方法对研究细胞免疫功能的微妙变化和动态特性至关重要。
目前，研究学者发展了许多研究细胞因子的方法，其中最典型的两种方法分别是酶联免疫吸附法(ELISA)[1]和基于磁珠的免疫检测方法[2]。但是这两种检测方法需要耗费很长的培养时间以及需要做大量的工作，不能提供实时检测，因此寻求简便、快捷、可靠的实时细胞因子检测方法迫在眉睫。
适配体是由组合文库中筛选出的单链DNA或RNA寡核酸序列[3]。在实际应用中可以替代抗体作为识别探针检测分析物，并它有着抗体无法比拟的优点，在一些苛刻的条件下，适配体比抗体稳定，并且价格比抗体便宜。而且适配体对目标分析物具有很高的特异性和亲和力。
发明内容
本发明所要解决的技术问题就是提供一种基于适配体的非标记电化学生物传感器及同时检测多种细胞因子的实时检测方法。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
一种基于适配体的非标记电化学生物传感器，其包括通过CO-NH结合在氧化石墨烯(GO)修饰的功能化电极表面上的一个或多个氧化还原探针小分子-适配体复合物，每个氧化还原探针小分子-适配体复合物中的氧化还原探针小分子不同；所述的适配体5′端接有NH2，能特异性识别待检测细胞因子。
按上述方案，所述的适配体为可识别细胞因子IFN-γ，VEGF，TNF-a的适配体，具有发夹型结构，氧化还原小分子嵌入在适配体中。
按上述方案，所述的氧化还原小分子有3个，分别选自MB或其衍生物，NB或其衍生物和Fc或其衍生物，所述的电极为玻碳电极，所述的氧化还原探针小分子-适配体复合物为嵌有MB或其衍生物，NB或其衍生物和Fc或其衍生物的MB-适配体1复合物，NB-适配体2复合物和Fc--适配体3复合物；所述的非标记电化学生物传感器为NB/MB/Fc-适配体-NH-GO-Ph/GC。
按上述方案，所述特异性识别细胞因子IFN-γ的适配体为5’-NH2-TTTTTTTTTT-GGGGTTGGTTGTGTTGGGTGTTGTGTCCAACCCC-3’，具有发夹型结构；
所述特异性识别细胞因子VEGF的适配体为5’-NH2-AAAAAAAAAA-CCGTCTTCCAGACAAGAGTGCAGGGAATCTGGAAGAC-3’，具有发夹型结构；
所述特异性识别细胞因子TNF-a的适配体为5′-NH2-TGA GGG TTG TCG CCT GGT GGA TGG CGC AGT CGG CGA CAA-3′，具有发夹型结构。
上述非标记电化学生物传感器的制备方法，步骤如下：
(1)配置嵌有氧化还原探针小分子的氧化还原探针小分子-适配体复合物；
(2)将嵌有氧化还原探针小分子的氧化还原探针小分子-适配体复合物通过酰胺反应修饰到氧化石墨烯修饰的功能化电极表面，得到基于适配体的非标记电化学生物传感器。
按上述方案，步骤(1)为：取适配体溶液和过量氧化还原探针小分子溶液在室温下混合培养4～8h，得到氧化还原探针小分子-适配体复合物，每个氧化还原探针小分子-适配体中的氧化还原小分子不同。
按上述方案，配置适配体溶液的溶剂为pH＝7.4的Tris-HCl缓冲溶液，所述适配体溶液的浓度为5μM，所述氧化还原小分子选自MB，NB和Fc，MB，NB和Fc溶液的浓度分别为10mM，MB，NB和Fc和适配体的体积比分别为1:1。
按上述方案，氧化还原探针小分子-适配体复合物通过酰胺反应修饰到氧化石墨烯修饰的功能化电极表面，具体为：把4-硝基苯胺在NaNO2/HCl下重氮化后，利用电化学还原法，把4-硝基苯胺修饰到电极表面上，制备NO2-Ph/GC功能化表面，接着将硝基还原为氨基，然后在NaNO2/HCl下再次重氮化，最后利用电化学还原法，把GO修饰到电极表面上，接着活化修饰好的电极表面GO上的羧基，然后把氧化还原小分子-适配体复合物滴加到电极表面进行酰胺反应，使其通过-CO-NH-键把氧化还原小分子-适配体复合物稳定地修饰到电极表面。
按上述方案，用EtOH:H2O(1:9)质子溶液将硝基还原为氨基。
按上述方案，所述的羧基活化为把修饰好的电极放到EDC/NHS中活化。羧基活化后对电极进行清洗，清洗电极用溶剂为去离子水和pH＝7.4的Tris-HCl缓冲溶液。
按上述方案，利用电化学还原法把4-硝基苯胺修饰到电极表面上的电位区间为0.6～-0.4V；利用电化学还原法把GO修饰到电极表面上的电位区间为0～-1.1V。
一种基于适配体对细胞因子进行实时检测的方法，步骤如下：取待检测溶液，使用上述基于适配体的非标记电化学生物传感器，根据氧化还原探针小分子，选择合适的电位条件，记录电流值，基于电流值和待检测细胞因子浓度的线性关系标准曲线，进行细胞因子的定量检测。
一种基于适配体对多种细胞因子进行同时实时检测的方法，步骤如下：取待检测溶液，使用基于适配体的非标记电化学生物传感器，利用方波伏安法，电位参数：-0.6～-0.3V，-0.35～-0.1V，-0.1～0.5V，记录每个电流值，然后基于对应的电流值和待检测细胞因子浓度的线性关系标准曲线，进行多细胞因子的定量检测。
按上述方案，所述的标准曲线的获得方法：利用方波伏安法，在检测过程中逐渐增加体系中的细胞因子浓度，获得电流随待检测细胞因子浓度变化的而变化的曲线，基于电流值和待检测细胞因子浓度的线性关系，得到电流值和待检测细胞因子浓度的线性关系标准曲线c(x，y)—x为待检测细胞因子浓度，y为电流值。
按上述方案，标准曲线获得过程中各细胞因子溶液的浓度范围可以为5-200pgmL-1。
本发明提供的基于适配体同时检测多种细胞因子的非标记电化学生物传感器的检测原理：利用NB,MB和Fc及其衍生物与碱基对A、T所具有的一定的亲和力，在室温下将NB,MB和Fc与适配体温育一定时间，使氧化还原性探针NB,MB和Fc嵌进发夹型适配体中，形成NB/MB/Fc-aptamer复合物。同时利用重氮盐原理，把4-硝基苯胺在NaNO2/HCl下重氮化后，利用电化学还原法，把4-硝基苯胺修饰到电极表面上，制备NO2-Ph/GC功能化表面，接着将硝基还原为氨基，然后在NaNO2/HCl下再次重氮化，最后利用电化学还原法，把GO修饰到电极表面上。接着把修饰好的电极放到EDC/NHS中活化电极表面GO上的羧基，再把MB/NB/Fc-适配体复合物滴加到电极表面进行酰胺反应，使其通过-CO-NH-键把氧化还原探针小分子-适配体复合物稳定地修饰到电极表面。在没有细胞因子存在的条件下，氧化还原性探针嵌入在适配体中，没有电化学信号，当加入细胞因子后，由于细胞因子与适配体的亲和力比氧化还原探针小分子结合适配体的亲和力大，当细胞因子与适配体根据碱基互补配对形成DNA双螺旋结构的过程中，适配体的发夹型结构打开，与细胞因子结合，从而使氧化还原探针小分子NB,MB和Fc及其衍生物释放出来。经SWV法检测，有一个明显的SWV电流峰，且随着检测物浓度的增加SWV峰电流增加，由此本发明可通过计时电流法对多种细胞因子含量进行同时实时检测。
本发明的有益效果：
本发明基于适配体的非标记电化学生物传感器中生物传感器界面的GO上有很多的含氧基团包括羧基，将羧基活化之后和适配体上的氨基进行酰胺化可达到负载适配体的目的，并且氧化石墨烯的引入可以增强活性面积，有利于多氧化还原小分子-适配体复合物的稳定负载，由此实现多细胞因子的同时，同时氧化石墨烯的引入可确保适配体在活体分析环境中稳定，免受酶的干扰；
除此，氧化石墨烯上有很多离域大π键，与氧化还原探针小分子如MB,NB,FC这些氧化还原探针小分子有很强的的亲和性，有利于捕获这些氧化还原小分子，实现更加灵敏的检测。根据本发明的记载，本发明用于IFN-γ，VEGF和TNF-a的同时检测，IFN-γ的最低可检测到的浓度是5pg mL-1，线性范围5-200pg mL-1,VEGF的最低可检测到的浓度是5pg mL-1，线性范围5-150pg mL-1，TNF-a的最低可检测到的浓度是5pg mL-1，线性范围5-200pg mL-1。检测灵敏，线性范围更宽。
综上，本发明设计的这种电化学生物传感器简单，快速，稳定，并且能够实时，灵敏地实时检测细胞因子的方法。本发明在临床应用和疾病诊断中具有很大的应用价值，适合于体内活体实时监测，应用于多种生物医学研究。
附图说明
图1为本发明提供的一种同时实时监测多种细胞因子的方法的示意图，图1a为检测细胞因子的原理图，图1b为利用此检测体系采用SWV法对同时加入是三种细胞因子前后的SWV曲线。
图2为NB,MB和Fc与aptamer反应前后在pH＝7.4Tris-HCl缓冲溶液中的循环伏安图。a表示的分别是10μL10mMNB溶液与10μL5μMaptamer溶液+10μL10mMNB溶液在室温下混合培养4h后滴加到电极表面晾干后，在pH＝7.4Tris-HCl缓冲溶液中的循环伏安曲线，曲线b表示的分别10μL10mMMB溶液与10μL5μMaptamer溶液+10μL10mMMB溶液在室温下混合培养4h后滴加到电极表面晾干后，在pH＝7.4Tris-HCl缓冲溶液中的循环伏安曲线。曲线C表示的分别10μL10mMFc溶液与10μL5μMaptamer溶液+10μL10mMMB溶液在室温下混合培养4h后滴加到电极表面晾干后，在pH＝7.4Tris-HCl缓冲溶液中的循环伏安曲线。
图3.GO修饰到电极表面的原理图。
图4.玻碳电极在1mM 4-硝基苯胺和亚硝酸钠的0.5M盐酸溶液中的循环伏安图。
图5.干净的玻碳电极在修饰4-硝基苯胺，GO后在1mM铁氰化钾溶液中的循环伏安图.
图6.NB/MB/Fc-aptamer-NH-GO-Ph/GC界面同时实时检测多种细胞因子IFN-γ，VEGF和TNF-a的标准曲线及线性范围。
图7.用ELISA和测试条两种方法对比检测N2A细胞中的IFN-γ，VEGF和TNF-a
图8.小鼠实验。a表示用ELISA检测假手术组和生理盐水组的小鼠分泌的IFN-γ，VEGF和TNF-a含量。b表示用测试条检测假手术组，LPS刺激组，PD模型组的小鼠分泌的IFN-γ，VEGF和TNF-a含量。c表示用ELISA和测试条两种方法对比检测假手术组，LPS刺激组，PD模型组的小鼠分泌的IFN-γ，VEGF和TNF-a含量。
具体实施方式
实验药品与仪器设备：氧化石墨烯、4-硝基苯胺(国药集团试剂有限公司)、亚硝酸钠(国药集团试剂有限公司)、浓盐酸(国药集团试剂有限公司)、玻碳电极(Gaoss Union)、CHI660E电化学工作站(上海辰华仪器有限公司)、N-羟基琥珀酰亚胺(武汉三益有限公司)、EDC.HCl(Shanghai MedpepCO.Ltd)、亚甲蓝(MB)、二茂铁(Fc)、尼罗蓝(NB)购自Sigma-Aldrich、细胞因子(Signalway Antibody)、发夹型适配体、pH＝7.4PBS缓冲溶液、pH＝7.4Tris-HCl缓冲溶液。
实验部分
NB/MB/Fc-aptamer复合物的制备
取适配体，序列：
5’-T10-GGGGTTGGTTGTGTTGGGTGTTGTGTCCAACCCC-3’，5’端接枝氨基，
获得细胞因子IFN-γ适配体
5’-NH2-T10-GGGGTTGGTTGTGTTGGGTGTTGTGTCCAACCCC-3’，具有发夹型结构；
取10μL 5μM IFN-γ适配体
5’-NH2-T10-GGGGTTGGTTGTGTTGGGTGTTGTGTCCAACCCC-3’溶液(上述适配体溶解在pH＝7.4Tris-HCl缓冲溶液)和10μL 10mM NB溶液在室温下混合培养4h，得到NB-aptamer复合物。MB-aptamer和Fc-aptamer制备方法同上。
生物传感器的制备
首先把玻碳电极放在有1.0,0.3,0.05μm的氧化铝抛光布上，用手打磨玻碳电极，然后用去离子水清洗干净，氮气吹干。然后把1mM NO2-Ph-NH2溶解在0.5M HCl溶液中，加入1mMNaNO2在冰浴下去氧10min，使NO2-Ph-NH2重氮化得到NO2-Ph-N2 +Cl-，然后通过电化学还原使NO2-Ph-N2 +Cl-通过C-C键修饰到玻碳电极表面，电位区间：0.6～-0.4V，扫描速率为100mV/s,扫描2圈。接着用去离子水冲洗除去未被修饰的NO2-Ph-N2 +Cl-，氮气吹干后，接着用EtOH:H2O(1:9)质子溶液将硝基还原为氨基，然后在NaNO2/HCl下再次重氮化，最后利用电化学还原法，电位区间：0～-1.1V，把GO修饰到电极表面上。接着把修饰好的电极放到含有活化剂20mM EDC、40mM NHS的100mM MES(pH＝6.0)溶液中反应1h，使GO上的-COOH活化。然后将活化好的电极用去离子水和pH＝7.4Tris-HCl缓冲溶液清洗干净，浸泡于上述制备好MB/NB/Fc-适配体复合物中，室温下进行酰胺反应，使其通过-CO-NH-键把MB/NB/Fc-适配体复合物稳定地修饰到电极表面形成传感器界面。
结果与讨论
MB/NB/Fc-aptamer复合物的表征
图2表示的是NB,MB和Fc与aptamer反应前后在pH＝7.4的Tris-HCl缓冲溶液中的循环伏安曲线，a表示的分别是10μL10mMNB溶液与10μL5μMaptamer溶液+10μL10mM NB溶液在室温下混合培养4h后滴加到电极表面晾干后，在pH＝7.4Tris-HCl缓冲溶液中的循环伏安曲线，曲线b表示的分别10μL10mMMB溶液与10μL5μMaptamer溶液+10μL10mM MB溶液在室温下混合培养4h后滴加到电极表面晾干后，在pH＝7.4Tris-HCl缓冲溶液中的循环伏安曲线。曲线c表示的分别10μL10mMFc溶液与10μL5μMaptamer溶液+10μL10mM Fc溶液在室温下混合培养4h后滴加到电极表面晾干后，在pH＝7.4Tris-HCl缓冲溶液中的循环伏安曲线。从图可知，当NB,MB和Fc没有和aptamer反应时，有一对明显的氧化还原峰，当加入aptamer后，氧化还原峰消失，说明NB,MB和Fc已经嵌入到aptamer序列中。
传感器界面的表征
图3所示的是GO电化学修饰到电极表面的原理图，首先我们先把4-硝基苯胺溶解到酸性溶液中，在NaNO2的作用下还原成重氮盐单分子，由于重氮盐在室温下不稳定，因此放到冰浴中还原，然后施加一定的电压，使其发生还原反应，生成4-硝基苯自由基，并伴随N2的产生，4-硝基苯自由基与GC电极形成C-C共价键吸附到电极表面，在电极表面形成稳定的芳基重氮盐分子层。接着用EtOH:H2O(1:9)质子溶液将硝基还原为氨基，然后在NaNO2/HCl下再次重氮化，最后利用电化学还原法，把GO修饰到电极表面上。
图4表示的是使用电化学还原法修饰1mM 4-硝基苯重氮盐的循环伏安曲线，由图中可知，第一圈循环伏安曲线在-0.1v左右有一个还原峰但是在第二圈的循环伏安曲线中还原峰消失，是因为电极表面修饰满了4-硝基苯分子，阻碍了溶液中的其他分子接近电极表面。
图5表示的是1mM 4-硝基苯重氮盐在HCl溶液中电化学还原修饰到GC上后，接着用EtOH:H2O(1:9)质子溶液将硝基还原为氨基，然后在NaNO2/HCl下再次重氮化，最后利用电化学还原法，把GO修饰到电极表面上后，放到铁氰化钾溶液中的循环伏安曲线，由图可知，修饰上硝基后，氧化还原峰消失，说明4-硝基苯分子成功的修饰到了GC电极表面；修饰上GO后，氧化还原峰增大，说明GO成功的修饰上了。
方波伏安法同时实时检测细胞因子
将不同浓度的IFN-γ溶液加入到上述制备好的MB/NB/Fc-适配体-NH-GO-Ph修饰的玻碳电极(MB/NB/Fc-适配体-NH-GO-Ph/GC)上反应1h,然后放入到1ml pH＝7.4Tris-HCl缓冲溶液中进行方波伏安法扫描，然后记录电流随细胞因子浓度变化而变化的曲线，见图6。实验条件：电位：-0.6～-0.3V，-0.35～-0.1V，-0.1～0.5V。
图6a，c,e表示的是当加入不同浓度细胞因子(IFN-γ，VEGF和TNF-a混合溶液)的溶液时，电流随浓度的增加而增加。图6b,d,f表示的是根据电流增加曲线取每个浓度下的相对电流值做出的标准曲线图。由标准曲线得知IFN-γ的最低可检测到的浓度是5pg mL-1，线性范围5-200pg mL-1,VEGF的最低可检测到的浓度是5pg mL-1，线性范围5-150pg mL-1，TNF-a的最低可检测到的浓度是5pg mL-1，线性范围5-200pg mL-1。
由此基于上述待检细胞因子浓度和电流的线性关系即可进行多种细胞因子的同时检测。
细胞实验
图7表示的是将N2A细胞分别培养0.2.4.6.8.12.24h后，然后用LPS刺激，接着用ELISA和传感器两种方法对比检测细胞中的IFN-γ，VEGF和TNF-a.方法一：用ELISA试剂盒检测用LPS刺激后的细胞中的IFN-γ，VEGF和TNF-a的含量；方法二：传感器方法，将修饰了MB/NB/Fc-适配体-NH-GO-Ph界面的玻碳电极分别放在用LPS刺激后的细胞中，然后取出，用方波伏安法检测用LPS刺激后的细胞中的IFN-γ，VEGF和TNF-a的含量。两种方法都在8h时三种细胞因子含量分泌最高，整体趋势都是在前8h内急速升高，8h后趋于稳定，有一定下降，说明了两种检测方法的结果相吻合，本发明的方法准确可行。
动物实验
图8.小鼠实验。a表示安全性检测，检验手术本身对小鼠的影响。先取两组老鼠都没有打药，均注射生理盐水，然后一组动手术在小鼠脑部插入饰了MB/NB/Fc-适配体-NH-GO-Ph界面的碳棒；另一组不做手术。然后用ELISA检测假手术组和生理盐水组的小鼠分泌的IFN-γ，VEGF和TNF-a含量。ELISA检测结果表明，将假手术组与生理盐水对比后，三种细胞因子的含量几乎一致，说明手术本身不会激发小鼠产生细胞因子，不会干扰测定结果，且是安全的。b表示用传感器检测假手术组，LPS刺激组(LPS组是腹腔注射2mg/kg的LPS)，PD模型组(腹腔注射MPTP法建立帕金森模型,具体为注射20mg/kg的MPTP 4次，每次间隔两小时))的小鼠分泌的IFN-γ，VEGF和TNF-a含量。结果表明，LPS刺激后三种细胞因子含量极显著增加，符合文献报道，同时PD模型组也显著增加，说明PD发生过程中会伴有细胞因子含量的增加，以及炎症的发生。c表示用ELISA和传感器两种方法对比检测假手术组，LPS刺激组，PD模型组的小鼠分泌的IFN-γ，VEGF和TNF-a含量。结果表明各种细胞因子在每一组的含量均相当，说明电传感检测结果是可靠的，能用于活体体内细胞因子的同时实时定量检测。
参考文献
[1]Thorpe R,Wadhwa M,Bird CR,Mire-Sluis AR.Detection and measurementof cytokines.Blood Reviews 1992；6:133-48.
[2]Carson RT,Vignali DAA.Simultaneous quantitation of 15cytokinesusing a multiplexed flow cytometric assay.Journal of Immunological Methods1999；227:41-52.
[3]Ellington AD,Szostak JW.In vitro selection of RNA molecules thatbind specific ligands.Nature 1990；346:818-22.

Claims (9)

1.一种基于适配体的非标记电化学生物传感器，其特征在于：包括通过CO-NH结合在氧化石墨烯修饰的功能化电极表面上的3个氧化还原探针小分子-适配体复合物，每个氧化还原探针小分子-适配体复合物中的氧化还原探针小分子不同，所述的3个氧化还原探针小分子分别选自MB或其衍生物、NB或其衍生物和Fc或其衍生物，所述的氧化还原探针小分子-适配体复合物为嵌有MB或其衍生物、NB或其衍生物、和Fc或其衍生物的MB-适配体1复合物，NB-适配体2复合物和Fc-适配体3复合物；所述的适配体5′端接有NH2，能特异性识别待检测细胞因子；所述的适配体为可识别细胞因子IFN-γ，VEGF，TNF-a的适配体，具有发夹型结构，氧化还原探针小分子嵌入在适配体中。
2.根据权利要求1所述的基于适配体的非标记电化学生物传感器，其特征在于：所述的电极为玻碳电极，所述基于适配体的非标记电化学生物传感器为NB/MB/Fc-适配体-NH-GO-Ph/GC。
3.根据权利要求1或2所述的基于适配体的非标记电化学生物传感器，其特征在于：所述特异性识别细胞因子IFN-γ的适配体为5’-NH2-TTTTTTTTTT GGG GTT GGT TGT GTT GGGTGT TGT GTC CAA CCCC-3’，具有发夹型结构；
所述特异性识别细胞因子VEGF的适配体为5’-NH2-AAAAAAAAAA CCG TCT TCC AGA CAAGAG TGC AGG GAA TCT GGA AGAC-3’，具有发夹型结构；
所述特异性识别细胞因子TNF-a的适配体为5′-NH2-TGA GGG TTG TCG CCT GGT GGATGG CGC AGT CGG CGA CAA-3′，具有发夹型结构。
4.权利要求1所述的基于适配体的非标记电化学生物传感器的制备方法，其特征在于：步骤如下：
(1)配置嵌有氧化还原探针小分子的氧化还原探针小分子-适配体复合物；
(2)将嵌有氧化还原探针小分子的氧化还原探针小分子-适配体复合物通过酰胺反应修饰到氧化石墨烯修饰的功能化电极表面，得到基于适配体的非标记电化学生物传感器。
5.根据权利要求4所述的基于适配体的非标记电化学生物传感器的制备方法，其特征在于：步骤(1)为：取适配体溶液和过量氧化还原探针小分子溶液在室温下混合培养4～8h，得到氧化还原探针小分子-适配体复合物，每个氧化还原探针小分子-适配体中的氧化还原探针小分子不同；
步骤(2)中氧化还原探针小分子-适配体复合物通过酰胺反应修饰到氧化石墨烯修饰的功能化电极表面，具体为：把4-硝基苯胺在NaNO2/HCl下重氮化后，利用电化学还原法，把4-硝基苯胺修饰到电极表面上，制备NO2-Ph/GC功能化表面，接着将硝基还原为氨基，然后在NaNO2/HCl下再次重氮化，最后利用电化学还原法，把GO修饰到电极表面上，接着活化修饰好的电极表面GO上的羧基，然后把氧化还原探针小分子-适配体复合物滴加到电极表面进行酰胺反应，使其通过-CO-NH-键把氧化还原探针小分子-适配体复合物稳定地修饰到电极表面。
6.根据权利要求5所述的基于适配体的非标记电化学生物传感器的制备方法，其特征在于：利用电化学还原法把4-硝基苯胺修饰到电极表面上的电位区间为0.6～-0.4V；利用电化学还原法把GO修饰到电极表面上的电位区间为0～-1.1V。
7.根据权利要求5所述的基于适配体的非标记电化学生物传感器的制备方法，其特征在于：配置适配体溶液的溶剂为pH＝7.4的Tris-HCl缓冲溶液，所述适配体溶液的浓度为5μM，所述氧化还原探针小分子选自MB，NB和Fc，MB，NB和Fc溶液的浓度分别为10mM，MB，NB和Fc和适配体的体积比分别为1:1；
用体积比为1:9的EtOH:H2O质子溶液将硝基还原为氨基；
所述的羧基活化为把修饰好的电极放到EDC/NHS中活化；羧基活化后对电极进行清洗，清洗电极用溶剂为去离子水和pH＝7.4Tris-HCl缓冲溶液。
8.一种利用权利要求1所述的基于适配体的非标记电化学生物传感器对细胞因子进行实时检测的方法，其特征在于：步骤如下：
取待检测溶液，使用上述基于适配体的非标记电化学生物传感器，根据氧化还原探针小分子，选择合适的电位条件，记录电流值，基于电流值和待检测细胞因子浓度的线性关系标准曲线，进行细胞因子的定量检测。
9.一种利用权利要求8所述的基于适配体的非标记电化学生物传感器对细胞因子进行实时检测的方法，其特征在于：步骤如下：
取待检测溶液，使用基于适配体的非标记电化学生物传感器，利用方波伏安法，电位参数：-0.6～-0.3V，-0.35～-0.1V，-0.1～0.5V，记录每个电流值，然后基于对应的电流值和待检测细胞因子浓度的线性关系标准曲线，进行多细胞因子的定量检测。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103940872A (zh) * 2014-04-30 2014-07-23 青岛大学 同时检测两种急性白血病标志物电化学传感器的制备方法及应用
CN106124581A (zh) * 2016-06-12 2016-11-16 青岛大学 同一体系构建两种比率电化学传感器检测抗肿瘤药物方法
CN106841340A (zh) * 2017-03-14 2017-06-13 浙江省农业科学院 同时检测水胺硫磷和啶虫脒的电化学传感器及其方法体系
CN106932591A (zh) * 2017-01-17 2017-07-07 华中师范大学 一种基于适配体检测细胞因子的非标记电化学生物传感器及细胞因子实时检测方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103940872A (zh) * 2014-04-30 2014-07-23 青岛大学 同时检测两种急性白血病标志物电化学传感器的制备方法及应用
CN106124581A (zh) * 2016-06-12 2016-11-16 青岛大学 同一体系构建两种比率电化学传感器检测抗肿瘤药物方法
CN106932591A (zh) * 2017-01-17 2017-07-07 华中师范大学 一种基于适配体检测细胞因子的非标记电化学生物传感器及细胞因子实时检测方法
CN106841340A (zh) * 2017-03-14 2017-06-13 浙江省农业科学院 同时检测水胺硫磷和啶虫脒的电化学传感器及其方法体系

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Aptamer-Based Electrochemical Biosensor for Interferon Gamma Detection;Ying Liu等;《Analytical Chemistry》;20101001;第82卷(第19期);第8132页MATERIALS AND METHODS与Results and Discussion *
C-C Bonding of Graphene Oxide on 4-Aminophenyl Modified Gold Electrodes towards Simultaneous Detection of Heavy Metal Ions;Yin Zhang等;《ELECTROANALYSIS》;20150531;第27卷(第5期);第2页右栏第一段，第3-8页Experimental与Results and Discussion *

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