CN107132260A - 一种基于纳米材料检测莱克多巴胺的电化学传感器 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于纳米材料检测莱克多巴胺的电化学传感器，本发明利用石墨烯材料容易分散、比表面积大，对电活性物质及生物分子的高负载量，提供更均匀、更大的电活性位点分布等优点，与纳米金粒子的生物相容性好和加速电子传输速率等优点相结合，制备复合纳米材料修饰在玻碳电极表面，有效提高所制备电化学免疫传感器的灵敏度。同时利用壳聚糖实现莱克多巴胺抗体在电极上的有效固定。制备过程中，对免疫反应的条件等参数进行优化，该传感器在0.3‑1.0×10³ng/mL浓度范围检测莱克多巴胺的线性关系良好，可用于实际样品中目标成分莱克多巴胺的检测。

Description

一种基于纳米材料检测莱克多巴胺的电化学传感器

技术领域

本发明涉及农产品安全检测技术领域，特别是一种基于纳米材料检测莱克多巴胺的电化学传感器。

背景技术

我国畜牧、水产业年产值3.9万亿元（2013年），占农业总产值的43%，年产量、产值均居世界第一。畜牧业是我国国民经济支柱产业，是居民优质蛋白来源之一。但是，近年来养殖、加工和流通环节滥用兽药和违禁添加剂案件不断曝光。莱克多巴胺是一种人工合成的克仑巴安β肾上腺受体激动剂，能够显著提高动物胴体的瘦肉率，但在动物组织和多种脏器中残留，严重危害人体健康和生命安全。我国已于2011年将其列为禁用药物。为更好的检测畜禽产品中莱克多巴胺，研究建立快速、简便、高效的莱克多巴胺检测方法可以更好的保障畜禽产品的质量安全。

常用的莱克多巴胺有酶联免疫法、免疫亲和柱层析法、色谱分析法等，上述方法虽准确、灵敏，但样品前处理及测定操作过程繁琐、成本高，且不适宜于现场的快速检查。电化学免疫传感器是将抗原、抗体免疫反应、酶的高效催化反应及电化学方法有机结合而发展起来的一种融合性技术。由于其具有高选择性、高灵敏度等特点，受到越来越多研究者的关注。纳米金材料具有体积小、比表面积大、生物相容性好和加速电子传输速率等特点，不仅能够增大生物分子的固定量，还可以影响修饰电极是的稳定性。石墨烯是一种具有理想的二维平面结构的碳纳米材料，其具有容易分散、比表面积大，对电活性物质及生物分子的高负载量，提供更均匀、更大的电活性位点分布，而且生产成本低，其优越的电子性能和化学性能使其成为制备生物传感器的理想材料。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够克服传统检测技术的不足，具有操作简单、成本低廉、检测灵敏度高等优点的莱克多巴胺生物传感器的制备及应用。

一种基于纳米材料检测莱克多巴胺的电化学传感器，其特征在于，是在玻碳电极表面先后修饰上纳米金粒子和制备的石墨烯-普鲁士蓝-壳聚糖复合物，然后在修饰好的电极上滴加莱克多巴胺抗原，得到检测莱克多巴胺的电化学免疫传感器。

一种基于纳米材料检测莱克多巴胺的电化学传感器，其特征在于，制备方法如下：

步骤1）石墨烯-普鲁士蓝-壳聚糖复合物的制备；

步骤2）玻碳电极的预处理；

步骤3）将纳米金粒子电沉积到玻碳电极上；

步骤4）将步骤1）制备得到的石墨烯-普鲁士蓝-壳聚糖复合物的制备修饰到步骤3）电镀纳米金的玻碳电极上，得到修饰好的玻碳电极；

步骤5）将莱克多巴胺抗原滴加到步骤3）所得的修饰好的玻碳电极上，干燥5小时；得到莱克多巴胺电化学传感器。

作为优选，步骤1）所述石墨烯-普鲁士蓝-壳聚糖复合物是以壳聚糖和普鲁士蓝复合膜作为分散剂，分散石墨烯，得到的分散均匀的悬浊液。

作为优选，步骤2）玻碳电极的预处理：将玻碳电极分别在0.3和0.05µm的Al₂O₃粉悬浮液中分别抛光，在二次蒸馏水和乙醇的混合溶液中超声清洗10min，使其利用循环伏安法测定时Ep1-Ep2£85mV的要求。

作为优选，步骤3）所述纳米金粒子的电沉积，是在1%HAuCl₄溶液中，利用计时电流法，将Au³⁺还原成Au，沉积到电极表面；用二次蒸馏水冲洗10min，除去物理吸附的Au，得到纳米金沉积电极。

作为优选，步骤4）所述在修饰好的电极上滴加将10µL壳聚糖-普鲁士蓝-石墨烯复合物溶液滴加到电极表面，干燥2h；再将10µL 100ng/ml 的莱克多巴胺抗原溶液滴加到修饰好的电极表面，干燥5小时；滴加10µL0.1%的牛血清白蛋白封闭电极表面的非特异性结合位点。得到莱克多巴胺电化学传感器。

作为优选，步骤5）所述莱克多巴胺电化学传感器的两种试验条件莱克多巴胺固定抗原浓度、孵育时间进行了优化：莱克多巴胺的检测在固定抗原浓度为100ng/ml，孵育时间为40 min。

进一步所述，试验条件的优化：设置固定抗原浓度分别为10，20，50，100和1000ng/ml，利用电流响应值来确定最佳的固定抗原浓度，确定100ng/ml为最佳固定抗原浓度；选取10，20，30，40，50min作为孵育时间，利用电流响应值来确定最佳的孵育时间，确定40min为最佳孵育时间；

莱克多巴胺的检测：在最优条件下：固定抗原浓度为100ng/ml，孵育时间40 min，对不同浓度的莱克多巴胺进行电流检测，并分别建立了莱克多巴胺浓度与响应电流之间的线性关系，得不同浓度的莱克多巴胺的对数值与响应电流之间的线性回归方程为y=-0.9972x+36.807，相关系数为0.995。

一种基于纳米材料检测莱克多巴胺的电化学传感器，其特征在于，具体检测步骤如下：

1）猪肉样品的前处理：从当地超市购买猪肉，称取5g样品，置于50ml离心管里，加入15.0ml乙腈，于振荡器上剧烈震荡10min。以4200r/min的转速离心5min，取上清液于另一离心管中，加2.0g氯化钠和10.0ml正己烷，于震荡器上剧烈震荡10min，以4200r/min的转速离心10min，小心吸取中间乙腈层12.0ml于另一离心管中，氮吹至近干、用PBS缓冲液溶解；

2）样品的检测：在最优条件下：固定抗原浓度为100ng/ml，孵育时间40 min，对猪肉样品进行检测；

3）根据建立的相应的线性关系，计算出相应样品的莱克多巴胺残留量。

本发明所述检测步骤用于检测莱克多巴胺；采用本发明制备的基于纳米材料检测莱克多巴胺的传感器具有操作简单、成本低廉、检测灵敏度高等优点且反应时间短，样品和试剂消耗量少，稳定性高，可用于实际样品的现场检测，符合我国莱克多巴胺残留快速检测技术发展和国际化要求。

一种基于纳米材料的莱克多巴胺电化学传感器及其检测方法，属于农产品安全检测技术领域。本发明利用石墨烯材料容易分散、比表面积大，对电活性物质及生物分子的高负载量，提供更均匀、更大的电活性位点分布等优点，与纳米金粒子的生物相容性好和加速电子传输速率等优点相结合，制备复合纳米材料修饰在玻碳电极表面，有效提高所制备电化学免疫传感器的灵敏度。同时利用壳聚糖实现莱克多巴胺抗体在电极上的有效固定。制备过程中，对免疫反应的条件等参数进行优化，选择最佳的检测条件：100ng/ml为固定抗原浓度、选取40min作为莱克多巴胺抗原抗体的孵育时间。制备出的莱克多巴胺免疫传感器，通过计算接触样品前后免疫传感器的阻抗值的变化，获得样品中莱克多巴胺的浓度信息。该传感器在0.3-1.0×10³ng/mL浓度范围检测莱克多巴胺的线性关系良好，可用于实际样品中目标成分莱克多巴胺的检测。

附图说明

图1 为PB-GR的SEM图；

图2为CS-PB-GR的SEM图；

图3 裸电极（a）、纳米金粒子修饰（b）、纳米金粒子/壳聚糖-普鲁士蓝-石墨烯修饰（c）、固定抗原分子/纳米金粒子/壳聚糖-普鲁士蓝-石墨烯修饰电极（d）在50 mV/s的扫描速率下和2.0 mM K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6] (1:1)溶液中的循环伏安表征；

图4 固定抗原浓度对传感器电流响应的影响；

图5 孵化时间对传感器电流相应的影响；

图6 纳米金粒子/壳聚糖-普鲁士蓝-石墨烯传感器对莱克多巴胺标准溶液的电流响应值，莱克多巴胺浓度：0.3 ng/ml；0.9 ng/ml；2.7ng/ml；8.1ng/ml；100ng/ml；1000ng/ml；

图7 电流响应值与莱克多巴胺浓度的对数的线性关系；

图8 纳米金粒子/壳聚糖-普鲁士蓝-石墨烯传感器对实际样品加标回收率的检测。

具体实施方式

下面结合附图1-8对本发明进行具体描述。

一种基于纳米材料检测莱克多巴胺的电化学传感器，其特征在于，制备方法如下：

步骤1）石墨烯-普鲁士蓝-壳聚糖复合物的制备；

步骤2）玻碳电极的预处理；

步骤3）将纳米金粒子电沉积到玻碳电极上；

步骤4）将步骤1）制备得到的石墨烯-普鲁士蓝-壳聚糖复合物的制备修饰到步骤3）电镀纳米金的玻碳电极上，得到修饰好的玻碳电极；

步骤5）将莱克多巴胺抗原滴加到步骤3）所得的修饰好的玻碳电极上，干燥5小时；得到莱克多巴胺电化学传感器。

具体实施过程中，步骤1）所述石墨烯-普鲁士蓝-壳聚糖复合物是以壳聚糖和普鲁士蓝复合膜作为分散剂，分散石墨烯，得到的分散均匀的悬浊液。

具体实施过程中，步骤2）玻碳电极的预处理：将玻碳电极分别在0.3和0.05µm的Al₂O₃粉悬浮液中分别抛光，在二次蒸馏水和乙醇的混合溶液中超声清洗10min，使其利用循环伏安法测定时Ep1-Ep2£85mV的要求。

具体实施过程中，步骤3）所述纳米金粒子的电沉积，是在1%HAuCl₄溶液中，利用计时电流法，将Au³⁺还原成Au，沉积到电极表面；用二次蒸馏水冲洗10min，除去物理吸附的Au，得到纳米金沉积电极。

具体实施过程中，步骤4）所述在修饰好的电极上滴加将10µL壳聚糖-普鲁士蓝-石墨烯复合物溶液滴加到电极表面，干燥2h；再将10µL 100ng/ml 的莱克多巴胺抗原溶液滴加到修饰好的电极表面，干燥5小时；滴加10µL0.1%的牛血清白蛋白封闭电极表面的非特异性结合位点。得到莱克多巴胺电化学传感器。

具体实施过程中，步骤5）所述莱克多巴胺电化学传感器的两种试验条件莱克多巴胺固定抗原浓度、孵育时间进行了优化：莱克多巴胺固定抗原浓度为100ng/ml，孵育时间为40 min。

具体实施过程中，试验条件的优化：设置固定抗原浓度分别为10，20，50，100和1000ng/ml，利用电流响应值来确定最佳的固定抗原浓度，确定100ng/ml为最佳固定抗原浓度；选取10，20，30，40，50min作为孵育时间，利用电流响应值来确定最佳的孵育时间，确定40min为最佳孵育时间；

具体实施过程中莱克多巴胺的检测：在最优条件下：固定抗原浓度为100ng/ml，孵育时间40 min，对不同浓度的莱克多巴胺进行电流检测，并分别建立了莱克多巴胺浓度与响应电流之间的线性关系，得不同浓度的莱克多巴胺的对数值与响应电流之间的线性回归方程为y=-0.9972x+36.807，相关系数为0.995。

实施例1：

一种基于纳米材料检测莱克多巴胺的电化学传感器的制备方法，

1）壳聚糖-普鲁士蓝-石墨烯复合物的制备：2 ml石墨烯分散液在室温搅拌条件下加到5 ml的含6 mg FeCl₃·6H₂O, 8 mg K₃Fe(CN)₆，37 mg KCl的水溶液中，用HCl调节其pH为1.5。磁力搅拌24h。将混合液离心清洗几次后，40℃真空干燥12h。称取复合物10 mg溶于0.5ml的蒸馏水中。称取0.01g壳聚糖，溶于2ml 1%乙酸溶液，得到0.5%的壳聚糖溶液；将0.5wt%壳聚糖与普鲁士蓝-石墨烯复合物按1：2（v/v)比例混合，超声2h。得到壳聚糖-普鲁士蓝-石墨烯复合物溶液；

2）玻碳电极的预处理：将玻碳电极分别在0.3和0.05µm的Al₂O₃粉悬浮液中分别抛光，在二次蒸馏水和乙醇的混合溶液中超声清洗10min。使其利用循环伏安法测定时Ep1-Ep2£85mV的要求；

3）玻碳电极的修饰：采用计时电流法将纳米金粒子电沉积于玻碳电极上，将10µL壳聚糖-普鲁士蓝-石墨烯复合物溶液滴加到电极表面，干燥2h。得到纳米金/壳聚糖-普鲁士蓝-石墨烯电极；

4）莱克多巴胺抗原的固定：在上述的电极上将10µL 100ng/ml 的红霉素抗原大分子溶液滴加到修饰好的电极表面，干燥5小时；滴加10µL0.1%的牛血清白蛋白封闭电极表面的非特异性结合位点。

实施例2：

莱克多巴胺电化学传感器组装过程中的电化学表征

1）运用扫描电子显微镜（SEM）对修饰有普鲁士蓝/石墨烯和壳聚糖/普鲁士蓝/石墨烯的玻碳电极的微观结构图进行表征，如图1和图2所示，可以看到壳聚糖/普鲁士蓝/石墨烯悬浮液成功修饰到电极表面;

2）组装过程中不同电极在50 mV/s的扫描速率下和2.0 mM K₃[Fe(CN)₆]/K4[Fe(CN)₆](1:1)溶液的循环伏安曲线，如图3所示，纳米金和石墨烯、普鲁士蓝和壳聚糖好的导电性，使得壳聚糖-普鲁士蓝-石墨烯-纳米金电极比裸金电极的电流响应要好。当莱克多巴胺抗原固定到电极表面之后，由于抗原的绝缘性，阻碍氧化还原探针到电极表面的扩散，因次，峰电流均呈下降趋势。上述结果进一步说明莱克多巴胺抗原已经成功的固定到了电极表面。

实施例3：

试验条件的优化

1）固定抗原浓度的优化

固定抗原浓度是电化学传感器建立过程中比较重要的因素之一，为加大电化学传感器检测的精确度，利用电流响应值来确定最佳的固定抗原浓度。如图4所示，固定抗原浓度分别为10，20，50，100和1000ng/ml。电流随着固定抗原浓度的增加而减少，直到100ng/ml时电流趋于稳定，此时结合位点上的抗原浓度已经饱和，更进一步的浓度增加不会增加电流信号的变化。因此，选择100ng/ml为最佳固定抗原浓度。

2）孵化时间的优化

农抗体培养时间不够可能会导致免疫反应的不充足，而过长的培养时间可能会导致抗原或抗体的分离，因此，合适的反应时间是保证测定结果准确的必要条件。如图5所示，选取10，20，30，40，50min作为培养时间，电流响应值随着培养时间的增加而降低，这是由于抗体抗原反应形成的免疫复合物阻碍了氧化还原探针到电极表面的扩散。而当培养时间大于40min时，电流不再减小，这说明抗体抗原反应已经彻底完成，没有新的免疫复合物形成。因此，选择40min作为最佳培养时间。

实施例4：

利用所制备的电流型莱克多巴胺传感器的应用

1）传感器稳定性的检验

利用5只电极，在相同的条件下，研究了免疫传感器的重现性和重复性。在100ng/ml的莱克多巴胺溶液中测定的相对标准偏差范围为3.6%-5.5%。单支电极连续5次在100ng/ml的莱克多巴胺溶液中测定的标准偏差为5.6%.

将壳聚糖-普鲁士蓝-石墨烯-纳米金电极在冰箱（4℃）中储存一周，在同一浓度的红霉素溶液中检测传感电极的稳定性。得到的峰电流值没有显著地变化，得到的相对偏差值为4.5%，这说明壳聚糖-普鲁士蓝-石墨烯-纳米金构建的电化学传感器具有较好的稳定性。

2）莱克多巴胺浓度与电流响应值间的线性关系

在优化的条件下，利用循环伏安法检测不同浓度的莱克多巴胺标准溶液（图6）。在一定的浓度范围内，电流相应值随着红霉素标准溶液浓度的增加而减小，这可能是由于在较高浓度的红霉素溶液中，有更多的红霉素分子与抗体结合，即待测的红霉素浓度越高，结合到电极上的抗体复合物就越少。这是由于待测的红霉素与固定在电极表面的红霉素竞争抗体，通过抗原抗体的相互作用，结合到电极表面的抗体量随着待测抗原浓度的增加而减少。实验得到的线性曲线如图7，在0.3-1000ng/ml范围内，红霉素浓度的对数值与其响应电流呈反比，线性相关方程为y=-0.9972x+36.807，相关系数为0.995，检测限为0.16ng/ml。

3）检测猪肉实际样品

从当地超市购买新鲜的猪肉，洗净粉碎后，称取5g样品，置于50ml离心管里，加入15.0ml乙腈，于振荡器上剧烈震荡10min。以4200r/min的转速离心5min，取上清液于另一离心管中，加2.0g氯化钠和10.0ml正己烷，于震荡器上剧烈震荡10min，以4200r/min的转速离心10min，小心吸取中间乙腈层12.0ml于另一离心管中，氮吹至近干、用PBS缓冲液溶解。在最优条件下对样品进行检测，样品中莱克多巴胺的浓度根据校正曲线算出，其回收率可以达到83.0%-113.1%，如图8所示。

虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (4)

1.一种基于纳米材料检测莱克多巴胺的电化学传感器，其特征在于，是在玻碳电极表面先后修饰上纳米金粒子和制备的石墨烯-普鲁士蓝-壳聚糖复合物，然后在修饰好的电极上滴加莱克多巴胺抗原，得到检测莱克多巴胺的电化学免疫传感器；

具体制备方法如下：

步骤1）石墨烯-普鲁士蓝-壳聚糖复合物的制备；

步骤2）玻碳电极的预处理；

步骤3）将纳米金粒子电沉积到玻碳电极上；

步骤4）将步骤1）制备得到的石墨烯-普鲁士蓝-壳聚糖复合物的制备修饰到步骤3）电镀纳米金的玻碳电极上，得到修饰好的玻碳电极；

步骤5）将莱克多巴胺抗原滴加到步骤3）所得的修饰好的玻碳电极上，干燥5小时；得到莱克多巴胺电化学传感器。

2.根据权利要求1所述的一种基于纳米材料检测莱克多巴胺的电化学传感器，其特征在于，步骤1）所述石墨烯-普鲁士蓝-壳聚糖复合物是以壳聚糖和普鲁士蓝复合膜作为分散剂，分散石墨烯，得到的分散均匀的悬浊液；

步骤2）玻碳电极的预处理：将玻碳电极分别在0.3和0.05µm的Al₂O₃粉悬浮液中分别抛光，在二次蒸馏水和乙醇的混合溶液中超声清洗10min，使其利用循环伏安法测定时Ep1-Ep2£85mV的要求；

步骤3）所述纳米金粒子的电沉积，是在1%HAuCl₄溶液中，利用计时电流法，将Au³⁺还原成Au，沉积到电极表面；用二次蒸馏水冲洗10min，除去物理吸附的Au，得到纳米金沉积电极；

步骤4）所述在修饰好的电极上滴加将10µL壳聚糖-普鲁士蓝-石墨烯复合物溶液滴加到电极表面，干燥2h；再将10µL 100ng/ml 的莱克多巴胺抗原溶液滴加到修饰好的电极表面，干燥5小时；滴加10µL0.1%的牛血清白蛋白封闭电极表面的非特异性结合位点；得到莱克多巴胺电化学传感器；

步骤5）所述莱克多巴胺电化学传感器的两种试验条件莱克多巴胺固定抗原浓度、孵育时间进行了优化：莱克多巴胺的检测在固定抗原浓度为100ng/ml，孵育时间为40 min。

3.根据权利要求2所述的一种基于纳米材料检测莱克多巴胺的电化学传感器，其特征在于，步骤5）试验条件的优化：设置固定抗原浓度分别为10，20，50，100和1000ng/ml，利用电流响应值来确定最佳的固定抗原浓度，确定100ng/ml为最佳固定抗原浓度；选取10，20，30，40，50min作为孵育时间，利用电流响应值来确定最佳的孵育时间，确定40min为最佳孵育时间；

莱克多巴胺的检测：在最优条件下：固定抗原浓度为100ng/ml，孵育时间40 min，对不同浓度的莱克多巴胺进行电流检测，并分别建立了莱克多巴胺浓度与响应电流之间的线性关系，得不同浓度的莱克多巴胺的对数值与响应电流之间的线性回归方程为y=-0.9972x+36.807，相关系数为0.995。

4.一种基于纳米材料检测莱克多巴胺的电化学传感器，其特征在于，具体检测步骤如下：

1）猪肉样品的前处理：从当地超市购买猪肉，称取5g样品，置于50ml离心管里，加入15.0ml乙腈，于振荡器上剧烈震荡10min，

以4200r/min的转速离心5min，取上清液于另一离心管中，加2.0g氯化钠和10.0ml正己烷，于震荡器上剧烈震荡10min，以4200r/min的转速离心10min，小心吸取中间乙腈层12.0ml于另一离心管中，氮吹至近干、用PBS缓冲液溶解；

2）样品的检测：在最优条件下：固定抗原浓度为100ng/ml，孵育时间40 min，对猪肉样品进行检测；

3）根据建立的相应的线性关系，计算出相应样品的莱克多巴胺残留量。