CN108120761A - 基于具有电催化活性的多肽模拟物的电化学生物传感器用于乙酰胆碱酯酶检测 - Google Patents

基于具有电催化活性的多肽模拟物的电化学生物传感器用于乙酰胆碱酯酶检测 Download PDF

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Abstract

本发明公开了基于具有电催化活性的多肽模拟物的电化学生物传感器用于乙酰胆碱酯酶检测，特点是具体步骤如下：(1)将硝酸银、L‑半胱氨酸和二次蒸馏水于搅拌器上剧烈搅拌混合均匀，然后振荡器中孵育；(2)利用电化学方法将石墨烯电沉积到裸玻碳电极上，再用0.05％wt Nafion溶液与(1)所得溶液混合滴涂于GO/GCE上，得到基于具有电催化活性的多肽模拟物的电化学生物传感器(CP/GO/GCE)；(3)乙酰胆碱酯酶活性检测，乙酰胆碱一步催化生成H2O2，将乙酰胆碱、AChE和胆碱氧化酶混合均匀，孵育生成H2O2，(2)中制得传感器对该溶液检测，特异性好、灵敏度高、检测速度快，结果准确可靠；(4)AChE抑制剂马拉硫磷检测，将乙酰胆碱、AChE、马拉硫磷和胆碱氧化酶混合均匀，孵育，(2)中制得传感器对该溶液检测，优点是特异性好、灵敏度高、检测速度快，结果准确可靠。

Description

基于具有电催化活性的多肽模拟物的电化学生物传感器用于 乙酰胆碱酯酶检测
技术领域
本发明涉及电化学生物传感器，尤其是涉及基于具有电催化活性的多肽模拟物的电化学生物传感器的制备方法及其在乙酰胆碱酯酶检测方面的应用，属于功能材料和生物传感技术领域。
背景技术
乙酰胆碱酯酶(AChE)是一种具有羧肽酶和氨肽酶活性的胆碱酯酶，能够选择性的催化水解底物乙酰胆碱。它与细胞的发育和成熟有密切的关系，对神经元的发育和神经的再生有促进作用。在人体内，AChE主要分布于神经系统组织中，能够快速的催化水解神经递质乙酰胆碱而导致神经冲动传递的终止，从而使人体的正常生理功能得到保证。研究表明，AChE与细胞的发育和成熟有紧密的关系，主要表现在：胚胎组织中富含AChE；在原发性肿瘤组织及某些癌症病人的血清中发现AChE的活性增加；AChE的诞生与神经系统的发生过程有直接关系。医学上，AChE功能受到影响会引起精神类疾病，如：阿尔茨海默病和帕金森病等。AChE活性受有机磷农药的特异性抑制，故而可以成为监控有机磷农药的重要的靶标物质。由此可见，AChE与人类健康有十分重要的关系，因此发展AChE活性的分析检测方法有十分重要和现实的意义。
有机磷农药是人类最早合成而且至今仍在广泛使用的一类杀虫剂，是目前我国使用最重要的农药之一。有机磷农药与AChE结合会形成磷酰化胆碱酯酶(ChE)，磷酰化ChE很稳定，使酶失去催化水解的能力并逐渐老化，造成乙酰胆碱(ACh)在体内的积累，最终导致胆碱能神经先兴奋后抑制。高含量的有机磷农药可导致惊厥、呼吸困难、心律不齐、缺氧症等急性中毒症状，低含量的有机磷农药亦可经长期慢性毒害导致心脏、肝脏、肾和其他器官的损害。基于酶抑制型的乙酰胆碱酯酶生物传感用于对有机磷农药检测，具有灵敏度高、分析速度快、成本低、能在复杂体系中进行在线连续监测等优点。开发一些易于操作、价格低廉的新型乙酰胆碱酯酶生物传感技术，用于实现对有机磷农药的高灵敏检测仍然具有十分重要的意义。
目前国内外文献中已报道的基于乙酰胆碱酯酶生物传感器的检测方法主要有比色法、化学发光法、荧光法、电化学法、石英晶体微天平法等。其中，电化学生物传感器结合了电化学的强大分析功能、特异性识别生物性能，将生物反应的化学信号转换为与被分析物质浓度有关的电信号，从而达到检测目的，具备快速、稳定、选择性强、重现性好、易于操作、步骤简单等优点而被广泛运用，具有良好的应用前景。目前，各种各样新颖的纳米材料涌现，吸引了大量科学工作者的关注并利用这些新材料构建一系列新型电化学生物传感器，具有广泛的应用前景。近年来，由于独特的结构拓扑学和相关的光物理性质使得超分子化学迅速发展，主要通过分子间非共价键相互作用，包括氢键作用、静电作用、π-π堆积、疏水作用以及币族金属-金属相互作用，合理地设计并合成系列功能化的高维超分子结构体系。其中，基于d10币族金属离子“metallophilicity”相互作用、巯基-金属间相互作用以及金属-金属间相互作用构建的超分子结构体系引起广泛关注。目前，以巯基类分子为配体所形成的银离子配位聚合物尤为引入注目，该类配位聚合物以线性的方式配位，每一股链系由近似平面Z-型的-S(R)-Ag(I)-S(R)-Ag(I)-S(R)-Ag(I)-片段组成。当我们采用的配体是含巯基氨基酸结构的时候，通过Ag(I)-Ag(I)和巯基-Ag(I)的相互作用形成的配位聚合物具有类似多肽的结构。因此我们采用L-半胱氨酸为配体，与Ag(I)形成了类多肽结构的配位聚合物，由于其具有良好的导电性、催化性能及生物兼容性，能有效电催化H2O2还原，进而检测出电信号，非常适合用于开发电化学生物传感器。
本发明基于具有比表面积大、边缘位点多、生物相容性好等优点的石墨烯(GO)和具有电催化活性的多肽模拟物(以L-半胱氨酸为配体合成L-半胱氨酸-银配位聚合物，标记为Cys-Ag(I)CP)，构建了一种无标记、简单、成本低廉的乙酰胆碱酯酶电化学生物传感器，其基本原理如下：通过乙酰胆碱在乙酰胆碱酯酶(AChE)和胆碱氧化酶(ChOx)的作用下分解产生的H2O2这种活性分子，再利用多肽模拟物Cys-Ag(I)CP对H2O2体系的催化进行电化学信号检测。该传感器可以用来检测乙酰胆碱酯酶活性并筛选其小分子有机磷抑制剂，特异性好、灵敏度高、结果准确可靠、成本低、快速，且制备过程极其简单。目前，国内外还没有公开任何基于具有电催化活性的多肽模拟物修饰电极的AChE及有机磷小分子抑制剂的电化学生物传感器的相关报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种特异性好、灵敏度高、检测速度快、结果准确可靠、成本低的基于具有电催化活性的多肽模拟物的电化学生物传感器用于乙酰胆碱酯酶检测。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：基于具有电催化活性的多肽模拟物的电化学生物传感器用于乙酰胆碱酯酶检测，具体步骤如下：
(1)具有电催化活性的多肽模拟物的合成
依次移取50.0～80.0μL二次蒸馏水、5.0～30.0μL浓度为1.0～5.0mM的硝酸银(AgNO3)溶液及5.0～30.0μL浓度为1.0～5.0mM的L-半胱氨酸(L-Cys)溶液，搅拌器上剧烈搅拌2～5min至混合均匀，然后移至温度为25～37℃、转速调至150～200r/min的振荡器中孵育8～30min，得到半胱氨酸-银配位聚合物(简写为Cys-Ag(I)CP)，具有类似多肽的结构。最后将此多肽类似物移至4℃冰箱避光保存备用。
(2)电化学生物传感器的制备
a.首先将裸玻碳电极(GCE，直径为3mm)抛光清洗处理干净，氮气吹干；
b.将石墨烯借助循环伏安法设置电位-1.5～0.5V，扫速为10mV/s电沉积到裸玻碳电极上得到稳定的石墨烯修饰玻碳电极(简写为GO/GCE)；然后用移液器取1.0～4.0μL(1)中溶液与2μL 0.05％wt Nafion溶液混合滴涂于GO/GCE上，15～60min后，用二次蒸馏水缓慢冲洗电极，得到基于具有电催化活性的多肽模拟物的电化学生物传感器(简写为CP/GO/GCE)。
(3)AChE活性检测
依次取0.1～5.0μL浓度为1.0～3.0M的乙酰胆碱水溶液，0.1～5.0μL浓度为102～3×103U/L的AChE，0.1～5.0μL浓度为1.0×102～4.0×103U/L的ChOx及100.0～500.0μL的PBS(0.1M，pH 7.0)至总体积为500μL。搅拌器上剧烈搅拌1～3min至混合均匀，然后移至温度为30～37℃、转速调至150～200r/min的振荡器中孵育15～30min，合成一系列反应液，控制AChE终浓度范围为：0～1.2U/L。利用(2)中所得传感器对该溶液进行检测。
(4)AChE抑制剂马拉硫磷的检测
依次取0.1～5.0μL浓度为1.0～3.0M的乙酰胆碱水溶液，0.1～5.0μL浓度为102～3×103U/L的AChE，0.5～10.0μL浓度为10～200nM的马拉硫磷，0.1～5.0μL浓度为1.0×102～4.0×103U/L的ChOx及100.0～500.0μL的PBS(0.1M，pH 7.0)至总体积为500μL。搅拌器上剧烈搅拌1～3min至混合均匀，然后移至温度为30～37℃、转速调至150～200r/min的振荡器中孵育15～30min，合成一系列反应液，控制马拉硫磷的终浓度范围为：0～1.5nM。利用(2)中所得传感器对该溶液进行检测。
利用上述基于具有电催化活性的多肽模拟物的电化学生物传感器用于乙酰胆碱酯酶检测，利用计时电流法，设置电位为-0.3V，检测CP/GO/GCE对不同浓度AChE体系产生的H2O2的电化学响应，获得一系列不同浓度的AChE对应的电流大小，建立电流响应与AChE之间的定量关系，根据两者之间的定量关系，确定待测样品中AChE的含量。
利用上述基于具有电催化活性的多肽模拟物的电化学生物传感器检测AChE抑制剂马拉硫磷的方法，利用计时电流法，设置电位为-0.3V，检测CP/GO/GCE在浓度为0.1M、pH7.0的PBS缓冲液中对不同浓度的马拉硫磷的电化学响应，获得一系列不同浓度的马拉硫磷对应的电流大小，建立电流响应与马拉硫磷之间的关系，确定马拉硫磷对AChE的半抑制浓度IC50。
发明原理：本发明是一种电化学生物传感器，利用硝酸银与半胱氨酸成功合成结构与多肽类似的银-巯基配位聚合物，制备了一种高效的用于检测AChE的电化学生物传感器。AChE和ChOx存在的条件下能催化乙酰胆碱生成H2O2。利用石墨烯(GO)的良好导电性和多肽类似物的协同作用，构建了一种简单快速、高灵敏、高选择性、免标记的AChE及其小分子抑制剂的分析检测方法。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明构建了基于具有电催化活性的多肽模拟物的电化学生物传感器。首先，利用“metallophilicity”相互作用、巯基-金属间相互作用以及金属-金属间相互作用合成了一种结构类似多肽的半胱氨酸-银配位聚合物，并通过Nafion溶液组装至石墨烯修饰电极表面，再利用构建的传感器检测乙酰胆碱酯酶体系中生成的双氧水。随着乙酰胆碱酯酶浓度的增加，双氧水浓度也会相应增加，通过检测双氧水的量来间接检测乙酰胆碱酯酶的活性。显然，在一定浓度范围内，乙酰胆碱酯酶浓度越大，电流响应越明显。实验结果表明，电流的大小与目标物的浓度在一定范围内呈线性关系，实现对目标物的检测。其优点在于：
(1)高灵敏度。实验得出传感器的电流响应对H2O2的线性相关方程为y＝-194.26x-7.71，R2＝0.9494，线性范围为0.001～5mM，检测限为300nM；传感器的电流响应对AChE浓度的线性相关方程为y＝-136.55x+1.67，R2＝0.9962，线性范围为0.001～1U/L，检测限为0.0006U/L，传感器的电流响应对AChE抑制剂马拉硫磷的半抑制浓度为0.1nM，由此说明传感器对AChE及其小分子抑制剂可实现高灵敏度检测。
(2)高特异性。人体中其他常见的物质如尿酸(UA)，多巴胺(DA)，柠檬酸(CA)，对乙酰氨基酚(AP)，葡萄糖(GLC)，钾离子(K+)，钙离子(Ca2+)和氯离子(Cl-)对H2O2检测均无干扰。其他常见的酶如碱性磷酸酶(ALP)、脱氧核苷酸末端转移酶(TdT)、焦磷酸酶(PPase)、木瓜蛋白酶(Papain)、溶菌酶(LZM)和凝血酶(TB)对AChE检测均无干扰。
(3)结果准确。在体积比为10％的尿液和10％的血清环境中，回收率均在90％～110％之间。
(4)制备与检测方法试剂用量少、检测速度快、成本低。本发明只需消耗少量材料和试剂就可实现对H2O2、AChE活性及其抑制剂的高灵敏检测。
综上所述，本发明是基于硝酸银和半胱氨酸合成具有类多肽结构的半胱氨酸-银配位聚合物，实验证明该多肽模拟物具有较好的生物兼容性和特殊的电催化活性，能够用于H2O2、AChE及其抑制剂的电化学检测，具有灵敏度高、选择性好、操作简单、分析快速、易于操作等优点，可以实现复杂酶体系中低浓度AChE的检测，具有良好的应用前景，然而，基于具有类多肽结构半胱氨酸-银配位聚合物的AChE及其小分子抑制剂的电化学生物传感器尚未见报道。
附图说明
图1为本发明传感器用于检测H2O2的可行性图；
图2为本发明传感器的对不同浓度H2O2的电化学响应图；
图3为本发明传感器的对不同浓度H2O2的校准曲线图；
图4为本发明传感器对H2O2的特异性实验图；
图5为本发明传感器用于检测AChE的可行性图；
图6为本发明传感器对不同浓度AChE的电化学响应图；
图7为本发明传感器对不同浓度AChE的校准曲线图；
图8为本发明传感器对AChE的选择性实验图；
图9为本发明传感器对AChE的抗干扰实验图；
图10为本发明传感器对不同浓度AChE抑制剂马拉硫磷的电化学响应图；
图11为本发明传感器对不同浓度AChE抑制剂马拉硫磷的校准曲线图。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
一、具体实施例
实施例1
基于具有电催化活性的多肽模拟物的电化学生物传感器用于乙酰胆碱酯酶检测，具体步骤如下：
(1)具有电催化活性的多肽模拟物的合成
依次移取80.0μL二次蒸馏水、10.0μL浓度为1.0mM的硝酸银(AgNO3)溶液及10.0μL浓度为1.0mM的L-半胱氨酸(L-Cys)溶液，搅拌器上剧烈搅拌3min至混合均匀，然后移至温度为37℃、转速调至150r/min的振荡器中孵育10min，得到半胱氨酸-Ag(I)配位聚合物(简写为Cys-Ag(I)CP)，具有类似多肽的结构。最后将此多肽类似物移至4℃冰箱避光保存备用。
(2)电化学生物传感器的制备
a.首先将裸玻碳电极(GCE，直径为3mm)抛光清洗处理干净，氮气吹干；
b.将石墨烯借助循环伏安法设置电位-1.5～0.5V，扫速为10mV/s电沉积到裸玻碳电极上得到稳定的石墨烯修饰玻碳电极(简写为GO/GCE)；然后用移液器取3.0μL(1)中溶液与2μL 0.05％wt Nafion溶液混合滴涂于GO/GCE上，30min后，用二次蒸馏水缓缓冲洗电极，得到基于具有电催化活性的多肽模拟物的电化学生物传感器(简写为CP/GO/GCE)。
(3)AChE活性检测
依次取1.0μL浓度为1.0M的乙酰胆碱水溶液，不同浓度的AChE，0.5μL浓度为5.0×102U/L的ChOx及PBS(0.1M，pH 7.0)至总体积为500μL。搅拌器上剧烈搅拌3min至混合均匀，然后移至温度为37℃、转速调至150r/min的振荡器中孵育30min，合成一系列反应液，控制AChE终浓度分别为：0，0.001，0.002，0.005，0.01，0.02，0.05，0.1，0.2，0.5，0.8，1，1.2U/L。利用(2)中所得传感器对该溶液进行检测。
(4)AChE抑制剂马拉硫磷的检测
依次取1.0μL浓度为1.0M的乙酰胆碱水溶液，1.5μL浓度为103U/L的AChE，不同浓度的马拉硫磷，0.5μL浓度为5.0×102U/L的ChOx及PBS(0.1M，pH 7.0)至总体积为500μL。搅拌器上剧烈搅拌3min至混合均匀，然后移至温度为37℃、转速调至150r/min的振荡器中孵育30min，合成一系列反应液，控制马拉硫磷的终浓度分别为：0，0.01，0.02，0.05，0.08，0.1，0.2，0.5，0.8，1，1.5nM。利用(2)中所得传感器对该溶液进行检测。
实施例2
基于具有电催化活性的多肽模拟物的电化学生物传感器用于乙酰胆碱酯酶检测，具体步骤如下：
(1)具有电催化活性的多肽模拟物的合成
依次移取50.0μL二次蒸馏水、25.0μL浓度为2.0mM的硝酸银(AgNO3)溶液及25.0μL浓度为2.0mM的L-半胱氨酸(L-Cys)溶液，搅拌器上剧烈搅拌4min至混合均匀，然后移至温度为30℃、转速调至160r/min的振荡器中孵育18min，得到半胱氨酸-Ag(I)配位聚合物(简写为Cys-Ag(I)CP)，具有类似多肽的结构。最后将此多肽类似物移至4℃冰箱避光保存备用。
(2)电化学生物传感器的制备
a.首先将裸玻碳电极(GCE，直径为3mm)抛光清洗处理干净，氮气吹干；
b.将石墨烯借助循环伏安法设置电位-1.5～0.5V，扫速为10mV/s电沉积到裸玻碳电极上得到稳定的石墨烯修饰玻碳电极(简写为GO/GCE)；；然后用移液器取2.8μL(1)中溶液与2μL 0.05％wt Nafion溶液混合滴涂于GO/GCE上，25min后，用二次蒸馏水缓缓冲洗电极，得到基于具有电催化活性的多肽模拟物的电化学生物传感器(简写为CP/GO/GCE)。
(3)AChE活性检测
依次取0.8μL浓度为3.0M的乙酰胆碱水溶液，不同浓度的AChE，1.2μL浓度为2.1×103U/L的ChOx及PBS(0.1M，pH 7.0)至总体积为500U/L。搅拌器上剧烈搅拌1.5min至混合均匀，然后移至温度为32℃、转速调至160r/min的振荡器中孵育21min，合成一系列反应液，控制AChE终浓度分别为：0，0.01，0.05，0.08，0.1，0.3，0.5，0.7，0.9，1.1U/L。利用(2)中所得传感器对该溶液进行检测。
(4)AChE抑制剂马拉硫磷的检测
依次取0.8μL浓度为3.0M的乙酰胆碱水溶液，1.6μL浓度为1.2×103U/L的AChE，不同浓度的马拉硫磷，1.2μL浓度为2.1×103U/L的ChOx及PBS(0.1M，7.0)至总体积为500U/L。搅拌器上剧烈搅拌2min至混合均匀，然后移至温度为32℃、转速调至160r/min的振荡器中孵育21min，合成一系列反应液，控制马拉硫磷的终浓度分别为：0，0.02，0.04，0.06，0.08，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8nM。利用(2)中所得传感器对该溶液进行检测。
实施例3
基于具有电催化活性的多肽模拟物的电化学生物传感器用于乙酰胆碱酯酶检测，具体步骤如下：
(1)具有电催化活性的多肽模拟物的合成
依次移取70.0μL二次蒸馏水、15.0μL浓度为2.2mM的硝酸银(AgNO3)溶液及15.0μL浓度为2.2mM的L-半胱氨酸(L-Cys)溶液，搅拌器上剧烈搅拌2min至混合均匀，然后移至温度为29℃、转速调至190r/min的振荡器中孵育10min，得到半胱氨酸-Ag(I)配位聚合物(简写为Cys-Ag(I)CP)，具有类似多肽的结构。最后将此多肽类似物移至4℃冰箱避光保存备用。
(2)电化学生物传感器的制备
a.首先将裸玻碳电极(GCE，直径为3mm)抛光清洗处理干净，氮气吹干；
b.将石墨烯借助循环伏安法设置电位-1.5～0.5V，扫速为10mV/s电沉积到裸玻碳电极上得到稳定的石墨烯修饰玻碳电极(简写为GO/GCE)；然后用移液器取2.5μL(1)中溶液与2μL0.05％wt Nafion溶液混合滴涂于GO/GCE上，36min后，用二次蒸馏水缓缓冲洗电极，得到基于具有电催化活性的多肽模拟物的电化学生物传感器(简写为CP/GO/GCE)。
(3)AChE活性检测
依次取2.4μL浓度为1.2M的乙酰胆碱水溶液，不同浓度的的AChE，1.6μL浓度为8.0×102U/L的ChOx及PBS(0.1M，pH 7.0)至总体积500μL。搅拌器上剧烈搅拌2.5min至混合均匀，然后移至温度为35℃、转速调至170r/min的振荡器中孵育26min，合成一系列反应液，控制AChE终浓度分别为：0，001，0.005，0.008，0.01，0.05，0.08，0.1，0.5，0.8，1.0，1.2U/L。利用(2)中所得传感器对该溶液进行检测。
(4)AChE抑制剂马拉硫磷的检测
依次取2.4μL浓度为1.2M的乙酰胆碱水溶液，1.8μL浓度为2.2×103U/L的AChE，不同浓度的马拉硫磷，1.6μL浓度为8.0×102U/L的ChOx及PBS(0.1M，pH 7.0)至总体积500μL。搅拌器上剧烈搅拌2min至混合均匀，然后移至温度为35℃、转速调至170r/min的振荡器中孵育26min，合成一系列反应液，控制马拉硫磷的终浓度分别为：0，0.02，0.06，0.1，0.15，0.2，0.6，0.8，1，1.1，1.2nM。利用(2)中所得传感器对该溶液进行检测。
二、H2O2浓度检测的应用
1、利用上述具体实施例1制备的电化学生物传感器检测H2O2的方法
利用计时电流法，设置电位为-0.3V，检测CP/GO/GCE在浓度为0.1M、pH 7.0的PBS缓冲液中对H2O2的电化学响应，获得一系列不同浓度的H2O2对应的电流大小，建立电流响应与H2O2之间的定量关系，根据两者之间的定量关系，确定待测样品中H2O2的含量。
在合成Cys-Ag(I)CP过程中(具体合成过程同上述实施例1所述)，同时研究了仅L-Cys和AgNO3存在时，制备传感器对6mM H2O2的电化学响应，如图1。实验现象表明Cys-Ag(I)CP合成成功且对H2O2有良好的电催化性能。证明了在缺少L-Cys和AgNO3任一反应物的条件下，Cys-Ag(I)CP无法合成。由此证明该实验在理论上和技术上是可行的。
2、灵敏度试验
利用计时电流法，设置电位为-0.3V，检测CP/GO/GCE在浓度为0.1M、pH 7.0的PBS缓冲液中对H2O2的电化学响应，H2O2浓度的范围为0.001～5mM。试验结果说明，如图2所示，说明随着H2O2浓度的增大，CP/GO/GCE对H2O2的电化学响应越明显；图3所示，传感器对H2O2的电流响应对浓度的线性相关方程为y＝-194.26x-7.71，R2＝0.9494，线性范围为0.001～5mM，根据S/N计算得知，检测限为300nM。说明传感器对H2O2可实现高灵敏度检测。
3、特异性实验
特异性实验中其他还原性物质的浓度均为1mM，所用到的其他还原性物质的缩写如下：尿酸(UA)，多巴胺(DA)，柠檬酸(CA)，对乙酰氨基酚(AP)，葡萄糖(GLC)，K+，Ca2+和Cl-。
利用计时电流法，设置电位为-0.3V，检测CP/GO/GCE，每100s加入0.5mM H2O2，每100s依次加入1mM尿酸(UA)，多巴胺(DA)，柠檬酸(CA)，对乙酰氨基酚(AP)，葡萄糖(GLC)，K+，Ca2+和Cl-四种干扰物质，检测CP/GO/GCE分别对此体系的电化学响应。结果如图4，观察到还原峰电流的大小与仅有过氧化氢存在时的峰电流基本没有差异，说明传感器实现了对过氧化氢的特异性检测。
三、AChE活性检测应用
1、利用上述具体实施例1制备的电化学生物传感器检测AChE的方法
利用计时电流法，设置电位为-0.3V，检测CP/GO/GCE在浓度为0.1M、pH 7.0的PBS缓冲液中对H2O2的电化学响应，获得一系列不同浓度AChE反应体系产物H2O2对应的电流大小，建立电流响应与AChE之间的定量关系，根据两者之间的定量关系，确定待测样品中AChE的含量。
在AChE催化反应体系中及合成Cys-Ag(I)CP过程中(具体合成过程同上述实施例1所述)同时研究了在缺少ACh、AChE、ChOx、L-Cys和AgNO3其中一种试剂时，制备传感器对溶液的电化学响应(反应体系主要成分如图5插入图所示)。其中1为五种物质均存在下，合成的Cys-Ag(I)CP对AChE催化反应体系的电化学响应，2、3、4为AChE催化反应中，ACh、AChE、ChOx分别缺一的条件下，制得传感器CP/GO/GCE对溶液的电化学响应，5、6为仅AgNO3或L-Cys修饰的GO/GCE对完整的AChE催化反应溶液的电化学响应。实验现象表明仅1：CP/GO/GCE对完整的AChE催化反应溶液有明显的响应信号，除1之外其他的体系响应信号几乎可以忽略。证明了在缺少L-Cys和AgNO3任一反应物的条件下，CP无法合成，也证明了AChE催化反应的发生，可以用来检测AChE的活性。由此证明该实验在理论上和技术上是可行的。
2、灵敏度试验
利用计时电流法，设置电位为-0.3V，上述具体实施例1制备的CP/GO/GCE对反应液的PBS溶液的检测，AChE浓度的范围为0～1.2U/L。试验结果说明，如图6所示，说明随着AChE活性的增大，CP/GO/GCE对H2O2的电化学响应越明显；如图7，传感器的电流响应对AChE浓度的线性相关方程为y＝-136.55x+1.67，R2＝0.9962，线性范围为0.001～1U/L，检测限为0.0006U/L，由此说明传感器对AChE可实现高灵敏度检测。说明传感器对AChE可实现高灵敏度检测。
3、特异性实验
AChE特异性实验中，AChE及其它酶的浓度均为0.5U/L，所用到的其他酶的缩写如下：木瓜蛋白酶(Papain)、脱氧核苷酸末端转移酶(TdT)、溶菌酶(LZM)和凝血酶(TB)。
(1)选择性实验
利用计时电流法，设置电位为-0.3V，按上述实施例1制备的CP/GO/GCE分别检测浓度为0.5U/L的碱性磷酸酶(ALP)、脱氧核苷酸末端转移酶(TdT)、焦磷酸酶(PPase)、木瓜蛋白酶(Papain)、溶菌酶(LZM)和凝血酶(TB)。如图8所示，与AChE对比，传感器对其他酶的电化学响应非常小，基本接近空白信号，说明传感器对于AChE的检测有很好的选择性。
(2)抗干扰实验，
利用计时电流法，设置电位为-0.3V，按上述实施例1制备的CP/GO/GCE，在0.5U/LAChE存在下，分别加入0.5U/L碱性磷酸酶(ALP)、脱氧核苷酸末端转移酶(TdT)、焦磷酸酶(PPase)、木瓜蛋白酶(Papain)、溶菌酶(LZM)和凝血酶(TB)等干扰物质混合，检测CP/GO/GCE分别对这六个体系的电化学响应。如图9，比较传感器对六个体系及仅AChE存在时的电流响应，观察到电流的大小与仅有AChE存在时的电流基本没有差异，说明传感器实现了对AChE的特异性检测。
4、AChE抑制剂马拉硫磷的检测
利用计时电流法，设置电位为-0.3V，按上述实施例1制备的CP/GO/GCE，在1U/LAChE存在下，检测不同浓度马拉硫磷存在下传感器对反应体系的电化学响应，如图10，电流大小与马拉硫磷浓度关系如图11所示，马拉硫磷对AChE的半抑制浓度IC50为0.10nM。
当然，上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明保护范围。

Claims (10)

1.基于具有电催化活性的多肽模拟物的电化学生物传感器用于乙酰胆碱酯酶检测，其特征在于该电化学生物传感器通过以下方法构建的：
首先，利用半胱氨酸和硝酸银合成类多肽结构的配位聚合物Cys-Ag(I)CP；然后将玻碳电极抛光洗净，电化学方法修饰石墨烯，再将配位聚合物滴涂于电极表面，得电化学生物传感器；最后，配制含不同浓度的乙酰胆碱酯酶和马拉硫磷反应液，检测电化学传感器对反应液的电化学响应。
2.如权利要求1所述的电化学生物传感器，其特征是，石墨烯修饰玻碳电极的具体方法是：首先将裸玻碳电极(GCE，直径为3mm)抛光清洗处理干净，氮气吹干；然后将石墨烯借助循环伏安法设置电位-1.5～0.5V，扫速为10mV/s电沉积到裸玻碳电极上得到稳定的石墨烯修饰电极，即GO/GCE。
3.如权利要求1所述的电化学生物传感器，其特征是，类多肽的半胱氨酸-银配位聚合物(Cys-Ag(I)CP)的合成具体方法为：依次移取50.0～80.0μL二次蒸馏水、5.0～30.0μL浓度为1.0～5.0mM的硝酸银(AgNO3)溶液及5.0～25.0μL浓度为1.0～4.0mM的L-半胱氨酸(L-Cys)溶液，搅拌器上剧烈搅拌2～5min至混合均匀，然后移至温度为25～37℃、转速调至150～200r/min的振荡器中孵育8～30min。最后移至4℃冰箱避光保存备用。
4.如权利要求1～3所述的电化学生物传感器，其特征是，传感器的制备方法为：用移液器取1.0～4.0μL(1)中溶液与2μL 0.05％wt Nafion溶液混合滴涂于GO/GCE上，15～60min后，用二次蒸馏水缓缓冲洗电极，得到基于具有电催化活性的多肽模拟物的电化学生物传感器(CP/GO/GCE)。
5.根据权利要求1～4所述的基于具有电催化活性的多肽模拟物的电化学生物传感器用于乙酰胆碱酯酶检测，其特征在于：利用计时电流法，设置电位为-0.3V，检测CP/GO/GCE在浓度为0.1M、pH 7.0的PBS缓冲液中对不同浓度H2O2的电化学响应，根据电流响应大小确定H2O2浓度。
6.如权利要求1～4所述的电化学生物传感器，其特征是，AChE活性检测的具体方法为：依次取0.1～5.0μL浓度为1.0～3.0M的乙酰胆碱水溶液，0.1～5.0μL浓度为102～3×103U/L的AChE，0.1～5.0μL浓度为1.0×102～4.0×103U/L的ChOx及100.0～500.0μL的PBS(0.1M，pH 7.0)至总体积为500μL。搅拌器上剧烈搅拌1～3min至混合均匀，然后移至温度为30～37℃、转速调至150～200r/min的振荡器中孵育15～30min。合成一系列反应液，控制AChE终浓度范围为：0～1.2U/L。利用制得传感器对反应液进行检测。
7.如权利要求1～4所述的电化学生物传感器，其特征是，AChE抑制剂马拉硫磷的检测，具体方法为：依次取0.1～5.0μL浓度为1.0～3.0M的乙酰胆碱水溶液，0.1～5.0μL浓度为102～3×103U/L的AChE，0.5～10.0μL浓度为10～200nM的马拉硫磷，0.1～5.0μL浓度为1.0×102～4.0×103U/L的ChOx及100.0～500.0μL的PBS(0.1M，pH 7.0)至总体积为500μL。搅拌器上剧烈搅拌1～3min至混合均匀，然后移至温度为30～37℃、转速调至150～200r/min的振荡器中孵育15～30min。合成一系列反应液，控制马拉硫磷的终浓度范围为：0～1.5nM。利用制得传感器对反应液进行检测。
8.根据权利要求1～7所述的基于具有电催化活性的多肽模拟物的电化学生物传感器用于乙酰胆碱酯酶检测，其特征在于：乙酰胆碱酯酶和胆碱氧化酶作用于乙酰胆碱一步生成H2O2。
9.根据权利要求1～8所述的基于具有电催化活性的多肽模拟物的电化学生物传感器用于乙酰胆碱酯酶检测，其特征在于：利用计时电流法，设置电位为-0.3V，检测CP/GO/GCE在浓度为0.1M、pH 7.0的PBS缓冲液中对AChE的电化学响应，根据电流响应的大小确定与AChE浓度的关系。
10.根据权利要求1～9所述的基于具有电催化活性的多肽模拟物的电化学生物传感器用于乙酰胆碱酯酶抑制剂马拉硫磷的检测，其特征在于：利用计时电流法，设置电位为-0.3V，检测CP/GO/GCE对AChE抑制剂马拉硫磷的电化学响应，确定半抑制剂浓度IC50。
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