CN113008966B - 一种可用于同时检测葡萄糖和尿酸的非酶电化学传感器 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种可同时检测葡萄糖和尿酸的电化学传感器，属于检测技术领域。本发明通过对传感器电极的预处理使其表面富含‑OH基团，提高电极的清洁和活化能力。传感器电极的修饰材料中，金纳米粒子具有较大的比表面积、优异的导电性能和催化能力，增强对葡萄糖或尿酸的催化能力，梯度聚丙烯酰胺凝胶实现待测物葡萄糖或尿酸实现富集分离的作用，既可以实现单一组分的定量检测，又可以实现双组分的同时检测，解决了商用传感器试纸不能通用的技术难题，为医学诊断方法提供了更多的思路，具有相当广泛的应用前景。

Description

一种可用于同时检测葡萄糖和尿酸的非酶电化学传感器

技术领域

本发明属于电化学传感器技术领域，具体涉及一种可用于同时检测葡萄糖和尿酸的非酶电化学传感器。

背景技术

随着社会经济的发展，人们生活水平和饮食结构的改变，糖尿病、高尿酸血症等患病率逐年增加，并呈现年轻化的趋势，已成为全球第一大、第二大代谢类慢性疾病，而中国是患病人数最多、发病率最高的国家之一，给社会经济和个人生活带来一定的负担及影响。

糖尿病是一种以高血糖为特征的代谢性疾病，长期高血糖可引发眼、肾、心脏、血管、神经的慢性损害、功能障碍。因此，作为临床上诊断糖尿病的唯一标准，血液中葡萄糖含量的检测显得尤为重要。

高尿酸血症是嘌呤代谢障碍所致的慢性代谢性疾病,长期高尿酸可引发痛风性急性关节炎、肾脏病变外，与内分泌代谢、心脑血管等系统的疾病发生和发展密切相关，是代谢性疾病的独立危险因素。因此，作为临床上诊断高尿酸血症的重要生化指标之一，血液中尿酸含量的检测具有重要意义。

有研究表明，糖尿病与高尿酸血症之间有着密切的关联。糖尿病和高尿酸血症都受到遗传因素、相同的饮食习惯影响。长期高尿酸血症可破坏胰腺β细胞功能而诱发糖尿病。反之，高尿酸血症患者为糖尿病的高发人群，糖尿病患者常伴肥胖、胰岛素抵抗等症状，影响尿酸代谢。因此，同时监测葡萄糖和尿酸浓度以便及时发现、控制调整指标水平而起到防治代谢性疾病的作用。

目前，实现测定葡萄糖或尿酸的技术较多，例如：光谱法、色谱法和生化法等，这些技术存在着检测时间长、操作步骤繁琐、设备昂贵等问题。相比于上述这些方法，电化学分析技术由于其分析速度快、灵敏度高、准确度高、成本低、易于操作等优点受到普遍关注。

电化学传感器是基于待测物的电化学性质将待测物化学反应能转换成电信号的分析测试装置。传感器根据电极修饰材料的不同分为含酶和非酶两大类。

目前，市场上最为常见的商用血糖仪和尿酸仪均是含酶修饰电极的电化学传感器。该传感器的重要部件是作为微电流反应区的试纸，试纸上电极表面修饰有生物酶，可与血液中的葡萄糖或尿酸发生反应产生电流。利用电流记数设施读取电流值，再转化成葡萄糖或尿酸浓度读数。血糖试纸常用酶主要为葡萄糖氧化酶和葡萄糖脱氢酶两种，尿酸试纸常用酶主要是尿酸氧化酶。这种含酶修饰的传感器虽然有较好的选择性，但由于不同的酶有不同的特性，检测的准确性和抗干扰能力都各不相同。这就导致了血糖试纸与尿酸试纸不能通用，血糖试纸或尿酸试纸各厂商各品牌之间也不能通用，从而使得监测过程操作繁琐，检测费时，增大开支。另外，由于酶的性质而导致的长期稳定性不足，易受环境的影响，制备复杂，重现性差，且造价昂贵等问题。因此，非酶电化学传感器用于血液中的葡萄糖和尿酸的定量检测是一个有吸引力的替代技术。

对于血液中葡萄糖或尿酸的非酶电化学传感器的研制，目前主要集中在单一组分尤其是葡萄糖的定量检测上，而对于双组分的同时检测的非酶传感器的研究极少。

非酶葡萄糖电化学传感器根据电化学检测方法的不同将分为了电位式、伏安法和电流型葡萄糖电化学传感器。其中，电流型无酶葡萄糖传感器是无酶葡萄糖电化学传感器中研究最多的一类。该类传感器研究不同溶液中的葡萄糖浓度和响应电流之间的关系进而对其进行分析测定。该类型传感器最早使用的电极材料有稀有金属(如铂、金)、过渡金属(如铜、镍)及合金,对葡萄糖具有一定催化作用。虽然过渡金属基传感器比任何其他传感器类型更高的灵敏度和抗干扰性，但它们具有线性范围，不适合血糖诊断，并且在中性pH下表现不佳，少量铁基材料除外。贵金属和合金传感器可以在中性pH条件下正常工作,与过渡金属相比，它们的灵敏度、抗干扰性和稳定性较差。随着纳米材料和纳米技术的快速发展,可制备出各种具有可控尺寸、形状、表面和物理化学特性的纳米金属材料，将有效缓解非酶葡萄糖传感器在选择性和灵敏度方面的问题。常用的主要有：贵金属、金属氧化物、金属硫化物、金属盐及多金属耦合材料等。其中，金纳米粒子以其较大的比表面积、优异的导电性能和催化能力备受关注。金纳米粒子修饰在传感器电极上的方法有超声电沉积法、Nafion膜黏贴法、碳纳米管负载法、旋转涂覆法等，修饰过程较为复杂，对环境、操作者、仪器要求较高，且都无法实现与尿酸的同时检测。

同样，非酶尿酸电化学传感器的研制主要集中在将如镧、银、铜、镍等金属及金属氧化物、硫化物的纳米材料，采用电聚合法、电位沉积法、滴涂法等修饰方法，负载在石墨烯、氧化石墨烯、多壁碳纳米管等材料上，实现对尿酸的定量检测。有研究表明，该类非酶尿酸电化学传感器可实现与抗坏血酸、多巴胺、肾上腺素、亚硝酸根离子等同时检测，但无法实现与葡萄糖的同时检测。

因此，为了降低成本，延长试纸的使用寿命，扩大试纸的适用范围，开发一种可用于葡萄糖和尿酸检测的非酶的电化学传感器，既可以实现单一组分的定量检测，又可以实现双组分的同时检测，具有广泛的应用价值。

发明内容

本发明为解决上述问题，开发一种可用于葡萄糖和尿酸检测的非酶的电化学传感器，既可以实现葡萄糖和尿酸单一组分的定量检测，又可以实现双组分的同时检测。

本发明提供一种用于电化学传感器的工作电极，其由金纳米粒子和梯度聚丙烯酰胺凝胶组成的复合材料，以滴涂的方式修饰在经过预处理的ITO导电玻璃上形成。

本发明还提供一种可用于葡萄糖和尿酸检测的非酶的电化学传感器，其通过上述工作电极与饱和甘汞电极为参比电极、铂电极为对电极组成。

该传感器通过以下方法制备得到：

(1)将ITO导电玻璃用清洗剂清洗后然后用去离子水清洗，随后将ITO导电玻璃置于氢氧化钠溶液中浸泡然后用去离子水冲洗后干燥备用；

(2)柠檬酸钠溶液和四氯金酸溶液按照体积比1∶1混合定容，在磁力搅拌下加入硼氢化钠溶液，溶液由无色变为粉红色的瞬间停止滴加，制得金纳米粒子溶液；

(3)取步骤(2)中的金纳米粒子溶液、聚丙烯酰胺储备胶液、1.0～2.0mol/L的3-羟基氨基甲烷盐酸缓冲液、十二烷基硫酸钠溶液、过硫酸铵溶液和四甲基乙二胺溶液混匀，制得含有金纳米粒子的凝胶溶液Ⅰ；

(4)取步骤(3)中的凝胶溶液Ⅰ滴涂在步骤(1)处理后的ITO导电玻璃上，室温下等待溶液成膜；

(5)取步骤(2)中的金纳米粒子溶液、聚丙烯酰胺储备胶液、0.5～1.5mol/L的3-羟基氨基甲烷盐酸缓冲液、十二烷基硫酸钠溶液、过硫酸铵溶液和四甲基乙二胺溶液混匀，制得含有金纳米粒子的凝胶溶液Ⅱ；

(6)取步骤(5)中的凝胶溶液Ⅱ滴涂在步骤(4)成膜后的ITO导电玻璃上，室温下等待溶液成膜，制得基于金纳米粒子梯度聚丙烯酰胺凝胶修饰的传感器的工作电极；

(7)将上述工作电极与饱和甘汞电极为参比电极、铂电极为对电极一起形成所述可用于同时检测葡萄糖和尿酸的非酶电化学传感器。

优选地，所述3-羟基氨基甲烷盐酸缓冲液pH为5.6～9.9；

优选地，所制得的金纳米粒子粒径：30～500nm。

优选地，聚丙烯酰胺储备胶为商业化产品，也可以由由丙烯酰胺和亚甲基双丙烯酰胺混合后定容得到。

进一步的，该传感器通过以下方法制备得到：

(1)将ITO导电玻璃用清洗剂超声30～60分钟后用蒸馏水清洗，再依次用丙酮、乙醇、蒸馏水超声3～8分钟；随后将ITO导电玻璃置于氢氧化钠溶液中浸泡8～12小时，用去离子水冲洗后吹干备用；

(2)2.4×10^-2mol/L柠檬酸钠溶液和2.4×10^-2mol/L四氯金酸溶液按照体积比1∶1混合定容，在磁力搅拌下缓慢的滴加0.1mol/L硼氢化钠溶液，溶液由无色变为粉红色的瞬间停止滴加，制得金纳米粒子溶液；

(3)取步骤(2)中的金纳米粒子溶液、30％储备胶溶液、1.0～2.0mol/L的3-羟基氨基甲烷盐酸缓冲液(pH＝8.8)、5～15％十二烷基硫酸钠溶液、5～15％过硫酸铵溶液和四甲基乙二胺溶液混匀，制得含有金纳米粒子的凝胶溶液Ⅰ；优选的各组分的体积比为2.3～4.6∶5～2.7∶2.5∶0.1∶0.1∶0.004～0.006；

(4)取5～30μL步骤(3)中的凝胶溶液Ⅰ滴涂在步骤(1)处理后的ITO导电玻璃上，室温下等待溶液成膜；

(5)取步骤(2)中的金纳米粒子溶液、30％储备胶溶液、0.5～1.5mol/L的3-羟基氨基甲烷盐酸缓冲液(pH＝6.8)、5～15％十二烷基硫酸钠溶液、5～15％过硫酸铵溶液和四甲基乙二胺溶液混匀，制得含有金纳米粒子的凝胶溶液Ⅱ；优选的各组分的体积比为1.4～4.1∶0.33～1∶0.25～0.75∶0.02～0.06∶0.02～0.06∶0.02～0.006；

(6)取5～30μL步骤(5)中的凝胶溶液Ⅱ滴涂在步骤(4)成膜后的ITO导电玻璃上，室温下等待溶液成膜，制得基于金纳米粒子梯度聚丙烯酰胺凝胶修饰的传感器的工作电极；

(7)将上述工作电极与饱和甘汞电极为参比电极、铂电极为对电极一起，形成本发明的电化学传感器。

优选地，本发明的电化学传感器的电解质溶液为pH＝6.7～7.3的0.5～1.5mol/L磷酸缓冲溶液；

优选地，所述聚丙烯酰胺分子量为1.0×10⁴～2.0×10⁷。

优选地，所述电化学传感器的测试方法为方波伏安法，测试参数设置为：电位为-1.4V～+1.4V，扫描电压步长为4.0×10³V，振幅电压为2.5×10^-2V，频率为15Hz，等待时间为2s，灵敏度为1.0×10^-4A/V。

优选地，所述电化学传感器的测试范围为血糖浓度0～0.1mol/L，血尿酸浓度0～5.0×10^-2mol/L，完全适用于人体内浓度范围(血糖浓度0～5.0×10^-2mol/L，血尿酸浓度0～2.0×10^-3mol/L)，比目前市售的家用血糖仪或尿酸仪的测试范围(血糖浓度1.1×10^-3～3.33×10^-2mol/L，血尿酸浓度1.81×10^-4～1.188×10^-3mol/L)更宽泛，可适用范围更广。

本发明采用的电化学传感器既可以实现葡萄糖和尿酸单一组分的定量检测，又可以实现双组分的同时检测。

本发明采用了上述的技术方案，其有益效果是：

(1)本发明通过对传感器电极的预处理使其表面富含-OH基团，提高电极的清洁和活化能力。传感器电极的修饰材料中，金纳米粒子具有较大的比表面积、优异的导电性能和催化能力，增强对葡萄糖或尿酸的催化能力，梯度聚丙烯酰胺凝胶实现待测物葡萄糖或尿酸实现富集分离的作用，既可以实现单一组分的定量检测，又可以实现双组分的同时检测，解决了商用传感器试纸不能通用的技术难题，为医学诊断方法提供了更多的思路，具有相当广泛的应用前景。

(2)本发明利用简单滴涂和简单干燥的方法在电极表面形成了均匀的薄膜，制备过程简便，易于操作，制备过程环保无污染。

(3)本发明采用非酶修饰的方法，既降低了成本，又延长了试纸的使用寿命，同时克服了商用传感器酶试纸易失活、难储存的技术问题。

(4)本发明制备的电化学传感器的测试范围(血糖浓度0～0.1mol/L，血尿酸浓度0～5.0×10^-2mol/L)，完全适用于人体内浓度范围(血糖浓度0～5.0×10^-2mol/L，血尿酸浓度0～2.0×10^-3mol/L)，比目前市售的家用血糖仪或尿酸仪的测试范围(血糖浓度1.1×10^-3～3.33×10^-2mol/L，血尿酸浓度1.81×10^-4～1.188×10^-3mol/L)更宽泛，可适用范围更广。

(5)本发明制备的电化学传感器用以测定真实人体血液样品中的葡萄糖、尿酸的浓度，电极响应性能好，灵敏度高，稳定性高，重现性好，与市售的家用血糖仪或尿酸仪的检测结果无显著性差异，检测结果可靠。

附图说明

图1是本发明的电化学传感器结构示意图。

图2是本发明电化学传感器对葡萄糖检测性能的方波伏安法测试。

图3是本发明电化学传感器对尿酸检测性能的方波伏安法测试。

图4是本发明电化学传感器对典型样本的葡萄糖、尿酸同时检测的电流响应测试。

具体实施方式

为使本申请实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本申请实施例对本申请的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。

下面结合实施例对本发明做进一步详细说明。需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1

(1)将ITO导电玻璃用清洗剂超声30分钟后用蒸馏水清洗，再依次用丙酮、乙醇、蒸馏水超声5分钟，随后将ITO导电玻璃置于氢氧化钠溶液中浸泡8小时，用去离子水冲洗后吹干备用；

(2)2.4×10^-2mol/L柠檬酸钠溶液和2.4×10^-2mol/L四氯金酸溶液各取0.5mL，定容至50mL，在磁力搅拌下缓慢的滴加0.1mol/L硼氢化钠溶液，溶液由无色变为粉红色的瞬间停止滴加，制得平均粒径为158nm的金纳米粒子溶液；

(3)取步骤(2)中的金纳米粒子溶液、30％储备胶溶液、1.0mol/L的3-羟基氨基甲烷盐酸缓冲液(pH＝8.8)、5％十二烷基硫酸钠溶液、5％过硫酸铵溶液和四甲基乙二胺溶液按照体积比2.3∶5∶2.5∶0.1∶0.1∶0.004混匀，制得凝胶溶液Ⅰ；

(4)取20μL步骤(3)中的凝胶溶液Ⅰ滴涂在步骤(1)处理后的ITO导电玻璃上，室温下等待溶液成膜；

(5)取步骤(2)中的金纳米粒子溶液、30％储备胶溶液、0.5mol/L的3-羟基氨基甲烷盐酸缓冲液(pH＝6.8)、5％十二烷基硫酸钠溶液、5％过硫酸铵溶液和四甲基乙二胺溶液按照1.4∶0.33∶0.25∶0.02∶0.02∶0.02混匀，制得凝胶溶液Ⅱ；

(6)取20μL步骤(5)中的凝胶溶液Ⅱ滴涂在步骤(4)成膜后的ITO导电玻璃上，室温下等待溶液成膜，制得基于金纳米粒子梯度聚丙烯酰胺凝胶修饰的传感器的工作电极；

(7)将上述制备的工作电极与饱和甘汞电极为参比电极、铂电极为对电极一起，组成基于金纳米粒子梯度聚丙烯酰胺凝胶修饰的电化学传感器。

其中30％储备胶溶液购自北京索莱宝科技有限公司A1010的30％制胶液。

实施例2

本实施例所述的基于金纳米粒子梯度聚丙烯酰胺凝胶修饰的传感器的制备方法，其与实施例1的不同之处在于：步骤(3)中，金纳米粒子溶液、30％储备胶溶液、2.0mol/L的3-羟基氨基甲烷盐酸缓冲液(pH＝8.8)、15％十二烷基硫酸钠溶液、15％过硫酸铵溶液和四甲基乙二胺溶液按照体积比4.6∶2.7∶2.5∶0.1∶0.1∶0.006混匀，制得凝胶溶液Ⅰ；步骤(5)中，金纳米粒子溶液、30％储备胶溶液、1.5mol/L的3-羟基氨基甲烷盐酸缓冲液(pH＝6.8)、15％十二烷基硫酸钠溶液、15％过硫酸铵溶液和四甲基乙二胺溶液按照体积比4.1∶1∶0.75∶0.06∶0.06∶0.006混匀，制得凝胶溶液Ⅱ；制得基于金纳米粒子梯度聚丙烯酰胺凝胶修饰的传感器。

其中30％储备胶溶液购自北京索莱宝科技有限公司A1010的30％制胶液。

实施例3

本实施例所述的基于金纳米粒子梯度聚丙烯酰胺凝胶修饰的传感器的制备方法，其与实施例1的不同之处在于：步骤(3)中，金纳米粒子溶液、30％储备胶溶液、1.5mol/L的3-羟基氨基甲烷盐酸缓冲液(pH＝8.8)、10％十二烷基硫酸钠溶液、10％过硫酸铵溶液和四甲基乙二胺溶液按照体积比2.3∶5∶2.5∶0.1∶0.1∶0.004混匀，制得凝胶溶液Ⅰ；步骤(5)中，金纳米粒子溶液、30％储备胶溶液、1mol/L的3-羟基氨基甲烷盐酸缓冲液(pH＝6.8)、10％十二烷基硫酸钠溶液、10％过硫酸铵溶液和四甲基乙二胺溶液按照体积比1.4∶0.33∶0.25∶0.02∶0.02∶0.02混匀，制得凝胶溶液Ⅱ；制得基于金纳米粒子梯度聚丙烯酰胺凝胶修饰的传感器。

其中30％储备胶溶液购自北京索莱宝科技有限公司A1010的30％制胶液。

实施例4

本发明的传感器用于葡萄糖浓度的可行性验证，具体操作步骤如下：

(1)将实施例3中制得的基于金纳米粒子梯度聚丙烯酰胺凝胶修饰的传感器与电化学工作站相连；

(2)用一系列浓度葡萄糖的1.0mol/L磷酸缓冲溶液(pH＝7.0)作为电解质溶液；

(3)将电化学工作站工作模式设置为方波伏安法，电位为-1V～+1V，扫描电压步长为4.0×10^-3V，振幅电压为2.5×10^-2V，频率为15Hz，等待时间为2s，灵敏度为1.0×10^-4A/V。得到葡萄糖响应电流与电压的关系，结果如图2所示。随着葡萄糖溶液浓度的增加，其产生的电化学响应信号有所改变，且变化值随着葡萄糖溶液浓度增大而增大；

(4)根据步骤(3)中得到的响应电流与葡萄糖浓度进行拟合，利用origin软件绘制标准曲线，峰电流随浓度变化表现出良好的线性关系。若葡萄糖浓度在0～0.1mol/L范围内，测定时的电流变化值代入公式I＝-17.66×C-0.1548，得到葡萄糖溶液的浓度。其中浓度C的单位为mol/L，电流的单位是μA；

(5)取健康人体和糖尿病患者空腹全血样品分别作为检测样品，在步骤(3)的工作模式下所测得的电流值代入步骤(4)中公式，得到健康人体的空腹全血葡萄糖浓度为4.125×10^-3mol/L，糖尿病患者空腹全血葡萄糖浓度为7.286×10^-3mol/L。

实施例5

本发明的传感器用于尿酸浓度的可行性验证，具体操作步骤如下：

(1)将实施例3中制得的基于金纳米粒子梯度聚丙烯酰胺凝胶修饰的传感器，与电化学工作站相连；

(2)用一系列浓度尿酸的1.0mol/L磷酸缓冲溶液(pH＝7.0)作为电解质溶液；

(3)将电化学工作站工作模式设置为方波伏安法，电位为-0.4V～+1.4V，扫描电压步长为4.0×10^-3V，振幅电压为2.5×10^-2V，频率为15Hz，等待时间为2s，灵敏度为1.0×10^{- 4}A/V。得到葡萄糖响应电流与电压的关系。结果如图4所示，随着尿酸溶液浓度的增加，其产生的电化学响应信号有所改变，且变化值随着尿酸溶液浓度增大而增大；

(4)根据步骤(3)中得到的响应电流与尿酸浓度进行拟合，利用origin软件绘制标准曲线，峰电流随浓度变化表现出良好的线性关系。若尿酸浓度在0～5.0×10^-2mol/L范围内，测定时的电流变化值代入公式I＝-79500.23×C-82.99，得到尿酸溶液的浓度。其中浓度C的单位为mol/L，电流的单位是μA；

(5)取健康人体和高尿酸血症患者空腹全血样品分别作为检测样品，在步骤(3)的工作模式下所测得的电流值代入步骤(4)中公式，得到健康人体的空腹全血尿酸浓度为2.68×10^-2mol/L，高尿酸血症患者空腹全血尿酸浓度为4.61×10^-2mol/L。

实施例6

本发明的传感器用于同时检测葡萄糖和尿酸的可行性验证，具体操作步骤如下：

(1)将实施例3中制得的基于金纳米粒子梯度聚丙烯酰胺凝胶修饰的传感器与电化学工作站相连；

(2)分别将1.0mol/L磷酸缓冲溶液(pH＝7.0)、含有0.01mol/L葡萄糖和2.0×10^{- 4}mol/L尿酸的的1.0mol/L磷酸缓冲溶液(pH＝7.0)作为电解质溶液；

(3)将电化学工作站工作模式设置为方波伏安法，电位为-0.4V～+1.0V，扫描电压步长为4.0×10^-3V，振幅电压为2.5×10^-2V，频率为15Hz，等待时间为2s，灵敏度为1.0×10^{- 4}A/V。得到葡萄糖和尿酸响应电流与电压的关系。结果如图4所示，在不含葡萄糖和尿酸的磷酸缓冲溶液中，并没有明显的电化学响应信号；在含葡萄糖和尿酸的磷酸缓冲溶液中分别在-0.308V和+0.828V处有葡萄糖和尿酸产生的电化学响应信号；

(4)取健康人体和高尿酸血症伴有糖尿病的患者空腹全血样品分别作为检测样品，在步骤(3)的工作模式下进行检测，得到健康人体的空腹全血葡萄糖浓度为4.113×10^{- 3}mol/L，尿酸浓度为2.67×10^-4mol/L，高尿酸血症伴有糖尿病的患者空腹全血葡萄糖浓度为7.285×10^-3mol/L，尿酸浓度为4.65×10^-4mol/L。

实施例7

与实施例4的不同之处在于：步骤(1)中，将实施例1中制得的基于金纳米粒子梯度聚丙烯酰胺凝胶修饰的传感器，与电化学工作站相连；步骤(4)中，若葡萄糖浓度在0～0.1mol/L范围内，测定时的电流变化值代入公式I＝-16.55×C-0.1632，得到葡萄糖溶液的浓度。其中浓度C的单位为mol/L，电流的单位是μA；(5)取健康人体和糖尿病患者空腹全血样品分别作为检测样品，得到健康人体的空腹全血葡萄糖浓度为4.158×10^-3mol/L，糖尿病患者空腹全血葡萄糖浓度为7.295×10^-3mol/L。

实施例8

与实施例5的不同之处在于：步骤(1)中，将实施例1中制得的基于金纳米粒子梯度聚丙烯酰胺凝胶修饰的传感器，与电化学工作站相连；步骤(4)中，若尿酸浓度在0～0.05mol/L范围内，测定时的电流变化值代入公式I＝-79433.85×C–83.32，得到尿酸溶液的浓度。其中浓度C的单位为mol/L，电流的单位是μA；(5)取健康人体和高尿酸病患者空腹全血样品分别作为检测样品，得到健康人体的空腹全血尿酸浓度为2.71×10^-4mol/L，高尿酸血症患者空腹全血尿酸浓度为4.72×10^-4mol/L。

实施例9

与实施例6的不同之处在于：步骤(1)中，将实施例1中制得的基于金纳米粒子梯度聚丙烯酰胺凝胶修饰的传感器，与电化学工作站相连；步骤(4)中，取健康人体和高尿酸血症伴有糖尿病的患者空腹全血样品分别作为检测样品，得到健康人体的空腹全血葡萄糖浓度为4.152×10^-3mol/L，尿酸浓度为2.69×10^-4mol/L，高尿酸血症伴有糖尿病的患者空腹全血葡萄糖浓度为7.292×10^-3mol/L，尿酸浓度为4.69×10^-4mol/L。

实施例10

与实施例4的不同之处在于：步骤(1)中，将实施例2中制得的基于金纳米粒子梯度聚丙烯酰胺凝胶修饰的传感器，与电化学工作站相连；步骤(4)中，若葡萄糖浓度在0～0.1mol/L范围内，测定时的电流变化值代入公式I＝-18.79×C-0.1369，得到葡萄糖溶液的浓度。其中浓度C的单位为mol/L，电流的单位是μA；(5)取健康人体和糖尿病患者空腹全血样品分别作为检测样品，得到健康人体的空腹全血葡萄糖浓度为4.023×10^-3mol/L，糖尿病患者空腹全血葡萄糖浓度为7.143×10^-3mol/L。

实施例11

与实施例5的不同之处在于：步骤(1)中，将实施例2中制得的基于金纳米粒子梯度聚丙烯酰胺凝胶修饰的传感器，与电化学工作站相连；步骤(4)中，若尿酸浓度在0～0.05mol/L范围内，测定时的电流变化值代入公式I＝-79512.67×C-80.27，得到尿酸溶液的浓度。其中浓度C的单位为mol/L，电流的单位是μA；(5)取健康人体和高尿酸病患者空腹全血样品分别作为检测样品，得到健康人体的空腹全血尿酸浓度为2.53×10^-4mol/L，高尿酸血症患者空腹全血尿酸浓度为4.59×10^-4mol/L。

实施例12

与实施例6的不同之处在于：步骤(1)中，将实施例2中制得的基于金纳米粒子梯度聚丙烯酰胺凝胶修饰的传感器，与电化学工作站相连；步骤(4)中，取健康人体和高尿酸血症伴有糖尿病的患者空腹全血样品分别作为检测样品，得到健康人体的空腹全血葡萄糖浓度为4.021×10^-3mol/L，尿酸浓度为2.51×10^-4mol/L，高尿酸血症伴有糖尿病的患者空腹全血葡萄糖浓度为7.145×10^-3mol/L，尿酸浓度为4.58×10^-4mol/L。

对比例

(1)将ITO导电玻璃用清洗剂超声30分钟后用蒸馏水清洗，再依次用丙酮、乙醇、蒸馏水超声5分钟，随后将ITO导电玻璃置于氢氧化钠溶液中浸泡8小时，用去离子水冲洗后吹干备用；

(2)2.4×10^-2mol/L柠檬酸钠溶液和2.4×10^-2mol/L四氯金酸溶液各取0.5mL，定容至50mL，在磁力搅拌下缓慢的滴加0.1mol/L硼氢化钠溶液，溶液由无色变为粉红色的瞬间停止滴加，制得平均粒径为158nm金纳米粒子溶液；

(3)取步骤(2)中的金纳米粒子溶液、30％储备胶溶液、1.5mol/L的3-羟基氨基甲烷盐酸缓冲液(pH＝8.8)、10％十二烷基硫酸钠溶液、10％过硫酸铵溶液和四甲基乙二胺溶液按照体积比2.3∶5∶2.5∶0.1∶0.1∶0.004混匀，制得凝胶溶液Ⅰ；

(4)取20μL步骤(3)中的凝胶溶液Ⅰ滴涂在步骤(1)处理后的ITO导电玻璃上，室温下等待溶液成膜；

(5)取步骤(2)中的金纳米粒子溶液、30％储备胶溶液、1.0mol/L的3-羟基氨基甲烷盐酸缓冲液(pH＝6.8)、10％十二烷基硫酸钠溶液、10％过硫酸铵溶液和四甲基乙二胺溶液按照体积比1.4∶0.33∶0.25∶0.02∶0.02∶0.02混匀，制得凝胶溶液Ⅱ；

(6)取20μL步骤(5)中的凝胶溶液Ⅱ滴涂在步骤(4)成膜后的ITO导电玻璃上，室温下等待溶液成膜，制得基于金纳米粒子梯度聚丙烯酰胺凝胶修饰的传感器的工作电极；

(7)将上述制备的工作电极与饱和甘汞电极为参比电极、铂电极为对电极一起，组成基于金纳米粒子梯度聚丙烯酰胺凝胶修饰的电化学传感器，与电化学工作站相连；

(8)分别将1.0mol/L磷酸缓冲溶液(pH＝7.0)、含有0.01mol/L葡萄糖和2.0×10^{- 4}mol/L尿酸的的1.0mol/L磷酸缓冲溶液(pH＝7.0)作为电解质溶液；

(9)将电化学工作站工作模式设置为方波伏安法，电位为-0.4V～+1.0V，扫描电压步长为4.0×10^-3V，振幅电压为2.5×10^-2V，频率为15Hz，等待时间为2s，灵敏度为1.0×10^{- 4}A/V。得到葡萄糖和尿酸响应电流与电压的关系。在不含葡萄糖和尿酸的磷酸缓冲溶液中，并没有明显的电化学响应信号；在含葡萄糖和尿酸的磷酸缓冲溶液中分别在-0.308V和+0.828V处有葡萄糖和尿酸产生的电化学响应信号；

(10)取健康人体和高尿酸血症伴有糖尿病的患者空腹全血样品分别作为检测样品，在步骤(9)的工作模式下进行检测，得到传感器健康人体的空腹全血葡萄糖浓度为4.113×10^-3mol/L，尿酸浓度为2.67×10^-4mol/L，高尿酸血症伴有糖尿病的患者空腹全血葡萄糖浓度为7.285×10^-3mol/L，尿酸浓度为4.65×10^-4mol/L。传感器测试血糖、血尿酸的灵敏度为17.66μA/(mol/L)，7.95×10⁴μA/(mol/L)。

(11)将步骤(10)中的检测样品用于市售的血糖仪、尿酸仪进行测试，得到健康人体的空腹全血葡萄糖浓度为4.1×10^-3mol/L，尿酸浓度为2.68×10^-4mol/L，高尿酸血症伴有糖尿病的患者空腹全血葡萄糖浓度为7.3×10^-3mol/L，尿酸浓度为4.66×10^-4mol/L。

结果表明本发明的电化学传感器检测结果与市售的单一功能的血糖仪或尿酸仪检测结果无显著性差异。

以上所述实施例仅表达了本申请的具体实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本申请保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请技术方案构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。

Claims (7)

1.一种可用于同时检测葡萄糖和尿酸的非酶电化学传感器，由工作电极与饱和甘汞电极为参比电极、铂电极为对电极组成；

一种可用于同时检测葡萄糖和尿酸的非酶电化学传感器通过以下方法制备得到：

（1）将ITO导电玻璃用清洗剂清洗后用去离子水清洗，随后将ITO导电玻璃置于氢氧化钠溶液中浸泡然后用去离子水冲洗后干燥备用；

（2）将柠檬酸钠溶液和四氯金酸溶液混合定容，在搅拌下加入硼氢化钠溶液，制得金纳米粒子溶液；

（3）取步骤（2）中的金纳米粒子溶液、30%聚丙烯酰胺储备胶液、1.0～2.0 mol/L的3-羟基氨基甲烷盐酸缓冲液、5～15%十二烷基硫酸钠溶液、5～15%过硫酸铵溶液和四甲基乙二胺溶液混匀，制得含有金纳米粒子的凝胶溶液Ⅰ；各组分的体积比为2.3～4.6∶5～2.7∶2.5∶0.1∶0.1∶0.004～0.006；

（4）取步骤（3）中的凝胶溶液Ⅰ滴涂在步骤（1）处理后的ITO导电玻璃上，室温下等待溶液成膜；

（5）取步骤（2）中的金纳米粒子溶液、30%聚丙烯酰胺储备胶液、0.5～1.5 mol/L的3-羟基氨基甲烷盐酸缓冲液、5～15%十二烷基硫酸钠溶液、5～15%过硫酸铵溶液和四甲基乙二胺溶液混匀，制得含有金纳米粒子的凝胶溶液Ⅱ；各组分的体积比为1.4～4.1∶0.33～1∶0.25～0.75∶0.02～0.06∶0.02～0.06∶0.02～0.006；

（6）取步骤（5）中的凝胶溶液Ⅱ滴涂在步骤（4）成膜后的ITO导电玻璃上，室温下等待溶液成膜，制得基于金纳米粒子梯度聚丙烯酰胺凝胶修饰的传感器的工作电极；

（7）将上述工作电极与饱和甘汞电极为参比电极、铂电极为对电极一起形成所述可用于同时检测葡萄糖和尿酸的非酶电化学传感器。

2.如权利要求1所述的一种可用于同时检测葡萄糖和尿酸的非酶电化学传感器，其特征在于采用的3-羟基氨基甲烷盐酸缓冲液pH 为5.6～9.9。

3.如权利要求1所述的一种可用于同时检测葡萄糖和尿酸的非酶电化学传感器，其特征在于步骤（3）中3-羟基氨基甲烷盐酸缓冲液pH 为8.8，步骤（5）中的3-羟基氨基甲烷盐酸缓冲液pH 为6.8。

4.如权利要求1所述的一种可用于同时检测葡萄糖和尿酸的非酶电化学传感器，其特征在于所述的电化学传感器的电解质溶液为pH在 6.7～7.3的0.5～1.5 mol/L磷酸缓冲溶液。

5.如权利要求1所述的一种可用于同时检测葡萄糖和尿酸的非酶电化学传感器，其特征在于所述聚丙烯酰胺储备胶由丙烯酰胺和亚甲基双丙烯酰胺混合后定容得到。

6.包含权利要求1-5任一项所述的一种可用于同时检测葡萄糖和尿酸的非酶电化学传感器的血糖测试仪。

7.包含权利要求1-5任一项所述的一种可用于同时检测葡萄糖和尿酸的非酶电化学传感器的尿酸测试仪。

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