CN114384143B - 一种同时检测胰岛素与糖化血红蛋白的电化学检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种同时检测胰岛素和糖化血红蛋白的电化学检测方法，属于电化学物质含量检测领域，通过三电极传感件采集实验数据，通过循环伏安法在电极上修饰金纳米材料，通过差分伏安法确定最佳的胰岛素和糖化血红蛋白的抗体溶液浓度，通过差分伏安法检测胰岛素和糖化血红蛋白溶液，证明可获得浓度信息，确定胰岛素和糖化血红蛋白的灵敏度等参数；制备二者的混合溶液，通过差分伏安法检测混合溶液获得差分伏安曲线；提取差分伏安曲线的特征值，利用回归分析模型对实验数据解耦合，分别获得胰岛素和糖化血红蛋白溶液的浓度信息。本发明实现了双物质同时检测，具有便携性好、操作简单、成本低的优势，利于实现家庭和临床的糖尿病诊断、监控和管理。

Description

一种同时检测胰岛素与糖化血红蛋白的电化学检测方法
技术领域
本发明涉及电化学检测及电极修饰领域，尤其是一种同时检测胰岛素与糖化血红蛋白的电化学检测方法。
背景技术
糖尿病是以高血糖为特征的代谢性疾病，由胰岛素分泌缺陷或功能受损引起，进而引发身体各种组织，特别是眼、肾、心脏、血管、神经的慢性损害、功能障碍。胰岛素是机体内唯一能够降低血糖的蛋白质激素，体内胰岛素分泌缺陷或功能受损时均可导致高血糖，进而引发糖尿病及并发症，胰岛素是早期诊断糖尿病的重要指标。糖化血红蛋白是葡萄糖与红细胞内血红蛋白反应形成的一种稳定的糖化蛋白，能够反映两到三个月的平均血糖水平，且不受外界环境的干扰，糖化血红蛋白是糖尿病诊断和管理过程中重要的长期指标。因此，胰岛素和糖化血红蛋白的同时检测对于糖尿病早期诊断均具有重要意义。
胰岛素和糖化血红蛋白性质不同，实现二者同时测定的要求较高，通常将不同的检测方法相结合，如发光法和免疫分析结合，或多通道的电化学传感器，这导致检测成本高、耗时长、设计繁琐等问题，而且这类检测依赖于专用仪器。在众多测试技术中，电化学方法以其装置简单、灵敏度高和成本低等优点，在检测胰岛素或糖化血红蛋白的领域中受到了极大青睐。在目前针对胰岛素或糖化血红蛋白的电化学检测方法中，最常用的检测信号是电流、电位或阻抗。电流检测中，给电极一个扫描电压，被测物或底液在电极表面发生氧化还原反应，通过电流与浓度的线性关系得到胰岛素或糖化血红蛋白的浓度信息。阻抗检测中，在电极表面孵化相同浓度的抗体、固定不同浓度的抗原，通过电极表面阻抗和浓度的线性关系获得胰岛素或糖化血红蛋白的浓度信息。但阻抗型传感器检测时间较长，一般超过30分钟，难以满足检测需要。电位检测中，传感器结构相对复杂，设计繁琐，但探测范围更宽。目前，在现有的胰岛素和糖化血红蛋白的电化学检测技术中，尚未发现采用同一个电极即可在混合溶液中同时测定二者浓度信息的案例。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是提供一种同时检测胰岛素与糖化血红蛋白的电化学检测方法，用一根电极即可测量溶液中胰岛素和糖化血红蛋白的浓度，该方法检测成本低、效率高，有望成为一种可用于家庭和临床糖尿病早期诊断的有效、经济的新方法。
为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：
一种同时检测胰岛素与糖化血红蛋白的电化学检测方法，包括：
准备若干组三电极传感器件并通过循环伏安法分别在三电极传感器件上修饰金纳米材料；
孵育不同浓度的胰岛素抗体溶液，通过差分伏安法检测相同浓度的胰岛素溶液浓度，确定最佳浓度的胰岛素抗体溶液；再孵育相同浓度的胰岛素抗体溶液，通过差分伏安法检测不同浓度的胰岛素溶液，验证能够获得的浓度信息，确定胰岛素的浓度、检测灵敏度参数；
孵育不同浓度的糖化血红蛋白抗体溶液，通过差分伏安法检测相同浓度的糖化血红蛋白溶液浓度，确定最佳浓度的糖化血红蛋白抗体溶液；再孵育相同浓度的糖化血红蛋白抗体溶液，通过差分伏安法检测不同浓度的糖化血红蛋白溶液，验证能够获得的浓度信息，确定糖化血红蛋白的浓度、检测灵敏度参数；
制备不同浓度配比的胰岛素和糖化血红蛋白的混合溶液，通过差分伏安法检测混合溶液获得胰岛素-糖化血红蛋白混合溶液差分伏安曲线；
提取胰岛素-糖化血红蛋白混合溶液差分伏安曲线的特征值；
利用机器学习回归分析模型对胰岛素-糖化血红蛋白混合溶液差分伏安曲线图解耦合，分别获得胰岛素和糖化血红蛋白溶液的浓度。
本发明技术方案的进一步改进在于：所述三电极传感器件采用丝网印刷电极，包括工作电极、辅助电极和参比电极，其中工作电极和辅助电极均为碳电极，参比电极为银电极。
本发明技术方案的进一步改进在于：所述金纳米材料作为增加电极导电性的改性材料，修饰采用浓度为0.001mol/L的四氯金酸和0.01mol/L的硫酸钾溶液作为电沉积溶液，沉积时间为20分钟；以底液铁氰化钾作为电极表面反应的氧化还原剂，采用浓度为0.005mol/L的铁氰化钾溶液。
本发明技术方案的进一步改进在于：所述孵育不同浓度的胰岛素抗体溶液，通过差分伏安法检测相同浓度的胰岛素溶液浓度，确定最佳浓度的胰岛素抗体溶液；具体过程如下：
利用不同浓度的胰岛素抗体溶液分别修饰三组不同的电极以制备三种胰岛素免疫电极，采用差分伏安法对相同浓度的胰岛素溶液进行电化学检测；扫描电压范围设置为-0.2～0.3v，电势增量为4 mV，灵敏度为e-4 A/V；在电压的作用下，转移电子穿过电极表面与铁氰化钾发生氧化还原反应，电极表面物质越多，电子穿过电极界面难度增加，导致氧化电流越小，其氧化电流采用“电压-电流”曲线进行记录，不同浓度的胰岛素抗体溶液对应不同的氧化峰值电流；为明显区分胰岛素和糖化血红蛋白溶液的电流响应，在满足检测要求的前提下，确定最佳的胰岛素抗体溶液浓度；
所述再孵育相同浓度的胰岛素抗体溶液，通过差分伏安法检测不同浓度的胰岛素溶液，验证能够获得的浓度信息，确定胰岛素的浓度、检测灵敏度参数；具体过程如下：
通过电化学中的差分伏安法对不同浓度的胰岛素溶液进行检测；扫描电压范围设置为-0.2～0.3v，电势增量为4 mV，灵敏度为e-4 A/V；差分伏安法使用连续的脉冲上升电位，其波形呈现上升阶梯状，各梯级振幅逐级升高，同时记录产生的电流值；在电压的作用下，转移电子穿过电极表面与铁氰化钾发生氧化还原反应，电极表面物质越多，电子穿过电极界面难度增加，导致氧化电流越小，其氧化电流采用“电压-电流”曲线进行记录，不同浓度的胰岛素溶液对应不同的氧化峰值电流；制作“胰岛素浓度-氧化峰值电流”标准曲线，确定电化学检测胰岛素的浓度、检测灵敏度参数。
本发明技术方案的进一步改进在于：所述免疫电极的制作过程如下：取已修饰金纳米材料的丝网印刷电极，在工作电极表面滴涂胰岛素抗体溶液或糖化血红蛋白抗体溶液，4℃孵育16小时；孵育完成后，用磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，除去电极表面未结合的抗体；随后将牛血清白蛋白封闭液滴涂在三电极区域，37℃封闭2小时，然后使用磷酸盐缓冲液冲洗电极，并使电极在室温条件下自然干燥；随后将胰岛素溶液或糖化血红蛋白溶液滴涂在工作电极表面，37℃封闭1小时，即得到了免疫电极。
本发明技术方案的进一步改进在于：所述孵育不同浓度的糖化血红蛋白抗体溶液，通过差分伏安法检测相同浓度的糖化血红蛋白溶液浓度，确定最佳浓度的糖化血红蛋白抗体溶液；具体过程如下：
利用不同浓度的糖化血红蛋白抗体溶液分别修饰三组不同的电极以制备三种糖化血红蛋白免疫电极，采用差分伏安法对相同浓度的糖化血红蛋白溶液进行电化学检测；扫描电压范围设置为-0.2～0.3v，电势增量为4 mV，灵敏度为e-4 A/V；在电压的作用下，转移电子穿过电极表面与铁氰化钾发生氧化还原反应，电极表面物质越多，电子穿过电极界面难度增加，导致氧化电流越小，其氧化电流采用“电压-电流”曲线进行记录，不同浓度的胰岛素抗体溶液对应不同的氧化峰值电流；为明显区分胰岛素和糖化血红蛋白溶液的电流响应，在满足检测要求的前提下，确定最佳的糖化血红蛋白抗体溶液的浓度；
所述再孵育相同浓度的糖化血红蛋白抗体溶液，通过差分伏安法检测不同浓度的糖化血红蛋白溶液，验证能够获得的浓度信息，确定糖化血红蛋白的浓度、检测灵敏度参数；具体过程如下：
通过电化学中的差分伏安法对不同浓度的糖化血红蛋白溶液进行检测，电压范围设置为-0.2～0.3v，电势增量为4 mV，灵敏度为e-4 A/V；在电压的作用下，转移电子穿过电极表面与铁氰化钾发生氧化还原反应，电极表面物质越多，电子穿过电极界面难度增加，导致氧化电流越小，其氧化电流采用“电压-电流”曲线进行记录，不同浓度的糖化血红蛋白溶液对应不同的氧化峰值电流；制作“糖化血红蛋白浓度-氧化峰值电流”标准曲线，确定电化学检测糖化血红蛋白的浓度、检测灵敏度参数。
本发明技术方案的进一步改进在于：所述制备不同浓度配比的胰岛素和糖化血红蛋白的混合溶液，通过差分伏安法检测混合溶液获得胰岛素-糖化血红蛋白混合溶液差分伏安曲线；具体过程如下：
通过电化学中的差分伏安法，将不同浓度的胰岛素溶液与不同浓度的糖化血红蛋白溶液分别混合得到若干种混合溶液，对不同浓度配比下的胰岛素与糖化血红蛋白混合溶液进行检测，电压范围设置为-0.2～0.3V，电势增量为4 mV，灵敏度为e-4 A/V；在电压的作用下，转移电子穿过电极表面与铁氰化钾发生氧化还原反应，电极表面物质越多，电子穿过电极界面难度增加，导致氧化电流越小，其氧化电流采用“电压-电流”曲线进行记录，不同浓度配比下的胰岛素与糖化血红蛋白混合溶液对应不同的氧化峰值电流；制作“胰岛素与糖化血红蛋白浓度-氧化峰值电流”标准曲线，确定电化学检测胰岛素与糖化血红蛋白的参数。
本发明技术方案的进一步改进在于：所述特征值包括起始电流、电流极小值、电流极小值对应的电压、电压为零时对应的电流、峰值电流、峰值电流对应的电压、终点电流和曲线面积。
本发明技术方案的进一步改进在于：所述利用机器学习回归分析模型对胰岛素-糖化血红蛋白混合溶液差分伏安曲线图解耦合，分别获得胰岛素和糖化血红蛋白溶液的浓度；具体包括以下步骤：
通过机器学习中的随机森林算法，构建模型，对未知浓度的胰岛素与糖化血红蛋白混合溶液的差分伏安曲线进行解耦合，分别得到胰岛素和糖化血红蛋白在混合溶液中的预测浓度；
首先，利用已知和未知浓度的胰岛素和糖化血红蛋白混合溶液分别进行电化学差分伏安实验，针对已知浓度的混合溶液的差分伏安曲线特征值进行提取；
然后，将提取的特征值构成训练样本集，训练模型确定随机森林的每棵决策树，并汇总投票结果确定特征输入与浓度输出的路径；
最后，利用得到的随机森林模型对未知浓度的胰岛素和糖化血红蛋白溶液进行浓度预测。
由于采用了上述技术方案，本发明取得的技术进步是：
1、本发明基于三电极传感器件，通过电化学检测和机器学习方法，用一个电极即可实现混合溶液中胰岛素与糖化血红蛋白两种物质的同时检测，测量精度高，糖化血红蛋白预测浓度平均误差在1.8%，胰岛素预测浓度平均误差在4.9%；成本低，操作简单，检测效率高，单次检测成本低于80元，检测时间小于60s；检测胰岛素的灵敏度为0.3µA/pM，检测糖化血红蛋白的灵敏度为1.9µA/µM。
2、本发明与现有技术相比，修饰时间短，修饰方法和修饰材料简单，修饰成本低，响应时间短，体积小，实时性强，测量准确度高，有利于为家庭和临床的早期的糖尿病诊断提供一种新方法。
3、本发明在胰岛素和糖化血红蛋白的电化学检测方法中，选择原理相同的方法，即在电化学免疫的基础上使用差分伏安法检测电流信号，结合机器学习预测算法，利用同一电极在混合溶液中同时测定出二者的浓度信息，大大提升了检测效率。
4、本发明基于电化学系统和免疫检测原理实现胰岛素和糖化血红蛋白的同时检测，采用一根电极即可实现样品中两种物质的定量检测，可大大缩短测量时间和成本，对于糖尿病早期诊断均具有重要意义。
5、本发明具有特异性强、无需标记、操作简单的优势，可满足现场检测对低成本、简单、高效的检测要求，有望为家庭和临床提供一种有效、经济的糖尿病诊断和管理新方法。
附图说明
图1是本发明的工作流程示意图；
图2是本发明中电化学实验所用丝网印刷电极主视图；
图3是本发明中电化学实验所用丝网印刷电极侧视图；
图4是本发明中电化学实验平台示意图；
图5是本发明中电化学工作电极的电沉积修饰过程示意图；
图6是本发明中电化学工作电极的电沉积修饰前的效果示意图；
图7是本发明中电化学工作电极的电沉积修饰后的效果示意图；
图8是本发明中金纳米材料修饰前后的电极表征示意图，其中：
图(a)是金纳米材料修饰前的电极表面扫描电镜（SEM）图像；
图(b)是金纳米材料修饰后电极表面的扫描电镜（SEM）图像；
图(c)是金纳米材料修饰后的电极表面能谱分析图；
图(d)为电极修饰金纳米材料前后的电极循环伏安响应图；
图9是本发明中不同浓度胰岛素抗体溶液的差分伏安曲线图；
图10是本发明中不同浓度糖化血红蛋白抗体溶液的差分伏安曲线图；
图11是本发明中不同浓度配比的胰岛素和糖化血红蛋白混合溶液的差分伏安曲线图；
图12是本发明中利用机器学习方法对混合溶液的差分伏安曲线进行解耦合后，得到混合溶液中的胰岛素浓度的预测值与真实值的对比图；
图13是本发明中利用机器学习方法对混合溶液的差分伏安曲线进行解耦合后，得到混合溶液中的糖化血红蛋白浓度的预测值与真实值的对比图；
图14-图18是本发明中不同浓度配比胰岛素与糖化血红蛋白混合溶液的差分伏安曲线的特征值数据集；
其中，1、黑色，2、由黑色变为金黄色，3、金黄色。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明做进一步详细说明：
如图1-18所示，一种同时检测胰岛素和糖化血红蛋白的电化学检测方法，包括：
（1）电极传感器的选型；
如图4所示，搭建实验平台，包括检测用的三电极传感器件、电化学工作站以及电脑PC，电化学工作站一端与三电极传感器件相连，一端与电脑相连，实验曲线和数据在电脑上显示；
如图2、3所示，选择三电极传感器件（丝网印刷电极）作为采集电化学数据的传感器，三电极分别为工作电极、辅助电极和参比电极，其中工作电极为碳电极，辅助电极为碳电极，参比电极为银电极。所选丝网印刷电极制作简单，成本低，尺寸小，稳定性高，重现性好，无交叉污染，易于功能化修饰金纳米材料，碳电极不与被测物反应，检测电位范围宽、灵敏度高。采用的丝网印刷电极整体高度H为36mm，厚度δ为0.3mm，宽度L为15mm，工作电极为圆形，直径D为4mm。
（2）电极的修饰；
如图5、6、7所示，依据胰岛素与糖化血红蛋白分子的位阻效应特性，选择在工作电极表面修饰金纳米材料，以提高电流响应信号。所选金纳米材料导电性好，修饰方便简单，位点多，惰性不易氧化。电极修饰过程采用循环伏安法完成，扫描电位范围设置为-0.5～1.1v，选择浓度为0.001mol/L 的四氯金酸和0.01mol/L的硫酸钾溶液作为电沉积溶液，沉积时间为20分钟。
（3）电极的表征；
如图5所示，电沉积修饰过程，工作电极逐渐由黑色变为金黄色2；
如图6所示，为修饰前的效果，沉积前工作电极表面呈黑色1；
如图7所示，为修饰后的效果，沉积后工作电极表面呈金黄色3；
如图8所示，其中（a）为金纳米材料修饰前的电极表面扫描电镜图像，（b）为金纳米材料修饰后的电极表面扫描电镜图像，（c）为金纳米材料修饰后的电极能谱分析图，（d）为电极修饰金纳米材料前后的循环伏安响应图；
通过扫描电镜观测电极表面的修饰情况，由SEM成像可见，修饰前的电极表面平整，其表面呈黑色1，修饰过程中，工作电极逐渐由黑色变为金黄色2，而修饰完成后的电极表面变粗糙，呈金黄色3，说明电极表面确实存在附着物。为了进一步证明附着物是金，采用能谱分析法对附着物所含元素进行分析，除缓冲液元素外，能谱曲线中仅展示出了金元素，证明修饰物是金单质；通过循环伏安法测试未修饰金纳米材料和修饰金纳米材料的电极。裸电极的上下峰峰电流仅为80µA，导电性较差。经优化实验条件的电沉积法修饰后，电极的峰电流提高至160µA，证明修饰的金纳米材料使电极的导电性得到了明显改善。
（4）免疫电极的制备；
抗体在电极上的固定化过程采用吸附原理。取修饰金纳米材料的丝网印刷电极，在工作电极表面滴涂胰岛素抗体溶液或糖化血红蛋白抗体溶液，4℃孵育16小时。孵育完成后，用磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，除去电极表面未结合的抗体。随后将牛血清白蛋白封闭液滴涂在三电极区域，37℃封闭2小时，然后使用磷酸盐缓冲液冲洗电极，并使电极在室温条件下自然干燥；随后将胰岛素溶液或糖化血红蛋白溶液滴涂在工作电极，37℃封闭1小时，即得到了免疫电极。
（5）利用差分伏安法确定最佳的胰岛素抗体溶液浓度；
为了获取最佳的胰岛素免疫测定效果，本发明设置多种浓度的胰岛素抗体浓度对修饰了金纳米材料的电极进行免疫修饰。具体地，利用不同浓度的胰岛素抗体溶液（浓度分别为105pmol/L、104pmol/L、103pmol/L）分别修饰三根不同的电极以制备三种胰岛素免疫电极，采用差分伏安法对相同浓度的胰岛素溶液进行电化学检测，得到如图9所示的差分伏安曲线图。扫描电压范围设置为-0.2～0.3v，电势增量为4 mV，灵敏度为e-4 A/V。在电压的作用下，转移电子穿过电极表面与铁氰化钾发生氧化还原反应，电极表面物质越多，电子穿过电极界面难度增加，导致氧化电流越小，其氧化电流采用“电压-电流”曲线进行记录，不同浓度的胰岛素抗体溶液对应不同的氧化峰值电流。为明显区分胰岛素和糖化血红蛋白溶液的电流响应，在满足检测要求的前提下，确定最佳的胰岛素抗体溶液浓度为105pmol/L。
（6）差分伏安法检测不同浓度胰岛素溶液；
通过电化学中的差分伏安法对不同浓度的胰岛素溶液（浓度分别为25pmol/L、20pmol/L、15pmol/L、10pmol/L、5pmol/L）进行检测。扫描电压范围设置为-0.2～0.3v，电势增量为4 mV，灵敏度为e-4 A/V。差分伏安法使用连续的脉冲上升电位，其波形呈现上升阶梯状，各梯级振幅逐级升高，同时记录产生的电流值。在电压的作用下，转移电子穿过电极表面与铁氰化钾发生氧化还原反应，电极表面物质越多，电子穿过电极界面难度增加，导致氧化电流越小，其氧化电流采用“电压-电流”曲线进行记录，不同浓度的胰岛素溶液对应不同的氧化峰值电流。制作“胰岛素浓度-氧化峰值电流”标准曲线，确定电化学检测胰岛素的浓度，灵敏度等参数。
（7）利用差分伏安法确定最佳的糖化血红蛋白抗体溶液浓度；
为了获取最佳的糖化血红蛋白免疫测定效果，本发明设置多种浓度糖化血红蛋白抗体溶液对修饰了金纳米材料的电极进行免疫修饰。具体地，利用不同浓度的糖化血红蛋白抗体溶液（浓度分别为1000µg/mL、1500µg/mL、2000µg/mL）分别修饰三根不同的电极以制备三种糖化血红蛋白免疫电极，采用差分伏安法对相同浓度的糖化血红蛋白溶液进行电化学检测，得到如图10所示的差分伏安曲线图；扫描电压范围设置为-0.2～0.3v，电势增量为4 mV，灵敏度为e-4 A/V。在电压的作用下，转移电子穿过电极表面与铁氰化钾发生氧化还原反应，电极表面物质越多，电子穿过电极界面难度增加，导致氧化电流越小，其氧化电流采用“电压-电流”曲线进行记录，不同浓度的糖化血红蛋白抗体溶液对应不同的氧化峰值电流。为明显区分胰岛素和糖化血红蛋白溶液的电流响应，在满足检测要求的前提下，确定最佳的糖化血红蛋白抗体溶液浓度为1000µg/mL。
（8）差分伏安法检测不同浓度糖化血红蛋白溶液；
通过电化学中的差分伏安法对不同浓度的糖化血红蛋白溶液（浓度分别为700µg/mL、600µg/mL、500µg/mL、400µg/mL、300µg/mL、200µg/mL）进行检测，电压范围设置为-0.2～0.3v，电势增量为4 mV，灵敏度为e-4 A/V。在电压的作用下，转移电子穿过电极表面与铁氰化钾发生氧化还原反应，电极表面物质越多，电子穿过电极界面难度增加，导致氧化电流越小，其氧化电流采用“电压-电流”曲线进行记录，不同浓度的糖化血红蛋白溶液对应不同的氧化峰值电流。制作“糖化血红蛋白浓度-氧化峰值电流”标准曲线，确定电化学检测糖化血红蛋白的浓度，灵敏度等参数。
（9）差分伏安法检测不同浓度配比胰岛素和糖化血红蛋白混合溶液；
将浓度为25pmol/L、20pmol/L、15pmol/L、10pmol/L、5pmol/L的胰岛素溶液与浓度为700µg/mL、600µg/mL、500µg/mL、400µg/mL、300µg/mL、200µg/mL的糖化血红蛋白溶液分别混合得到30种混合溶液，进行电化学差分伏安法检测，得到如图11所示的胰岛素-糖化血红蛋白混合溶液差分伏安曲线。在胰岛素抗体浓度和糖化血红蛋白抗体浓度一定的情况下，随着胰岛素和糖化血红蛋白浓度的增加，电流呈线性减少。
具体地，通过电化学中的差分伏安法，将浓度为25pmol/L、20pmol/L、15pmol/L、10pmol/L、5pmol/L的胰岛素溶液与浓度为700µg/mL、600µg/mL、500µg/mL、400µg/mL、300µg/mL、200µg/mL的糖化血红蛋白溶液分别混合得到30种混合溶液，对不同浓度配比下的胰岛素与糖化血红蛋白混合溶液进行检测，糖化血红蛋白抗体溶液的浓度为1000µg/mL，胰岛素抗体浓度为105pmol/L。电压范围设置为-0.2～0.3V，电势增量为4 mV，灵敏度为e-4 A/V；在电压的作用下，转移电子穿过电极表面与铁氰化钾发生氧化还原反应，电极表面物质越多，电子穿过电极界面难度增加，导致氧化电流越小，其氧化电流采用“电压-电流”曲线进行记录，不同浓度配比下的胰岛素与糖化血红蛋白混合溶液对应不同的氧化峰值电流。制作“胰岛素与糖化血红蛋白浓度-氧化峰值电流”标准曲线，确定电化学检测胰岛素与糖化血红蛋白的参数。
（10）提取差分伏安曲线特征值；
提取胰岛素-糖化血红蛋白混合溶液差分伏安曲线上的特征值，包括起始电流、电流极小值、电流极小值对应的电压、电压为零时对应的电流、峰值电流、峰值电流对应的电压、终点电流和曲线面积。
（11）机器学习解耦合分别获得胰岛素和糖化血红蛋白的浓度；
通过机器学习中的随机森林算法构建模型，随机森林中的N棵决策树是N个分类器，对于一个输入样本，N棵树会有N个分类结果，而随机森林汇总所有的分类投票结果，将分类投票次数最多的类别指定为最终输出。该模型首先随机采样，并训练每棵决策树，输入待测样本到每棵树，再将每棵树的结果整合分类，确定模型的参数。对未知浓度的胰岛素与糖化血红蛋白混合溶液的差分伏安曲线进行解耦合，分别得到胰岛素和糖化血红蛋白在混合溶液中的预测浓度。首先，利用已知和未知浓度的胰岛素和糖化血红蛋白混合溶液分别进行电化学差分伏安实验，针对已知浓度的混合溶液的差分伏安曲线特征值进行提取；然后，将提取的特征值构成训练样本集，训练模型确定随机森林的每棵决策树，并汇总投票结果确定特征输入与浓度输出的路径；最后，利用得到的随机森林模型对未知浓度的胰岛素和糖化血红蛋白混合溶液进行浓度预测。
如图12所示，横坐标为真实的糖化血红蛋白浓度，纵坐标为真实的胰岛素浓度值，表格中数据为糖化血红蛋白浓度预测值。
如图13所示，横坐标为真实的胰岛素浓度，纵坐标为真实的糖化血红蛋白浓度值，表格中数据为胰岛素预测值。
如图14-18所示，表1-表5为不同浓度配比胰岛素与糖化血红蛋白混合溶液的差分伏安曲线的特征值数据集，其中包括训练模型所用的150组实验数据，表中：file为序号、i1为起始电流、i2为电流极小值、i3为电压为零时对应的电流、i4为峰值电流、i5为终点电流、v1为电流极小值对应的电压、v2为峰值电流对应的电压、area为曲线面积，HbA1c为糖化血红蛋白的真实浓度、 Insulin为胰岛素的真实浓度、 predict HbA1c为糖化血红蛋白的预测浓度，predict Insulin为胰岛素的预测浓度。
本发明为机器学习分类模型在利用电化学同时检测胰岛素与糖化血红蛋白问题上的具体应用，分为电极选择与修饰、电化学数据采集、数据分析三大部分。首先，选择三电极体系作为电化学实验的传感器件，电极为丝网印刷电极；选择金纳米材料作为工作电极的改性材料，修饰过程在四氯金酸溶液中进行；选择循环伏安法作为修饰金纳米材料的电化学方法。然后，基于不同浓度的胰岛素抗体利用差分伏安法检测胰岛素，确定最佳浓度的胰岛素抗体溶液；基于不同浓度的糖化血红蛋白抗体溶液采用差分伏安法检测糖化血红蛋白，确定最佳浓度的糖化血红蛋白抗体溶液。最后，通过差分伏安法对胰岛素和糖化血红蛋白的混合溶液进行检测，提取差分伏安曲线特征，采用机器学习算法模型对电化学实验数据进行解耦合，分别得到胰岛素与糖化血红蛋白溶液的浓度。
综上所述，本发明结合电化学检测和机器学习模型，提出利用一个电极即可对胰岛素和糖化血红蛋白进行同时检测的方法，此方法节约了检测时间，降低了检测成本，同时操作简单，便携性好，灵敏度高，能够实现糖尿病标志物胰岛素和糖化血红蛋白的同时检测，有助于对糖尿病早期患者进行诊断，具有良好的市场应用前景。

Claims (8)

1.一种同时检测胰岛素与糖化血红蛋白的电化学检测方法，其特征在于：包括：
准备若干组三电极传感器件并通过循环伏安法分别在三电极传感器件上修饰金纳米材料；
孵育不同浓度的胰岛素抗体溶液，通过差分伏安法检测相同浓度的胰岛素溶液浓度，确定最佳浓度的胰岛素抗体溶液；具体过程如下：
利用不同浓度的胰岛素抗体溶液分别修饰三组不同的电极以制备三种胰岛素免疫电极，采用差分伏安法对相同浓度的胰岛素溶液进行电化学检测；扫描电压范围设置为-0.2～0.3v，电势增量为4mV，灵敏度为e-4A/V；在电压的作用下，转移电子穿过电极表面与铁氰化钾发生氧化还原反应，电极表面物质越多，电子穿过电极界面难度增加，导致氧化电流越小，其氧化电流采用“电压-电流”曲线进行记录，不同浓度的胰岛素抗体溶液对应不同的氧化峰值电流；为明显区分胰岛素和糖化血红蛋白溶液的电流响应，在满足检测要求的前提下，确定最佳的胰岛素抗体溶液浓度；
再孵育相同浓度的胰岛素抗体溶液，通过差分伏安法检测不同浓度的胰岛素溶液，验证能够获得的浓度信息，确定胰岛素的浓度、检测灵敏度参数；具体过程如下：
通过电化学中的差分伏安法对不同浓度的胰岛素溶液进行检测；扫描电压范围设置为-0.2～0.3v，电势增量为4mV，灵敏度为e-4A/V；差分伏安法使用连续的脉冲上升电位，其波形呈现上升阶梯状，各梯级振幅逐级升高，同时记录产生的电流值；在电压的作用下，转移电子穿过电极表面与铁氰化钾发生氧化还原反应，电极表面物质越多，电子穿过电极界面难度增加，导致氧化电流越小，其氧化电流采用“电压-电流”曲线进行记录，不同浓度的胰岛素溶液对应不同的氧化峰值电流；制作“胰岛素浓度-氧化峰值电流”标准曲线，确定电化学检测胰岛素的浓度、检测灵敏度参数；
孵育不同浓度的糖化血红蛋白抗体溶液，通过差分伏安法检测相同浓度的糖化血红蛋白溶液浓度，确定最佳浓度的糖化血红蛋白抗体溶液；再孵育相同浓度的糖化血红蛋白抗体溶液，通过差分伏安法检测不同浓度的糖化血红蛋白溶液，验证能够获得的浓度信息，确定糖化血红蛋白的浓度、检测灵敏度参数；
制备不同浓度配比的胰岛素和糖化血红蛋白的混合溶液，通过差分伏安法检测混合溶液获得胰岛素-糖化血红蛋白混合溶液差分伏安曲线；
提取胰岛素-糖化血红蛋白混合溶液差分伏安曲线的特征值；
利用机器学习回归分析模型对胰岛素-糖化血红蛋白混合溶液差分伏安曲线图解耦合，分别获得胰岛素和糖化血红蛋白溶液的浓度。
2.根据权利要求1所述的一种同时检测胰岛素与糖化血红蛋白的电化学检测方法，其特征在于：所述三电极传感器件采用丝网印刷电极，包括工作电极、辅助电极和参比电极，其中工作电极和辅助电极均为碳电极，参比电极为银电极。
3.根据权利要求2所述的一种同时检测胰岛素与糖化血红蛋白的电化学检测方法，其特征在于：所述金纳米材料作为增加电极导电性的改性材料，修饰采用浓度为0.001mol/L的四氯金酸和0.01mol/L的硫酸钾溶液作为电沉积溶液，沉积时间为20分钟；以底液铁氰化钾作为电极表面反应的氧化还原剂，采用浓度为0.005mol/L的铁氰化钾溶液。
4.根据权利要求1所述的一种同时检测胰岛素与糖化血红蛋白的电化学检测方法，其特征在于：所述免疫电极的制作过程如下：
取已修饰金纳米材料的丝网印刷电极，在工作电极表面滴涂胰岛素抗体溶液或糖化血红蛋白抗体溶液，4℃孵育16小时；孵育完成后，用磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，除去电极表面未结合的抗体；随后将牛血清白蛋白封闭液滴涂在三电极区域，37℃封闭2小时，然后使用磷酸盐缓冲液冲洗电极，并使电极在室温条件下自然干燥；随后将胰岛素溶液或糖化血红蛋白溶液滴涂在工作电极表面，37℃封闭1小时，即得到了免疫电极。
5.根据权利要求1所述的一种同时检测胰岛素与糖化血红蛋白的电化学检测方法，其特征在于：所述孵育不同浓度的糖化血红蛋白抗体溶液，通过差分伏安法检测相同浓度的糖化血红蛋白溶液浓度，确定最佳浓度的糖化血红蛋白抗体溶液；具体过程如下：
利用不同浓度的糖化血红蛋白抗体溶液分别修饰三组不同的电极以制备三种糖化血红蛋白免疫电极，采用差分伏安法对相同浓度的糖化血红蛋白溶液进行电化学检测；扫描电压范围设置为-0.2～0.3v，电势增量为4mV，灵敏度为e-4A/V；在电压的作用下，转移电子穿过电极表面与铁氰化钾发生氧化还原反应，电极表面物质越多，电子穿过电极界面难度增加，导致氧化电流越小，其氧化电流采用“电压-电流”曲线进行记录，不同浓度的胰岛素抗体溶液对应不同的氧化峰值电流；为明显区分胰岛素和糖化血红蛋白溶液的电流响应，在满足检测要求的前提下，确定最佳的糖化血红蛋白抗体溶液的浓度；
所述再孵育相同浓度的糖化血红蛋白抗体溶液，通过差分伏安法检测不同浓度的糖化血红蛋白溶液，验证能够获得的浓度信息，确定糖化血红蛋白的浓度、检测灵敏度参数；具体过程如下：
通过电化学中的差分伏安法对不同浓度的糖化血红蛋白溶液进行检测，电压范围设置为-0.2～0.3v，电势增量为4mV，灵敏度为e-4A/V；在电压的作用下，转移电子穿过电极表面与铁氰化钾发生氧化还原反应，电极表面物质越多，电子穿过电极界面难度增加，导致氧化电流越小，其氧化电流采用“电压-电流”曲线进行记录，不同浓度的糖化血红蛋白溶液对应不同的氧化峰值电流；制作“糖化血红蛋白浓度-氧化峰值电流”标准曲线，确定电化学检测糖化血红蛋白的浓度、检测灵敏度参数。
6.根据权利要求1所述的一种同时检测胰岛素与糖化血红蛋白的电化学检测方法，其特征在于：所述制备不同浓度配比的胰岛素和糖化血红蛋白的混合溶液，通过差分伏安法检测混合溶液获得胰岛素-糖化血红蛋白混合溶液差分伏安曲线；具体过程如下：
通过电化学中的差分伏安法，将不同浓度的胰岛素溶液与不同浓度的糖化血红蛋白溶液分别混合得到若干种混合溶液，对不同浓度配比下的胰岛素与糖化血红蛋白混合溶液进行检测，电压范围设置为-0.2～0.3V，电势增量为4mV，灵敏度为e-4A/V；在电压的作用下，转移电子穿过电极表面与铁氰化钾发生氧化还原反应，电极表面物质越多，电子穿过电极界面难度增加，导致氧化电流越小，其氧化电流采用“电压-电流”曲线进行记录，不同浓度配比下的胰岛素与糖化血红蛋白混合溶液对应不同的氧化峰值电流；制作“胰岛素与糖化血红蛋白浓度-氧化峰值电流”标准曲线，确定电化学检测胰岛素与糖化血红蛋白的参数。
7.根据权利要求1所述的一种同时检测胰岛素与糖化血红蛋白的电化学检测方法，其特征在于：所述特征值包括起始电流、电流极小值、电流极小值对应的电压、电压为零时对应的电流、峰值电流、峰值电流对应的电压、终点电流和曲线面积。
8.根据权利要求1所述的一种同时检测胰岛素与糖化血红蛋白的电化学检测方法，其特征在于：所述利用机器学习回归分析模型对胰岛素-糖化血红蛋白混合溶液差分伏安曲线图解耦合，分别获得胰岛素和糖化血红蛋白溶液的浓度；具体包括以下步骤：
通过机器学习中的随机森林算法，构建模型，对未知浓度的胰岛素与糖化血红蛋白混合溶液的差分伏安曲线进行解耦合，分别得到胰岛素和糖化血红蛋白在混合溶液中的预测浓度；
首先，利用已知和未知浓度的胰岛素和糖化血红蛋白混合溶液分别进行电化学差分伏安实验，针对已知浓度的混合溶液的差分伏安曲线特征值进行提取；
然后，将提取的特征值构成训练样本集，训练模型确定随机森林的每棵决策树，并汇总投票结果确定特征输入与浓度输出的路径；
最后，利用得到的随机森林模型对未知浓度的胰岛素和糖化血红蛋白溶液进行浓度预测。
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