CN107655956A - 一种可用于牛血清白蛋白硝基化损伤检测分析的电化学传感器及其制备方法 - Google Patents

一种可用于牛血清白蛋白硝基化损伤检测分析的电化学传感器及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种可用于牛血清白蛋白硝基化损伤检测分析的电化学传感器及其制备方法，该电化学传感器包括工作电极、参比电极和辅助电极构成的三电极体系，工作电极为玻碳基底表面电沉积有纳米金/石墨烯/氯化高铁血红素复合材料修饰的玻碳电极；本发明同现有技术相比，利用一步电沉积法在玻碳电极表面沉积纳米金/石墨烯/氯化高铁血红素复合材料，利用氯化高铁血红素对硝基化过程进行催化，结合纳米金和石墨烯纳米复合物导电能力强，比表面积大，电催化活性高等特点，可实现对牛血清白蛋白硝基化的灵敏快速检测，检出限可达3.0×10‑8M，且传感器制备过程简单，无须样品预处理，检测速度快，有较强的应用价值。

Description

一种可用于牛血清白蛋白硝基化损伤检测分析的电化学传感 器及其制备方法
[技术领域]
本发明属于电分析化学和电化学传感器技术领域，具体地说是一种可用于牛血清白蛋白硝基化损伤检测分析的电化学传感器及其制备方法。
[背景技术]
蛋白质硝基化(PTN)损伤是指蛋白质分子中的酪氨酸残基硝基化为3-硝基酪氨酸(3-NT)。作为一种重要的蛋白质翻译后的修饰，3-NT的生成使蛋白质的结构与功能发生改变，最终诱导细胞损伤、细胞凋亡和疾病的发生。近年来，在多种心血管疾病、炎症、神经退行性疾病等病变的相应组织蛋白中都可以检测到3-NT的存在。因此，开发蛋白质硝基化损伤的分析检测方法，对于研究与人类死亡率较高的疾病如心脑血管疾病的发病机制以及疾病的早期诊断具有重要的应用价值。大量研究表明，PTN是体内一系列氧化应激的结果。其中，NO与O2·-反应生成的过氧亚硝酸根离子(ONOO-)是引起蛋白质酪氨酸硝基化损伤的主要因素。
目前，蛋白质硝基化损伤的主要研究方法需要的仪器设备昂贵，前样本处理过程复杂且样品损失严重，还面临如何将修饰后蛋白样品从复杂体系中纯化出来等问题。电化学传感器已广泛应用于基础研究、生物组分检测、临床疾病诊断、过程控制与检测、环境监控与保护等领域，具有选择性好、灵敏度高、分析速度快、成本低、能在复杂的体系中直接原位检测等特点，是解决上述问题的有利方法。
因此，有必要研究利用电化学传感器进行蛋白质硝基化的检测分析。
[发明内容]
本发明的目的就是要解决上述的不足而提供一种可用于牛血清白蛋白硝基化损伤检测分析的电化学传感器，不仅能够有效检测牛血清白蛋白的硝基化，且传感器制备过程简单，无须样品预处理，检测速度快，有较强的应用价值，解决了现有蛋白质硝基化分析检测技术中仪器设备昂贵、前处理复杂、样品损失严重等不足。
为实现上述目的设计一种可用于牛血清白蛋白硝基化损伤检测分析的电化学传感器，包括工作电极、参比电极和辅助电极构成的三电极体系，所述工作电极为玻碳基底表面电沉积有纳米金/石墨烯/氯化高铁血红素复合材料修饰的玻碳电极。
本发明还提供了一种可用于牛血清白蛋白硝基化损伤检测分析的电化学传感器的制备方法，包括以下步骤：
1)纳米金/氧化石墨烯/氯化高铁血红素复合电沉积液的制备：首先配制HAuCl4储备液：将HAuCl4溶解于去离子水中，震荡摇匀，并于2-8℃保存，使用前稀释；再配制氧化石墨烯GO溶液：取Hummer法制备的氧化石墨烯GO与去离子水混合，超声30min；配制氯化高铁血红素hemin溶液：称取氯化高铁血红素hemin与无水乙醇混合，加入氨水超声30min溶解，并于2-8℃保存；将上述配制的HAuCl4溶液、GO溶液和hemin溶液按5:1-2:5的比例混合，得到电沉积液；
2)纳米金/石墨烯/氯化高铁血红素复合材料修饰电极的制备：首先，玻碳电极的预处理：先用Al2O3抛光粉对电极进行打磨，经水冲洗后，再用电流-时间曲线技术对玻碳电极在0.1M pH7.0的磷酸盐缓冲液PBS进行活化，活化电位2.0V，活化时间200s；然后，纳米金/石墨烯/氯化高铁血红素复合材料的一步电沉积：利用循环伏安技术，将玻碳电极在步骤1)所得的电沉积液中进行原位沉积，扫描电位范围为-1.5-0.6V，扫速为0.025V/s，扫描圈数为20圈，即制备得到纳米金/石墨烯/氯化高铁血红素复合材料修饰的玻碳电极；再进一步对上述修饰电极进行常规的电化学性能测试，结果良好。
所述电化学传感器应用于牛血清白蛋白的硝基化损伤检测分析，灵敏度、准确度均良好。其具体检测条件为，测定介质：0.1M pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液；测定温度：37℃；测定方法：差分脉冲伏安法；扫描电位范围：0.1-0.6V。
所述电化学传感器对牛血清白蛋白硝基化损伤检测的方法，包括如下步骤：
1)首先配制牛血清白蛋白溶液：称取牛血清白蛋白与pH7.4的PBS混合均匀作为储备液，并于4℃保存，使用前稀释到10-3μg/mL，然后在4℃条件下，将纳米金/石墨烯/氯化高铁血红素复合材料修饰电极浸泡在10-3μg/mL的BSA溶液中6小时，用去离子水冲洗备用，得到电化学生物传感器；
2)在37℃恒温条件下，将步骤1)所得的电化学生物传感器置于pH7.4的PBS中，孵化5分钟，在hemin作用下催化BSA的硝基化，采集差分脉冲伏安曲线，扫描电位范围为0.1-0.6V；
3)在PBS中加入不同比例NaNO2和H2O2溶液，37℃恒温条件下孵化5分钟，分别采集差分脉冲伏安曲线，扫描电位范围为0.1-0.6V，即实现对牛血清白蛋白硝基化的检测。
本发明同现有技术相比，具有如下有益效果：
(1)本发明以纳米金/石墨烯/氯化高铁血红素作为电化学传感器的敏感材料，具有比表面积大，电催化活性好和富集能力强的优点，并且氯化高铁血红素可以原位催化硝基化试剂对吸附于电极表面蛋白质的酪氨酸残基硝基化，有利于快速检测；
(2)利用一步电化学法即可在玻碳电极表面原位沉积纳米金/石墨烯/氯化高铁血红素复合材料，其制备过程简单，耗时短；
(3)本发明可以直接应用于牛血清白蛋白硝基化的分析，操作简单，无需对样品进行预处理，不需要特殊实验条件，实用性强；
(4)能有效检测牛血清白蛋白的硝基化，检测时间短，一次检测仅需5min，且灵敏度高，牛血清白蛋白的硝基化含量检出限可达3.0×10-8M，实现了对血清白蛋白硝基化的快速灵敏检测。
[附图说明]
图1为本发明纳米金/石墨烯/氯化高铁血红素复合材料修饰的玻碳电极表面扫描电子显微镜图；
图2为裸电极和AuNPs/rGO/hemin电极修饰的玻碳电极在含有0.1mM铁氰化钾溶液中的循环伏安图，扫速0.1V/s；
图3为hemin催化下，NO与O2 ·-反应生成过氧亚硝酸根离子(ONOO-)引起蛋白质硝基化损伤示意图；
图4为AuNPs/rGO/hemin/GCE在分别加入0μL(a)、5μL(b)、10μL(c)、20μL(d)、40μL(e)、80μL(f)、100μL(g)5.0mM NaNO2和5.0mM H2O2的0.1M pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液中的差分脉冲伏安图。
[具体实施方式]
本发明提供了一种可用于牛血清白蛋白硝基化损伤检测分析的电化学传感器，包括工作电极、参比电极和辅助电极构成的三电极体系，其工作电极为玻碳基底表面电沉积有纳米金/石墨烯/氯化高铁血红素复合材料的玻碳电极。
该电化学传感器的制备方法，包括以下步骤：
(1)纳米金/氧化石墨烯/氯化高铁血红素复合电沉积液的制备：
首先配制10g/mLHAuCl4储备液：将1gHAuCl4溶解于100mL去离子水中，震荡摇匀，并于2-8℃保存，使用前稀释；配制0.5mg/mL氧化石墨烯(GO)溶液：取Hummer法制备的10mg/mLGO0.5mL与9.5mL去离子水混合，超声30min；配制0.5mg/mL氯化高铁血红素(hemin)溶液：称取0.05mghemin与10mL无水乙醇混合，加入5μL氨水超声30min溶解，并于2-8℃保存。其次，将上述配制的HAuCl4溶液、GO溶液和hemin溶液按5:2:5的比例混合，得到电沉积液。
(2)纳米金/石墨烯/氯化高铁血红素复合材料修饰电极的制备，包括以下步骤：
a.玻碳电极的预处理：先用Al2O3抛光粉对电极进行打磨，经水冲洗后，再用电流-时间曲线技术对玻碳电极在0.1MpH7.0的磷酸盐缓冲液(PBS)进行活化，活化电位2.0V，活化时间200s。
b.纳米金/石墨烯/氯化高铁血红素复合材料的一步电沉积：利用循环伏安技术，将玻碳电极在步骤(1)所述的电沉积液中进行原位沉积，扫描电位范围为-1.5～0.6V，扫速为0.025V/s，扫描圈数为20圈，制备得到纳米金/石墨烯/氯化高铁血红素复合材料修饰的玻碳电极。
c.再进一步对上述修饰电极进行常规的电化学性能测试，结果良好。
本发明还提供了电化学传感器的应用，具体是可用于牛血清白蛋白(BSA)的硝基化损伤检测分析。该电化学传感器对牛血清白蛋白硝基化损伤检测的具体步骤为：
首先配制10μg/mL牛血清白蛋白溶液：称取1mg牛血清白蛋白与1mLpH7.4的PBS混合均匀作为储备液，并于4℃保存，使用前稀释到10-3μg/mL，然后在4℃条件下，将上述制备的纳米金/石墨烯/氯化高铁血红素复合材料修饰电极浸泡在10-3μg/mL的BSA溶液中6小时，用去离子水冲洗备用，得到电化学生物传感器；在37℃恒温条件下，将上述电化学生物传感器置于0.1MpH7.4的PBS中，同时加入NaNO2(5.0mM)和H2O2(5.0mM)溶液，孵化5分钟，在hemin作用下催化BSA的硝基化，采集差分脉冲伏安曲线；采集加入不同比例NaNO2(5.0mM)和H2O2(5.0mM)下电极的差分脉冲伏安曲线，实现对牛血清白蛋白硝基化的检测。
该检测方法中，测定介质为0.1MpH7.4的磷酸盐缓冲溶液，测定温度为37℃，测定方法为差分脉冲伏安法，扫描电位范围为0.1-0.6V。
本发明利用一步电沉积法在玻碳电极表面沉积纳米金/石墨烯/氯化高铁血红素复合材料，利用氯化高铁血红素对硝基化过程进行催化，结合纳米金和石墨烯纳米复合物导电能力强，比表面积大，电催化活性高等特点，可实现对牛血清白蛋白硝基化的灵敏快速检测。该电化学传感器可以对吸附在修饰电极表面的牛血清白蛋白的硝基化过程进行原位催化和快速检测，方法响应速度快、灵敏度高，传感器制备过程简单，可用于血清中蛋白质硝基化损伤的检测分析，具有心血管等疾病临床诊断的应用价值。
下面结合具体实施例对本发明作以下进一步说明：
实施例1：
一种可用于牛血清白蛋白硝基化损伤检测分析的电化学传感器，具体的制备步骤包括：
(1)纳米金/氧化石墨烯/氯化高铁血红素复合电沉积液的制备：
首先配制10g/mLHAuCl4储备液：将1gHAuCl4溶解于100mL去离子水中，震荡摇匀，并于2-8℃保存，使用前稀释；配制0.5mg/mL氧化石墨烯(GO)溶液：取Hummer法制备的10mg/mLGO0.5mL与9.5mL去离子水混合，超声30min；配制0.5mg/mL氯化高铁血红素(hemin)溶液：称取0.05mghemin与10mL无水乙醇混合，加入5μL氨水超声30min溶解，并于2-8℃保存。其次，将上述配制的HAuCl4溶液、GO溶液和hemin溶液按5:5:1的比例混合，得到电沉积液。
(2)纳米金/石墨烯/氯化高铁血红素复合材料修饰电极的制备：
a.玻碳电极的预处理：先用Al2O3抛光粉对电极进行打磨，经水冲洗后，再用电流-时间曲线技术对裸玻碳电极在0.1MpH7.0的磷酸盐缓冲液(PBS)进行活化，活化电位2.0V，活化时间200s。
b.纳米金/石墨烯/氯化高铁血红素复合材料的一步电沉积：利用循环伏安技术，将玻碳电极在步骤(1)所述的电沉积液中进行原位沉积，扫描电位范围为-1.5～0.6V，扫速为0.025V/s，扫描圈数为20圈，制备得到纳米金/石墨烯/氯化高铁血红素复合材料修饰的玻碳电极。
所述的参比电极为饱和甘汞电极，所述的对电极为铂丝电极。
实施例2：
一种可用于牛血清白蛋白硝基化损伤检测分析的电化学传感器，具体的制备步骤包括：
(1)纳米金/氧化石墨烯/氯化高铁血红素复合电沉积液的制备：其制备步骤同实施例1中纳米金/氧化石墨烯/氯化高铁血红素复合电沉积液的制备方法，不同之处为：HAuCl4溶液、GO溶液和hemin溶液按5:1:5的比例混合，得到电沉积液。
(2)纳米金/石墨烯/氯化高铁血红素复合材料修饰电极的制备：制备步骤同实施例1中纳米金/石墨烯/氯化高铁血红素复合材料修饰电极的制备步骤。
实施例3：
一种可用于牛血清白蛋白硝基化损伤检测分析的电化学传感器，具体的制备步骤包括：
(1)纳米金/氧化石墨烯/氯化高铁血红素复合电沉积液的制备：制备步骤同实施例2中纳米金/氧化石墨烯/氯化高铁血红素复合电沉积液的制备方法，不同之处为：HAuCl4溶液、GO溶液和hemin溶液按5:2:5的比例混合，得到电沉积液。
(2)纳米金/石墨烯/氯化高铁血红素复合材料修饰电极的制备：制备步骤同实施例2中纳米金/石墨烯/氯化高铁血红素复合材料修饰电极的制备步骤。
实施例4：
基于纳米金/石墨烯/氯化高铁血红素复合材料的电化学传感器在牛血清白蛋白硝基化检测中的应用。
实施例3制备的一种基于纳米金/石墨烯/氯化高铁血红素复合材料的电化学传感器应用于牛血清白蛋白硝基化检测，具体步骤为：
(1)配制10μg/mL牛血清白蛋白溶液：称取1mg牛血清白蛋白与1mLpH7.4的PBS混合均匀作为储备液，并于4℃保存，使用前稀释到10-3μg/mL，然后在4℃条件下，将实施例3制备的纳米金/石墨烯/氯化高铁血红素复合材料修饰电极浸泡在10-3μg/mL的BSA溶液中6小时，用去离子水冲洗备用，得到电化学生物传感器
(2)在37℃恒温条件下，将上述电化学生物传感器置于0.1MpH7.4的PBS中，孵化5分钟，在hemin作用下催化BSA的硝基化，采集差分脉冲伏安曲线，扫描电位范围：0.1-0.6V。
(3)在PBS中加入不同比例NaNO2(5.0mM)和H2O2(5.0mM)溶液(5μL、10μL、20μL、40μL、80μL、100μL)，37℃恒温条件下孵化5分钟，分别采集差分脉冲伏安曲线，扫描电位范围：0.1-0.6V。所得检测结果良好，峰电流下降程度与硝基化牛血清白蛋白在1.0×10-7～1.0×10-5mol/L浓度范围内呈现良好的线性关系，方法检出限为3.0×10-8M(3S/N)。
本发明并不受上述实施方式的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种可用于牛血清白蛋白硝基化损伤检测分析的电化学传感器，包括工作电极、参比电极和辅助电极构成的三电极体系，其特征在于：所述工作电极为玻碳基底表面电沉积有纳米金/石墨烯/氯化高铁血红素复合材料修饰的玻碳电极。
2.一种如权利要求1所述的可用于牛血清白蛋白硝基化损伤检测分析的电化学传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)纳米金/氧化石墨烯/氯化高铁血红素复合电沉积液的制备：
a.首先配制HAuCl4储备液：将HAuCl4溶解于去离子水中，震荡摇匀，并于2-8℃保存，使用前稀释；
b.再配制氧化石墨烯GO溶液：取Hummer法制备的氧化石墨烯GO与去离子水混合，超声30min；
c.配制氯化高铁血红素hemin溶液：称取氯化高铁血红素hemin与无水乙醇混合，加入氨水超声30min溶解，并于2-8℃保存；
d.将上述配制的HAuCl4溶液、GO溶液和hemin溶液按5:1-2:5的比例混合，得到电沉积液；
2)纳米金/石墨烯/氯化高铁血红素复合材料修饰电极的制备：
a.玻碳电极的预处理：先用Al2O3抛光粉对电极进行打磨，经水冲洗后，再用电流-时间曲线技术对玻碳电极在0.1M pH7.0的磷酸盐缓冲液PBS进行活化，活化电位2.0V，活化时间200s；
b.纳米金/石墨烯/氯化高铁血红素复合材料的一步电沉积：利用循环伏安技术，将玻碳电极在步骤1)所得的电沉积液中进行原位沉积，扫描电位范围为-1.5-0.6V，扫速为0.025V/s，扫描圈数为20圈，即制备得到纳米金/石墨烯/氯化高铁血红素复合材料修饰的玻碳电极。
3.如权利要求2所述的制备方法制备的电化学传感器应用于牛血清白蛋白的硝基化损伤检测分析。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，检测条件为：
测定介质：0.1M pH7.4的磷酸盐缓冲溶液
测定温度：37℃
测定方法：差分脉冲伏安法
扫描电位范围：0.1-0.6V。
5.采用权利要求2所述的制备方法制备的电化学传感器对牛血清白蛋白硝基化损伤检测的方法，包括如下步骤：
1)首先配制牛血清白蛋白溶液：称取牛血清白蛋白与pH7.4的PBS混合均匀作为储备液，并于4℃保存，使用前稀释到10-3μg/mL，然后在4℃条件下，将纳米金/石墨烯/氯化高铁血红素复合材料修饰电极浸泡在10-3μg/mL的BSA溶液中6小时，用去离子水冲洗备用，得到电化学生物传感器；
2)在37℃恒温条件下，将步骤1)所得的电化学生物传感器置于pH7.4的PBS中，孵化5分钟，在hemin作用下催化BSA的硝基化，采集差分脉冲伏安曲线，扫描电位范围为0.1-0.6V；
3)在PBS中加入不同比例NaNO2和H2O2溶液，37℃恒温条件下孵化5分钟，分别采集差分脉冲伏安曲线，扫描电位范围为0.1-0.6V，即实现对牛血清白蛋白硝基化的检测。
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